柚苷酶高產菌株選育及其產酶在蜜橘果汁脫苦中的應用

夏辛珂，張媛娥，雷生姣*，胡彪，陳鈺亭，付彩霞,2

1(三峽大學 生物與制藥學院，湖北 宜昌，443002)2(湖北土老憨生態農業科技股份有限公司，湖北 宜昌，443000)

柚皮苷(4,5,7-trihydroxy-flavanone7-rhamnoglucoside)是一種天然存在于柑橘中的類黃酮物質[1]，柑橘加工過程中因柚皮苷產生苦味是制約柑橘加工業發展的主要問題之一[2]。相比膜技術、吸附法、超臨界CO2脫苦等方法[3-4]，酶法脫苦不僅效果好、無污染、工藝簡單、反應條件溫和，而且能增強果汁風味、保存果汁營養成分[5]。

柚苷酶(EC 3.2.1.40)具有2種糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶)活性[6]，它先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下將柚皮苷水解為普魯寧(柚皮苷苦味的三分之一)和鼠李糖，普魯寧在β-D-葡萄糖苷酶的作用下水解為柚皮素(無苦味)和葡萄糖，從而實現脫苦[7]。除此之外，柚苷酶還具有提高果汁質量，增強蘆筍汁抗氧化活性，水解糖苷、皂苷，增強葡萄酒香氣，轉化類固醇、抗生素等功能[8-11]。

柚苷酶廣泛存在于自然界中[12]，但微生物來源的酶遠比動植物來源的更有利[13]，絲狀真菌是柚苷酶的主要生產菌株[14]。然而，由于缺乏安全性、穩定性好、產酶活力高的產酶菌株，柚苷酶在我國工業生產中至今沒有得到廣泛應用。因此選育適合工業化生產的柚苷酶高產優良菌株至關重要。

本研究從腐爛的柚子皮中篩選得到1株產柚苷酶的塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)，采用紫外(ultraviolet irradiation,UV)與常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma,ARTP)復合誘變技術，旨在獲得1株柚苷酶高產突變株，并探究其酶解條件。同時，將突變株發酵粗酶液脫苦宜昌蜜橘果汁，并對脫苦前后果汁的理化性質進行鑒定，探究該突變株產酶在果汁脫苦中的應用效果，為柑橘工業化生產和應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

產柚苷酶菌株，從霉變的柚子皮上分離純化獲得。

1.2 試劑與培養基

本研究使用的所有化學試劑，均購自中國國藥集團化學試劑有限公司。

產柚苷酶菌株篩選培養基(g/L)：柚皮粉 10.0，MgSO4·7H2O 5.0，K2HPO45.0，KCl 5.0，FeSO4·5H2O 0.1，瓊脂粉 10.0，pH值自然；

固體培養基(g/L)：MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO41.0，(NH4)2SO41.5，KCl 0.5，KNO31.5，CaCl20.1，酵母提取物 2.0，柚皮苷 2.5，瓊脂粉 10.0，pH值自然；

發酵培養基(g/L)：MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.5，K2HPO41.5，(NH4)2SO44.0，ZnSO4·7H2O 0.1，CaCl20.1，酵母提取物1.0，豆粉2.0，蛋白胨2.0，柚皮苷10.0，pH值自然，接種量為10%[15]。

1.3 儀器與設備

ARTP誘變育種儀，思清源生物科技有限公司；ZW0615062604紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；Waters 2489液相色譜儀，美國Waters公司。

1.4 產柚苷酶菌株的篩選

柚子皮置于陰暗潮濕的環境中3～5 d，取下一塊發霉的柚子皮，于無菌生理鹽水(質量分數為0.85% NaCl溶液)中180 r/min，30 ℃振蕩30 min，取菌懸液梯度稀釋后涂布于產柚苷酶菌株篩選培養基，30 ℃恒溫培養3～5 d。待菌落長出后分離純化，直至得到純種單菌落。

1.5 孢子懸浮液的制備

用無菌生理鹽水洗下斜面孢子，裝入含有無菌玻璃珠的三角瓶中，150 r/min室溫振蕩20 min，無菌脫脂棉過濾，即可得到均勻分散的孢子懸液。用血球計數板在電子顯微鏡下計數，調整孢子懸液為所需濃度。

1.6 生長曲線的測定

將孢子懸液(107個/mL)接種于發酵培養基中，在30 ℃、180 r/min的條件下培養。每12 h取發酵液5 mL，5 000 r/min離心20 min，棄上清液。沉淀用蒸餾水反復沖洗過濾至濾液澄清，于烘箱中烘至恒重，冷卻稱重。

1.7 酶活的測定

參照DAVIS[16]的方法。發酵液離心后上清液即為待測酶液，向具塞試管中分別加入0.6 mL柚皮苷標液(500 μg/mL)、0.3 mL醋酸緩沖溶液(0.2 mol/L pH 4.0)和0.1 mL待測酶液，60 ℃ 150 r/min振蕩30 min，沸水浴滅活。向滅活后的酶解液中加入4.9 mL 90%(體積分數)的一縮二乙二醇溶液和4 mL蒸餾水，40 ℃水浴鍋中預熱5 min，再加入0.1 mL NaOH(4 mol/L)溶液，搖勻，40 ℃水浴10 min，用分光光度計于420 nm處測吸光值。空白用醋酸緩沖溶液代替待測酶液，酶活平行測定3組，計算如公式(1)所示：

(1)

酶活力定義為：在60 ℃，pH 4.0條件下，1 min鐘消耗1 μg柚皮苷所需的酶量為1個酶活力單位，以U計。

1.8 復合誘變

1.8.1 紫外誘變

將裝有孢子懸液(107個/mL)的培養皿放在攪拌器上，將滅菌的轉子放入皿中，照射距離為30 cm，照射功率15 W，時間梯度依次為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 min。照射后，將菌懸液于4 ℃低溫保存2 h，防止其自身修復[17]。取100 μL低溫保存的菌懸液涂布，30 ℃靜置培養3 d，待長出單菌落后計數，計算誘變致死率，繪制致死曲線，致死率計算如公式(2)所示：

(2)

1.8.2 ARTP誘變

取1 mL經紫外誘變的孢子懸浮液，加入60%(體積分數)甘油84 μL，充分混勻。取10 μL混勻后的孢子懸液均勻涂在已灼燒滅菌冷卻的金屬載片上，誘變工作氣體為氦氣，溫度為20 ℃，誘變功率為120 W，氣流量為10 L/min，處理距離為2 mm。孢子懸液分別處理0、1、2、3、4、5、6、7、8 min，然后將金屬載片放入裝有1 mL無菌生理鹽水的離心管中，振蕩1 min。取誘變后的菌懸液100 μL涂布于固體平板培養基中，30 ℃靜置培養3 d，待長出單菌落后并計數，計算誘變致死率，繪制致死曲線。

1.9 誘變菌株的篩選

1.9.1 誘變菌株的初篩

待平板中菌落長出后，觀察菌落周圍是否有透明水解圈的產生，根據HC值初步判斷誘變菌株產酶活力的大小，HC值計算如公式(3)所示:

(3)

1.9.2 誘變菌株的復篩

將初篩挑選出的菌株接種于發酵培養基中，30 ℃，180 r/min搖瓶培養，每隔12 h測定酶活，驗證其搖瓶發酵產酶活力大小，保留產酶活力較原始菌株有所提升的突變株。

1.9.3 遺傳穩定性檢測

將得到的具有較高酶活的突變株傳代5次，測其酶活，檢測其遺傳穩定性。

1.10 柚苷酶酶解條件探究

1.10.1 溫度對酶解條件影響

將誘變得到的最佳突變株發酵液離心，取上清液為粗酶液。取5組試管，分別在30、40、50、60、70 ℃條件下酶解，其余步驟同1.7。

1.10.2 pH對酶解條件影響

取8組試管，分別在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下酶解，其余步驟同1.7。

1.11 突變株發酵產酶脫苦果汁應用

1.11.1 果汁脫苦

采摘的宜昌蜜橘榨汁后，經4層紗布過濾，濾液于5 000 r/min離心15 min，上清液即為待測果汁。突變株發酵72 h后于5 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。取10組具塞試管，每組3支平行，分別向其中加入0.5 mL待測果汁、0.4 mL醋酸緩沖溶液(0.2 mol/L、pH 5.0)和0.1 mL粗酶液，50 ℃ 150 r/min振蕩30 min。每隔15 min取出一組試管沸水浴滅火10 min。剩余柚皮苷含量檢測采用1.7中的方法。

酶解前后的果汁分別用高相液相色譜分析，驗證其柚皮苷剩余量。果汁過 0.45 μm 有機濾膜，采用SunFire C18色譜柱((4.6×250) mm，5.0 μm)，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，流速1 mL/min，檢測波長286 nm，梯度洗脫程序為：0～1 min，25%～30%A；1～6 min，30%A；6～7 min，30%～35%A；7～12 min，35%A；12～13 min，35%～40%A；13～18 min，40%A；18～19 min，40%～45%A；19～24 min，45%A；24～26 min，45%～58%A；26～50 min，58%A。

1.11.2 果汁理化指標檢測

對酶解前后的果汁理化指標進行測定。可溶性固形物采用折射儀測定(NYT 2637—2014)，可溶性糖含量采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定(NYT 2742—2015)，根據GB/T 12456—2008測定總酸含量。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

從發霉的柚子皮上篩選到1株產柚苷酶菌株，菌落形態如圖1所示。該菌菌落呈棉絮狀，初生時為白色，后逐漸為褐色至黑褐色，有時會有液滴產生，菌落反面呈淡黃色。分生孢子梗發生于基質，無色透明，壁平滑，分生孢子頭為近球形，呈輻射狀，呈黑褐色。

a-菌落正面形態；b-菌落背面形態；c-顯微鏡下菌絲體形態；d-顯微鏡下孢子形態

通過對此菌株的 ITS 序列進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增，獲得了大約 750 bp 的拼接序列。將其在 NCBI 中 BLAST 同源性比對后，構建確定其分類地位的系統發育樹(圖2)，可知此菌與塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)的同源性達 100%，由此將其歸為塔賓曲霉(Genbank 登錄號:MN589840)，屬子囊菌門，散囊菌綱，散囊菌目，曲霉科，曲霉屬。

圖2 基于 ITS 序列構建的菌株系統發育樹

2.2 生長曲線測定

根據塔賓曲霉MN589840生長曲線(圖3)可知，培養時間24 h時，菌體質量明顯增高，此階段為菌體的對數生長期，而酶活較低，僅為1.78 U/mL，可能是因為此時菌體處于大量繁殖階段，產酶量很少。隨著培養時間延長，酶活逐漸增高，于96 h時達到最高，酶活為13.48 U/mL。當培養時間>96 h時，酶活開始下降，菌體質量也顯著下降，可能是因為培養基中的營養物質已經消耗殆盡，有害代謝物質不斷增加，其生長環境已經不再適合菌體的生長繁殖及產酶。

圖3 塔賓曲霉 MN589840的生物量及產酶活力隨時間變化曲線

2.3 誘變菌株選育

2.3.1 紫外誘變致死曲線

所有的生物細胞都富含核酸和蛋白質等紫外線吸收劑，DNA是紫外線誘導損傷的關鍵靶點之一。紫外輻射造成的DNA損傷主要是環丁烷-嘧啶二聚體(cyclobutane pyrimidine dimer，CPDs)和6-4光產物(6-4 photoproducts,6-4 PPs)。CPDs的含量最豐富且具細胞毒性，而6-4 PPs具有潛在的致命性[18]。由圖4可知，隨著誘變的時間增加，菌株的致死率升高。研究表明，紫外誘變致死率達到 80%～90% 時，產生正突變的概率較高[19]。為了便于后期實驗，處理時間240 s為最佳誘變時間。

2.3.2 ARTP誘變致死曲線

ARTP產生的多種均勻分布的高活性粒子作用于DNA鏈，迫使細胞啟動高容錯水平的SOS修復機制，在修復過程中產生多種失配位點，造成基因突變。ARTP接近室溫，可以避免微生物因高溫造成熱損傷，且操作過程無毒性和有害物質參與，在生物誘變育種中具有廣闊的應用前景[20-21]。

由圖4可知，ARTP誘變時間與塔賓曲霉的致死率存在著顯著的劑量效應關系。低劑量時，菌株細胞受到大量的活性粒子注入，致死率急劇上升。隨著誘變時間增加，細胞修復機制和修復酶被激活，單位時間內細胞的致死率降低。繼續加大劑量，細胞損傷無法恢復，致死率再次急劇上升。研究表明，這種現象稱為雙鞍延遲規律，與微生物的修復機制有關，是傳統誘變不具備的特點[22]。為了方便后期篩選，本實驗選擇致死率達98%，處理時間300 s為最佳誘變時間。

圖4 UV誘變和ARTP誘變對塔賓曲霉的致死曲線

2.3.3 紫外-ARTP復合誘變

微生物誘變育種作為最實用、有效的育種策略之一而被廣泛應用[23]。國內外關于產柚苷酶菌株誘變育種的報道并不多見。李耀等[24]將黑曲霉M53經紫外-LiCl復合誘變，選育出1株產柚苷酶突變株 M53-7，其酶活較原始菌株提高了42.77%。朱運平等[19]以米曲霉 11250為出發菌株，采用紫外-NaNO2復合誘變選育出1株產柚苷酶突變菌株 UN2，其發酵酶活是原始菌株的2.3倍。ARTP作為一種新型誘變工具，具有設備簡單、操作方便、安全、高效、環境友好等特點[25]。至今，仍沒有ARTP與傳統誘變相結合，誘變產柚苷酶菌株的報道。復合誘變由于包含多種誘變方式，可以產生多種突變類型，避免因單一誘變產生的誘變飽和效應[26]。本研究將塔賓曲霉 MN589840經紫外-ARTP復合誘變，最終得到6株突變株。由表1可知，突變株 UA13酶活最高，是原始菌株的3.06倍。

表1 紫外-ARTP 復合誘變結果

2.4 遺傳穩定性檢測

將突變株UA13連續傳代5次(表2)具有較好的遺傳穩定性。

表2 突變株UA13遺傳穩定性檢測

2.5 柚苷酶酶解條件探究

2.5.1 溫度對酶解作用的影響

溫度對酶活的影響主要分為2個階段。當溫度升高時，反應速度加快，酶活升高；當溫度持續升高，超過柚苷酶的熱穩定性范圍，酶原有結構遭到破壞，使其活力降低。如圖5所示，酶解溫度在30～40 ℃時，酶活逐步增大；40～50 ℃具有較好酶活，50 ℃時酶活最高；當酶解溫度>50 ℃時，酶活迅速降低，溫度達到70 ℃，酶活幾乎完全喪失。此試驗表明，該柚苷酶最適酶解溫度為40～50 ℃。酶解溫度過低，不能完全激活酶活，柚苷酶無法完全達到其活力；而溫度過高，會使酶蛋白變性，喪失其活力。

圖5 溫度對酶解作用的影響

2.5.2 pH對酶解作用的影響

pH對酶活的影響主要存在2個方面。(1)pH對酶的穩定性有一定影響。若反應體系的pH使酶產生不穩定性，則會影響到酶解反應。(2)酶對底物柚皮苷具有最適pH范圍。當pH處于該范圍內，酶對底物可以發揮最大作用。如圖6所示，柚苷酶活力隨pH的增加呈現先增加后降低的趨勢。當pH在3.0～5.0時，酶活隨著pH的增大而增大；pH為5.0時，酶活處于峰值；pH>5.0后，反應體系pH不利于酶解，酶活迅速下降。

圖6 pH對酶解作用的影響

2.6 突變株發酵產酶脫苦蜜橘果汁

果汁中柚皮苷含量隨水解時間變化如圖7所示。柚皮苷苦閾值(人們能感覺到苦味的最低質量濃度)約為30 μg/mL[27]，當酶解約50 min時，果汁中柚皮苷含量低于苦閾值；當酶解時間>75 min時，果汁中僅剩下少量柚皮苷。與圖8-b對比，圖8-c中的柚皮苷大量降低。因此，突變株UA13能夠產生柚苷酶且該酶具有高效水解果汁中柚皮苷的能力。

圖7 柚皮苷含量隨酶解時間的變化情況

a-柚皮苷標品;b-脫苦前柚皮苷含量色譜圖;c-脫苦后柚皮苷含量色譜圖

2.7 果汁脫苦理化指標鑒定

蜜橘果汁經粗酶液脫苦后理化指標變化結果如表3所示。可溶性固形物、蔗糖和總酸含量均有下降。

酶解時，加熱過程會使果汁總酸、總糖及可溶性固形物含量降低。果汁中，含有可揮發性酸，加熱促使其揮發，致使含量降低。而果汁中含有多種淀粉、纖維素等大分子糖類，在加熱過程中加速運動，使其相互碰撞進而沉淀，導致總糖含量降低。果汁中含有大量的果膠等大分子顆粒物質。據報道，柚苷酶中的α-L-鼠李糖苷酶主要作用于末端鼠李糖鍵，可將果膠的α-(1，4)鼠李糖苷鍵水解，從而引起總糖含量減少[28]。

固酸比(可溶性固形物和總酸之比)和糖酸比(總糖和總酸含量之比)是判斷果汁風味的重要指標。脫苦過程雖然會降低果汁中可溶性固形物、總糖和總酸含量，但其固酸比和糖酸比均有提高。因此，該酶具有提高果汁風味的能力。

表3 宜昌蜜橘脫苦前后理化指標的測定

3 結論

本研究從腐爛的柚子皮上篩選出1株產柚苷酶菌株，經鑒定為塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)MN589840，其搖瓶發酵酶活為13.475 U/mL。經紫外-ARTP復合誘變，最終得到1株柚苷酶高產突變株 UA13，其搖瓶發酵酶活可達41.524 U/mL，是原始菌株的3.06倍。連續傳代5次后，具有遺傳穩定性。對突變株UA13產酶酶解條件進行探究得知，該酶酶解最適溫度為40～50 ℃，最適pH值為5.0。用突變株UA13發酵粗酶液脫苦宜昌蜜橘果汁，結果顯示，該酶能有效水解果汁中的柚皮苷，且具有一定提高果汁品質的能力。因此，該菌具有潛在的工業應用價值，可為后期實驗研究奠定基礎。