鐵基磁共振造影劑的研究現狀與臨床應用展望＊

中山大學藥學院(深圳) (廣東 深圳 518100)

李勝斌# 許戴蕓 呂永輝 李詠霄 王俊卿*

自20世紀以來，有機-金屬配位化學極大地推動了磁共振造影劑(MRCAs)的發展和應用。基于低分子量配位化合物的MRCAs可極大地提高空間和時間分辨率并實現在體內的快速代謝, 是目前臨床MRI檢查中應用最廣泛的造影劑(CAs)類型[1]。理論上多種過渡金屬和鑭系金屬如鉻(Cr)、錳(Mn)、鐵(Fe)、釓(Gd)、鏑(Dy)等都可用于設計MRCAs，但Gd一直以來都被作為順磁性CAs的首選金屬，這是由于釓離子配位化合物具有其獨特的優勢[2]，包括釓(Gd3+)的七個不成對電子產生的高磁矩，f-block元素特有的多齒配位潛力以及一個自由配位點。此外，相對長的電子弛豫時間以及適當的水交換速率使得釓離子能非常好地滿足MRCAs的設計需求。然而，近年來越來越多的研究表明，釓基(Gd3+)配合物造影劑(gadoliniumbased contrast agents，GBCAs)在嚴重腎功能不全的患者中的腎清除率不足會引起腎原性系統性纖維化(nephrogenic systemic fibrosis，NSF)癥狀[3]。其他研究表明重復使用GBCAs會導致其在骨骼、人腦等組織中積聚[4]。滯留在體內的釓離子通過與銅、鋅或鈣等離子的金屬置換作用而增加了副作用的可能性。美國FDA因其潛在的安全性問題，對其臨床應用提出了警告。此外，從環境和經濟角度分析，GBCAs可能引起釓離子在地下水中的沉積[5]，而且釓的可獲取性極其有限，這很大程度上影響了它的價格。

GBCAs的各種潛在問題使重新評估內源性金屬如鐵和錳作為MRCAs具有新的意義。鐵作為一種順磁性金屬，是生物體內一種必需元素，三價鐵有五個未成對電子，也具有較強的弛豫增強效果。早在20世紀80年代就有研究人員首次嘗試通過鐵基配合物增強MRI對比度[6-7]。但由于在當時圖像質量較差且低場強(0.35T)下的鐵的馳豫效能不如釓，因此要達到相同的對比效果需要更高的劑量，而高劑量下的急性耐受性是一個重要的風險因素。而釓的優點在于它的弛豫優勢和在有效劑量下的毒性風險最小。以上因素可能是阻礙鐵基造影劑(ironbased contrast agents，IBCAs)發展的主要原因。

本文基于研究現狀介紹了IBCAs的鐵離子配體的設計原理，根據弛豫理論描述其動力學特征、熱力學穩定性和結構關系等方面的設計要求，綜述了利用體內生物學效應實現更高效率的加速質子弛豫方面所取得的研究進展。最后分析了通過配體設計對調控鐵離子氧化還原活性的重要性，并討論了由這一問題產生的潛在毒性及臨床應用潛力。

1 MRCAs的設計原理

磁共振成像利用核磁共振原理對水質子的馳豫現象，在強磁場中對1H核中的一小部分非零核自旋的能量分裂進行分析并轉化為信號對比。在磁共振斷層掃描儀的靜態磁場中(1.5T或3.0T)，質子的弛豫(自旋從激發態返回到基態過程)由兩個部分組成：縱向馳豫和橫向馳豫，弛豫時間被分別定義為T1和T2。受組織中不同成分(如蛋白、脂肪、骨骼等)含量的影響，不同組織中的水分子具有不同的弛豫時間，這種效應主要是由水分子擾動性(Mobility)的變化引起的。在實際掃描過程中，通過施加外部梯度磁場和空間編碼的射頻激發脈沖可以將記錄的信號進一步轉換為三維圖像，通過調節掃描參數和改變信號權重可獲得T1或T2相關的加權圖像(WI)，即T1WI和T2WI，從而實現醫學診斷。

T1MRCAs的對比效率由其縱向弛豫效能(r1)和濃度[CA]所決定。MRCA水溶液觀察到的縱向順磁弛豫速率(R1=1/ T1)與r1的關系可由式(1)表示[8]。r1以L-1·mM-1·s-1為單位，其值受磁場和溫度影響。

(1)式中，1/T1obs為順磁性物質存在下所觀測到的縱向弛豫速率(R1)；1/T1diam為無順磁性物質存在時體系的弛豫速率；r1為線性關系的斜率，反應了每單位濃度(通常為1mmol/L的CA)引起R1改變的程度，即縱向弛豫效能，它表征MRCA弛豫能力的大小。

根據造影劑作用機理，Bloembergen[9]、Solomon[10]和Lauffer[11]將MRCA與水分子的相互作用劃分為內球層機制和外球層機制(圖1)。內球層的弛豫效應源自水分子與順磁性金屬離子的直接配位作用(即第一配位域，the first coordination sphere)以及配體極性和氫鍵基團參與的間接相互作用(即第二配位域，the second coordination sphere)，見式(2)和(3)。而外球層的弛豫效應主要依賴于順磁性金屬離子與緊密擴散的水分子之間的弱相互作用。一般而言，內球層貢獻了大約60%的弛豫效應。

圖1 影響造影劑T1弛豫效率的因素包括外球層和內球層影響因素，內球層分為第一配位域和第二配位域。

(2)式中，C為常數；q為內層水分子數；μeff為有效磁矩；τC為分子關聯時間；r為金屬與H質子的距離。

(3)式中，τS為電子關聯時間；τM為質子滯留時間；τR為旋轉相關時間。

(2)式中的τC取決于(3)式中的τS、τM和τR，并且(2)式僅在τM≈10ns時有效。需要注意的是，水分子在第一配位域中的滯留時間過長會降低弛豫速率(relaxation rates)[12-14]。研究發現配體分子中帶有極性氫鍵位點的基團(如烷氧基)會延長第二配位域中質子滯留時間(τM)，從而延長水分子的滯留時間(俘獲效應，trapping effect)。因此，在配體分子中引入親脂性(如苯基)基團可有效排斥水分子并通過增強水分子的直接配位作用來提高弛豫效能(r1)[15]。此外，配體化合物的帶電性與溶解度和滲透壓有關，一般在影響滲透壓不很大的前提下，可以接受較小的負電荷或正電荷。另一方面，MRCAs與生物大分子的相互作用可延長其旋轉相關時間(τR)。因此，通過引入對生物大分子(如血清白蛋白)具有高親和力的配體可有效實現受體誘導的磁化增強效應(receptor-induced magnetization enhancement，RIME)[16]。親脂性MRCAs更傾向于肝臟的聚集，而一般認為的MRCAs為血池造影劑，通常具有足夠的親水性和分子量以延長在血管內的停留時間。如需將MRCAs靶向淋巴系統或跨越血腦屏障，需要考慮其配體結構因素、靶向基團和復合物的凈電荷。

2 鐵基造影劑的設計策略和最新研究進展

2.1 鐵離子的馳豫特性 鐵作為一種d-block金屬，其具有不成對電子排布和氧化還原作用以及重要的生物化學活性。Fe3+與弱場配體(weak-field ligands)配位可形成高自旋的d5八面體配合物。這些不成對電子促進了靠近金屬中心的質子弛豫過程。研究發現，經典GBCAs的馳豫效能在低場強下(＜1.5T)能發揮最佳對比效果[17]，因此相對于GBCAs，IBCAs的馳豫效能不具有優勢。然而，高場強磁共振成像系統目前在全世界變得更加普遍。依賴于τR的GBCAs在高場下的馳豫效能可能顯著下降。相比之下，鐵離子配合物的行為往往更能適應高場成像[11]。

圖2 用于磁共振成像的鐵基配合物和經典的釓基配合物結構。注：(a)：MGD-3-FCAT(3.5mg，12.1μmol)，FAC(4.0μmol)，TFA(2.0μmol)，PBS(1.0mL)，R1=2.119s-1；(b)：MGD-3-FCAT(1.2mg，4.1μmol)，FAC(4.0μmol)，TFA(2.0μmol)，PBS(1.0mL)β-gal(E801A，10units)；(c)：MGD-3-FCAT(2.4mg，8.3μmol)，FAC(4.0μmol)，TFA (2.0μmol)，PBS(1.0mL)，β-gal(E801A，10units)；(d)：MGD-3-FCAT(3.5mg，12.1μmol)，FAC(4.0μmol)，TFA(2.0μmol)，PBS(1.0mL)，β-gal(E801A，10units)。

2.2 增強IBCAs馳豫效能的設計策略 造影劑研究的目標之一是提高造影劑的馳豫效能并進一步降低所需的劑量，從而產生足夠的對比度來實現醫學診斷。根據造影劑設計的理論，順磁性金屬配合物產生的水質子弛豫增強作用可分解為三部分：內球層貢獻、外球層貢獻和水交換貢獻(圖1)。因此，如何提高這些貢獻是實際設計中主要的努力目標。根據 Solomon-Bloembergen-Mogan方程[11]，為提高內球層貢獻,，應從以下幾方面著手：(1)選擇有效磁矩μeff大的順磁中心；(2)在保證配合物有足夠穩定性的前提下, 增多配位水分子數目(q)；(3)縮短配位水分子與順磁中心的距離(M-H距離)，以獲得最有效和快速的弛豫；(4)在滿足質子完全弛豫的前提下，提高配位水分子的交換速率(1/τM); (5)延長配合物旋轉相關時間τR, 這可以通過將順磁中心與生物大分子或聚合物偶聯來實現[18]。

由于鐵具有的顯著氧化還原活性使得水分子的直接配位在大多數情況中是不利的。因此，IBCAs通常被設計為飽和配合物，此類配合物具有極高的穩定性，Davies等[19]已對這些研究進行了深入討論。此外，Schwert等[20]發表了關于3,5-二取代磺酰胺兒茶酚配體的鐵(Fe3+)配合物[Fe(DSC-L)3]3-的研究(圖2)。Davies等[19]初步制備的[Fe(tironate)3]9-配合物具有較高的弛豫效能(r1=3mmol-1·s-1)，但表現出較高的毒性。Schwert等[20]通過將tironate轉化為其磺酰胺衍生物降低了其生物毒性，但這也導致它們在水中的馳豫效能被限制在2mmol-1·s-1，雖然血漿馳豫效能是水中的兩倍，但較[Gd(EOB-DTPA)]2-經典造影劑低兩倍(圖2)。

為了將第二配位域的水分子進行活化，同時避免tironate配合物的高毒性，在Lauffer關于以N,N'-乙基雙(2-[2-羥基苯基]甘氨酸)、EHPG作為Fe3+潛在造影劑配體的研究基礎上[21]，Kuznik等[22]篩選了幾個潛在的氫鍵能力較高的配體(圖2)。如苯環上修飾甲氧基([Fe(EHPG-OMe)]-)較未修飾的[Fe(EHPG)]-配合物有更高的馳豫效能，并且在血清中得到進一步提升。這歸因于增強的第二配位域相互作用和配合物與血清白蛋白之間的相互作用延長了配體的旋轉相關時間。Kuznik等[18]還探索了與N,N'-乙基雙(2-[2-羥基苯基]甘氨酸)、EHBG結構相似但更具靈活性的配體(圖2)。這些配合物除了具有熱力學穩定性之外，它們還傾向于鐵的第三氧化態，是這些配合物氧化還原活性的重要影響因素[23]。Kuznik等[18]分別分析了在苯環上帶有極性(例如-NHAc)和氫鍵取代基(-OMe)的EHBG配合物[Fe(EHBG-NHAc)]-和[Fe(EHBG-OMe)]-。酰胺取代基(NHAc)被證明能更有效地吸引水分子，然而，-OMe衍生物在血清中表現出比酰胺衍生物更好的馳豫效能。這再次證明，在第二配位域中配位的水分子數目和配合物較慢的翻滾二者作用的疊加增加了配合物的馳豫效能。

在另一項研究中，Yu等[24]將檸檬酸鐵銨(FAC)和一種酚衍生物在β-半乳糖苷酶作用下形成[Fe(MGD-3-FCAT)3]的飽和配位結構(圖3)，由于在苯酚的苯環上引入了一個19F原子，因此順磁性金屬離子(如Gd3+、Fe3+和Mn2+)可以通過順磁性弛豫增強(PRE)效應縮短19F核的弛豫時間，其中19F核與順磁中心之間的距離對于PRE效應至關重要。根據該報告，觀察到水質子的縱向弛豫速度從FAC的T1=0.33s縮短到0.067s，其中Fe3+的濃度為0.01mmol/L。該結構中的兩個因素可能促進了水分子更有效的相互作用：配體的極性取代基和形成的配合物的大小，其中極性取代基(氨基脲部分和氟原子)激發了H鍵和偶極-偶極相互作用，此外，[Fe(MGD-3-FCAT)3]更緩慢的翻滾可能是相對于FAC的馳豫效能增強的因素之一。通過生物酶促作用活化糖部分釋放水分子的自由配位點來實現馳豫效能的增強是生物響應型IBCAs的一個重要研究方向[25]。

圖3 MGD-3-FCAT與β-半乳糖苷酶的反應及隨后與FAC的反應。

另外的一個例子是，Boehm-Sturm等[26]合成并表征了反式環己烷二胺四乙酸(Fe-tCDTA)和戊烯酸(Fe-DTPA)的Fe3+配合物(圖2)，并與Gd-DTPA進行了對比研究。在相同濃度下，Fe-tCDTA和Fe-DTPA的T1加權圖像上的信號強度增加低于Gd-DTPA(圖2)。然而，在造影劑濃度較高的情況下，它們的T1效應是相當的。在1.5～7T場強下的弛豫值和相關的對比度增強研究表明，Gd-DTPA較Fe-tCDTA和Fe-DTPA分別高約2倍和5倍(圖4)[26]。造成兩種Fe3+配合物之間的差異主要歸因于Fe-DTPA中不存在可交換的配位水分子。隨后，作者觀察了在1.5T場強下異種移植腫瘤小鼠在給藥后3～10min時的靜態T1加權MR圖像(圖5)。發現在Fe-tCDTA和Fe-DTPA的給藥劑量分別為GBCA(0.1mmol/kg)的2倍(0.2mmol/kg)和5倍(0.5mmol/kg)情況下，可以產生大約等同的增強效果，表明這三種螯合物具有相似的藥代動力學和消除特征。在較高的場強下，Fe3+配合物尤其是Fe-tCDTA與Gd-DTPA的成像效應差異略有減小并維持在同一數量級上。與GBCA相比，IBCA的r2值較小，已知GBCA的r2隨著場強的增加而增加[27]，這可能導致GBCA在較高的場強下的弛豫效能有所下降。盡管如此，GBCA仍然可以更好地適應現代較高磁場的MRI斷層成像系統。

圖4 曲線圖顯示了在不同場強下Gd-DTPA、Fe-DTPA和Fe-tCDTA的T1成像效應的濃度依賴性。通過典型的動態對比增強(DCE-MRI)評估在A:1.5T、B:3T和C:7T血清模型的T1加權的信號強度比與CAs的濃度關系。此圖片摘自Radiology,2018,286(2):537-546.

圖5 MR圖像顯示了Fe-DTPA、Fe-tCDTA與Gd-DTPA在7T場強下小鼠體內T1對比度效果和DCE-MRI參數。圖像為10只小鼠中代表性的兩只，上兩排分別為第一天注射Fe-DTPA和第二天注射Gd-DTPA(n=5)，下兩排分別為第一天注射Fe-tCDTA和第二天注射Gd-DTPA(n=5)。A為注射前T2加權圖像，腫瘤由虛線圓圈表示; B為預注入,相同位置的T1加權圖像；C為注射幾分鐘后相同位置T1加權圖像；D為B和C的減影圖像；E是覆蓋在T2加權圖像上的腫瘤的偽彩Ktrans參數圖。此圖片摘自Radiology,2018,286(2):537-546.

綜上所述，水分子直接配位進入金屬中心可能是馳豫效能升高的原因。盡管這種設計將增加鐵配合物氧化還原活性的風險，但從物理化學的角度來看第二配位域是根據外部的流體靜力半徑來確定的[15]，并且水分子與金屬中心在空間上可能直接相互作用，因此第一配位域與第二配位域之間沒有嚴格的邊界。由于[Fe(EDTA)]-配合物可以在其第七個配位點容納水分子，這種情況對于其他結構不太擁擠但特別變形的配合物也是可行的。目前，大多數研究都集中在增加取代基的極性和引入良好的氫鍵以及限制分子的遷移率方面。對于血池造影而言，通常利用RIME效應來增強馳豫效能。例如，Schwert等[20]發現，鐵(Fe3+)配合物[Fe(DSC-L)3]3-和血清蛋白之間的相互作用可能比釓(Gd3+)更有效，鐵(Fe3+)配合物可使馳豫效能增長超過1倍，而釓(Gd3+)配合物僅使馳豫效能提高60%。Fe3+配合物及其衍生物對人血清白蛋白(HSA)親和力的不同會顯著影響馳豫效能的增強效果。

2.3 鐵配合物的氧化還原活性和其他毒性問題 Fe3+/Fe2+適中的氧化還原電位適用于各種物質的多種電子轉移過程。鐵離子失去或獲得電子的電子轉移(氧化還原反應)過程對配體穩定性和介質酸度非常敏感。因此，盡管在體外對鐵的簡單氧化還原行為進行了許多研究，但由于生物體系統的復雜性，很難將這些研究與體內條件對等。鐵的氧化還原活性導致的最直接的后果是自由基的產生。Fe2+配合物導致自由基形成主要是基于鐵離子參與的Haber-Weiss循環和Fenton循環在生物體中，一般假設的是設計完全飽和的配體以禁用內層電子轉移。由于小而柔性的配體(如EDTA)為第七個配位點留出足夠的空間，并且水分子傾向于占據該位置，使催化活性更加復雜。另一個風險可能是已知但罕見的鐵超載的情況。盡管鐵配合物的急性毒性與釓配合物相當，但由于鐵屬內源性金屬且代謝調節良好，從鐵配合物中潛在釋放的微量鐵的長期毒性應低于游離釓。目前也沒有明確的研究表明鐵配合物會導致嚴重的有害作用。此外，使用配體過量的造影劑給藥是降低鐵離子釋放風險的可行方法。值得注意的是，鐵攝取量增加是腫瘤細胞快速增值的特異性特征之一，這可能是由于腫瘤細胞通過增加鐵的吸收和儲存，同時減少鐵的外排來調節細胞內的鐵代謝，以促進鐵的積累。攝入細胞的鐵離子將存儲在具有生物活性的不穩定鐵池(LIP)中，為代謝和增殖提供鐵源[29]。因此，這也是鐵分子探針涉及的有趣領域。

3 結論與展望

鐵配合物作為MRCAs的潛在應用正在研究中。該領域有幾個新趨勢引起了特別關注，并描繪了鐵配合物在這一應用中未來可能的發展方向。耦合各種診斷技術的嘗試在最近的文獻中以指數形式出現，這種方法也涉及鐵造影劑。例如，Hasserodt等[30]提出了一個有趣的Fe2+配合物，通過體內ROS引發的自旋交叉導致反磁性低自旋配合物轉變為高自旋順磁性配合物。這種關/開系統已被證明可通過化學或酶還原劑的作用將其配位體從6N轉變為5N1O，從而在MRI掃描儀中產生顯著信號[31-33]。此外，Dorazio等[34]已成功實現了另一種基于paraCEST的磁共振成像方法。由順磁性物質引起的化學交換飽和轉移(CEST)的方法使的水分子信號改變[35]。鐵造影劑發展新領域中的另一個方向是納米材料的應用。雖然超順磁性氧化鐵納米粒(SPIOs)是一種經FDA批準的造影劑，但各種納米材料的開發和改性的快速發展也已成為成像領域一個極具吸引力的發展方向。IBCAs在20世紀80年代曾被探索，但由于磁共振場強的限制，沒有很好地開發為MRCAs。隨著MR成像系統的磁強度增加以及設備的進步，IBCAs為安全的診斷和治療帶來了新的機遇。因此，從長遠來看，IBCAs可能是比GBCAs更安全的替代物，但在未來的研究中需要廣泛研究其急性和長期毒性。此外，IBCAs可以為開發非快速排泄型T1造影劑鋪平道路，例如蛋白質結合型、靶向分子探針型造影劑等。

致謝

李勝斌參與了論文選題、文獻資料收集并起草了論文初稿；李勝斌、許戴蕓、呂永輝和李詠霄參與論文選題、文獻資料收集并完善和修改了論文；王俊卿教授指導了論文選題、提出修改意見并審閱論文。

感謝國家青年科學基金項目(82001887)；廣東省基礎與應用基礎研究基金項目(2019A1515110326)提供經費支持。

團隊介紹

李勝斌，于2017年6月在廣東藥科大學獲得學士學位，于2019年9月錄取為中山大學碩士研究生，現于中山大學藥學院(深圳)王俊卿老師課題組進行學習和研究工作。E-mail：lishb28@mail2.sysu.edu.cn

許戴蕓，于2019年6月在福建醫科大學獲得學士學位，于2019年9月錄取為中山大學碩士研究生，現于中山大學藥學院(深圳)王俊卿老師課題組進行學習和研究工作。E-mail：xudy8@mail2.sysu.edu.cn

呂永輝，于2020年6月在鄭州大學獲得學士學位，于2020年9月錄取為中山大學碩士研究生，現于中山大學藥學院(深圳)王俊卿老師課題組進行學習和研究工作。E-mail：lvyh9@mail2.sysu.edu.cn

李詠霄，于2020年6月在山東大學獲得學士學位，于2020年9月錄取為中山大學碩士研究生，現于中山大學藥學院(深圳)王俊卿老師課題組進行學習和研究工作。E-mail：liyx356@mail2.sysu.edu.cn

王俊卿，于2019-至今，中山大學“百人計劃” 藥學院(深圳)副教授、碩導。主要從事生物(內源性)響應的前藥/探針、雙層脂質組裝體的設計和通過集成診斷成像技術促進納米醫學的臨床轉化。E-mail：wangjunqing@mail.sysu.edu.cn