沙棘果油脂肪酸與微量元素測定

魏晉梅，劉彩云,2*，方彥，堅乃丹

1(甘肅農業大學，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州， 730070)2(甘肅省科學院生物研究所，甘肅 蘭州， 730000)

沙棘是一種重要的生態和經濟作物，胡頹子科沙棘屬，生命力頑強，可生長于極寒、極旱的環境中，其果實呈紅色、橙色或黃色，富含酚類、黃酮類、有機酸、多糖等生物活性物質和人體所需的各種營養物質，如維生素、不飽和脂肪酸、氨基酸、微量元素等[1-4]，具有抗氧化、延緩衰老、抑制腫瘤細胞生長、止咳祛痰、抗輻射、活血散瘀、防治冠狀動脈粥樣硬化等作用[5-8]。沙棘果實、葉子提取物和籽油廣泛應用于食品、保健、醫藥和化妝品行業[9]。沙棘油有“液體黃金”之美譽，被我國批準臨床使用，并于1977年正式列入藥典，俄羅斯宇航員用沙棘油防止有害輻射[10]。沙棘油含有多種人體需要的微量元素，如Na、Ca、K、Mg、Fe、Zn等，無機成分對于沙棘油的營養性、安全性和穩定性均起著極其重要的作用[11]，其進入沙棘油的途徑主要是果實對自然環境無機元素的吸收與富集、加工過程中金屬的接觸及污染等[12]。

目前，文獻報道對沙棘的研究多集中于其葉子提取物[13-14]。油脂是生活中不可缺少的食物之一，沙棘油中脂肪酸與微量元素的測定已有文獻報道，但對脂肪酸含量的測定僅限于百分比含量[15-17]，目前，尚未見文獻報道其絕對含量。本文基于氣相色譜-質譜聯用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)測定沙棘果油中脂肪酸組成，應用內標方法計算各成分的含量；采用電感耦合等離子體原子發射光譜法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-AES)測定微量元素，旨在建立沙棘果油脂肪酸和微量元素的準確測定方法，為沙棘的進一步開發利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

沙棘果購自寧夏回族自治區吳中市，經亞臨界流體萃取而得沙棘果油。

1.2 儀器與試劑

CBE-20L亞臨界雙溶劑萃取實驗室成套設備，河南省亞臨界生物技術有限公司；Agilent 7890B-7000GC/TQ GC-MS，美國Agilent公司；IRIS IntrepidⅡ XSP電感耦合等離子體發射光譜儀，泵管類型為Tygon-Orange，美國Thermo公司；ETHOS UP微波消解萃取系統，VB24 UP電子控溫趕酸器，美國Lab Tech公司；RE-52C 旋轉蒸發儀，鄭州市亞榮儀器有限公司；超純水處理系統，美國Millipore公司；氬氣、氦氣(純度：99.999%)；37 種脂肪酸甲酯混合標準對照品與十一烷酸(99.98%)，購自美國 SUPELCO 公司；K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn標準溶液(質量濃度均為100 μg/mL)，中國計量科學研究院；正己烷(色譜純)、HNO3、高氯酸、HCl(優級純),德國Merck公司；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 沙棘油制備

亞臨界流體萃取沙棘果油工藝：

沙棘干燥→粉碎→過篩→裝料→抽真空→加入溶劑→萃取→脫溶→回收樣品

萃取工藝參數：提取溶劑為正丁烷，料液比為1∶3，萃取溫度45 ℃，萃取時間30 min，萃取次數3次。參照文獻方法[18-19]計算亞臨界流體萃取沙棘果油的萃取率,如公式(1)所示：

(1)

1.3.2 標準溶液配制

準確稱取2.5 g十一烷酸(精確到0.01 g)，甲醇溶解，定容至500 mL容量瓶中，制成質量濃度為5 mg/mL內標儲備液。取2.5 mL標準儲備液，甲醇稀釋，定容至100 mL容量瓶中，制成質量濃度為0.125 mg/mL的內標工作液。

分別取K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn單元素標準溶液，加入空白樣品溶液，配制成系列標準工作液，K的質量濃度為0.25、0.5、2、10、20 μg/mL，Na為1、2、5、10、20 μg/mL，Cu為0.005、0.1、5、10、50 μg/mL，Zn為0.5、0.1、2、10、50 μg/mL，Ca為0.5、1、5、10、50 μg/mL、Mg為0.25、1、5、10、50 μg/mL，Fe為0.1、0.5、2、5、10 μg/mL、Mn為0.005、0.05、1、5、10 μg/mL。

1.3.3 脂肪酸甲酯制備

參照中華人民共和國國家標準GB 5009.168—2016方法[20]，并稍作修改。稱取試樣1.0 g(精確到0.01 g)于50 mL燒瓶中，加入5 mL內標工作液、8 mL 2% 氫氧化鈉-甲醇溶液與5 mL 14% 三氟化硼-甲醇溶液，(80±1) ℃水浴回流60 min，取下燒瓶，迅速冷卻至室溫，轉移樣品至離心管，用3 mL正己烷洗滌燒瓶2次，合并溶液于離心管中，旋渦振蕩，充分混勻后5 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.22 μm有機相過濾膜過濾，進GC-MS測定。

1.3.4 微量元素提取

參照袁建民等[21]方法，并稍做修改。準確稱取0.3 g(精確到0.01 g)沙棘果油于聚四氟乙烯消解罐內，加入8 mL優級純HNO3，放置5～10 min，使樣品與試劑充分混合。微波消解程序：初始溫度室溫，0～15 min升至140 ℃，保持5 min，20～35 min升至190 ℃，保持20 min，55～90 min降至室溫，趕酸后，加入2%(體積分數)優級純HNO3定容至25 mL，進ICP-AES測定。

1.3.5 空白溶液制備

不加試樣，按照1.3.3步驟獲得空白樣品溶液。

1.3.6 儀器工作條件

GC-MS工作條件參照魏晉梅等[22]方法；ICP-AES工作條件 RF發生器功率1 150 W；沖洗泵速120 r/min，2.22 mL/min；分析泵速120 r/min，2.22 mL/min，泵緩沖時間為5 s；輔助器流量0.5 L/min，霧化器壓力28.0 psi。

1.3.7 定性與定量方法

脂肪酸甲酯經Agilent Masshunter數據處理系統檢索，并與標準品比對進行鑒定，內標法定量。微量元素采用外標法定量。

脂肪酸含量計算如公式(2)所示：

(2)

式中:Xi為試樣中脂肪酸i的含量(mg/g)；CSi、ASi、C11和A11分別為37種脂肪酸甲酯混和標準中脂肪酸甲酯i的質量濃度(mg/L)、峰面積與十一烷酸甲酯濃度(mg/L)、峰面積；Ai、AC11、CC11和VC11分別為試樣中脂肪酸甲酯i的峰面積與內標峰面積、質量濃度(mg/mL)、體積(mL)；m為試樣質量(g)。

2 結果與分析

2.1 沙棘果油脂肪酸組成與含量

沙棘果油GC-MS色譜圖見圖1，檢測到的脂肪酸種類和含量如表1所示，19種脂肪酸中飽和脂肪酸(saturated fatty acids，SFA)含量為24.42%，其中C16∶0含量較高(39.71 mg/g)，占92.03%；單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)含量為47.26%，含量較高的為C16∶1和C18∶1，分別為44.29和48.15 mg/g，共占99.75%；多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)含量為28.31%，C18∶2、C18∶3含量較高，均為35.25 mg/g，不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids，USFA)含量是SFA的 3.1倍。結果表明，沙棘果油中含有豐富的棕櫚油酸、油酸、亞油酸和亞麻酸，此結果與文獻報道結果相近。岳虹等[16]在沙棘油中檢測到16種脂肪酸，USFA含量是SFA的4倍(分別為80.09%和19.91%)；張素敏等[23]檢測到沙棘油中有13種脂肪酸，USFA/SFA=2.7(分別69.37%為和26.01%)，青海沙棘果油中USFA/SFA=2.1(分別為66.92%和32.54%)[17]。由表1可知，沙棘果油中n-6與n-3不飽和脂肪酸比率接近1，此結果與文獻[6]報道結果相近。

圖1 沙棘果油脂肪酸甲酯GC-MS總離子流圖

表1 沙棘果油中脂肪酸種類和含量

2.2 溶解酸與用量的選擇

處理樣品時，酸的加入是對ICP-AES測定產生化學干擾的主要因素。不同的酸，由于比重、黏度等物理性質各不相同，它們進入ICP炬焰后，蒸發速率不一致，從而在分析過程中帶來化學干擾。根據酸效應的干擾順序HCl

表2 酸對樣品處理的影響

2.3 分析譜線的選擇

測定中發現各元素都有不同的光譜干擾，根據譜線與級次選取的原則(分析微量元素時，要采用靈敏線)，本實驗選擇的各元素分析線為：K 766.491 nm，Na 588.995 nm，Cu 324.754 nm，Zn 213.856 nm，Ca 393.366 nm，Mg 279.553 nm，Fe 259.940 nm，Mn 257.610 nm。

2.4 標準曲線

基體匹配是減少、消除基體干擾的有效方法，本實驗系列標準工作溶液用空白樣品溶液稀釋配制，并在選定的儀器條件下測定，根據濃度與響應值的關系，儀器自動繪制出標準曲線，得到線性回歸方程和相關系數(表3)，8種元素的相關系數r2為0.999 3～1.000。根據標準工作曲線，求出實際樣品含量值，將得到更準確的測定結果。

表3 8種元素工作曲線

2.5 加標回收與精密度實驗

在已知各元素含量的沙棘油中添加高、中、低3個濃度的標準工作溶液1 mL，每個濃度添加6個樣品，按1.4.2方法進行回收率實驗，結果見表4。各元素的平均回收率為85.0%～94.4%，相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為3.28%～9.23%(RSD<10%)，因此本實驗方法可行，測定結果準確可靠。

表4 方法回收率與精密度實驗

2.6 檢出限

參照呂小園等方法[27]，并稍作修改。按分析方法進行15次空白實驗，以10倍的標準偏差除以標準工作曲線的斜率，計算各元素的檢出限。K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn的檢出限分別為0.006、0.003、0.001 5、0.001 2、0.001 2、0.001 2、0.002 5和0.005 μg/mL。按照稱樣0.3 g定容至25 mL，本實驗方法樣品中K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn的檢出限分別為0.5、0.25、0.125、0.1、0.1、0.1、0.2和0.4 μg/g。

2.7 微量元素測定

運用建立的分析方法測定沙棘油中8種微量元素的含量，重復3次，求平均值，得到樣品中各元素的濃度，計算含量，結果見表5。Na、Ca、K、Mg、Fe、Zn含量較高，與張榮[28]結果相近。本實驗研究結果與文獻報道結果有一定差異，董亞蕾等[11]報道沙棘果汁中含量較高的微量元素依次為 K、Na、Ca、Mg，Fe元素含量范圍是1.8～2.8 mg/L，TSERING等[29]測定了跨喜馬拉雅山的萊赫山谷的沙棘果實中微量元素，K、Ca、Na含量較高，分別為647.2、176.6、414.2 mg/L，Fe和Mg分別為30.9、22.5 mg/L，Zn、Cu、Mn含量較低，分別為1.4、0.7和1.06 mg/L，原因可能是沙棘品種和生長地域環境條件影響了植物對微量元素的吸收與富集。HU等[30]認為Ca在沙棘中的含量為葉>籽>果，說明植物不同部位對微量元素的吸收與富集能力不同。

表5 沙棘油中8中微量元素含量

3 結論

采用內標方法定量了沙棘果油中19種脂肪酸。C16∶0、C16∶1、C18∶1、C18∶2、C18∶3含量較高，分別為39.71、44.29、48.15、35.25和35.25 mg/g，USFA含量是SFA的3.1倍。沙棘果油中含有豐富的油酸、亞油酸和亞麻酸。K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe和Mn的檢出限分別為0.5、0.25、0.125、0.1、0.1、0.1、0.2和0.4 μg/g，各元素的平均回收率為85.0%～94.4%，相對標準偏差為3.28%～9.23%(RSD<10%)。沙棘果油中含有豐富的Na(149.28 μg/g)、Ca(65.29 μg/g)、K(41.08 μg/g)、Mg(21.27 μg/g)、Fe(14.43 μg/g)、Zn(4.71 μg/g)等微量元素。沙棘果油中含有豐富的不飽和脂肪酸與人體所需微量元素，具有很高的營養價值，該研究結果為沙棘的進一步開發利用提供了基礎數據。