鮮鐵皮石斛對肺腺癌裸鼠移植瘤中自噬及抑癌基因表達的影響*

龐晨，張錫流，張秀玲，葉星江，黃敏

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院1.病理科；2.藥學部，南寧 530023)

肺癌是世界上最常見惡性腫瘤之一[1]，近年來肺癌中腺癌分型發病率高于鱗狀細胞癌，且5年生存率較低[2-3]。盡管目前治療肺癌方法較多，并且取得一定的進展，但臨床研究數據表明[4]，很多肺腺癌患者在確診時往往處于癌癥中末期，失去手術治療的機會。當然，放射治療(放療)和化學治療(化療)等治療手段也常用于該腫瘤的治療，但這些手段副作用大，且對于大多中晚期患者效果甚微[5]。因此，迫切需要尋求新的治療方法和藥物。據研究[6]，鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraet Migo)含有多種活性成分，具有保肝、抗疲勞、降糖以及護胃等作用[7]，具有很高的藥用價值。更有研究表明，鐵皮石斛對乳腺癌[8]、消化道惡性腫瘤[6-7]、肺癌等多種惡性腫瘤有預防和抑制作用。臨床研究發現[9]，連續食用鮮鐵皮石斛可提高中晚期非小細胞肺癌患者化療后整體生活質量，并明顯延長患者無進展生存期。通過前期實驗研究結果證明[10]，綜合抑瘤率、移植瘤組織壞死情況以及移植瘤生長曲線初步得出鐵皮石斛可以通過促進腫瘤細胞及其組織的壞死，達到抑制移植瘤體積生長的目的；其中高濃度鐵皮石斛用藥組藥效更加穩定。而鐵皮石斛作用機制有待進一步的探究和分析。在肺癌發展過程中往往伴有相關基因表達的改變，因此，筆者在本實驗建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型，進一步分析中藥鮮鐵皮石斛對肺腺癌移植瘤的抑制情況及其相關機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 無特定病原體(SPF) 級BLB/c裸鼠30只，雄雌各半，3～5 周齡，體質量(16±2)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2016-0002。自由飲水和攝食，動物房恒溫22 ℃，相對濕度60%。

1.1.2儀器 5410 型低溫高速離心機(德國Eppendorf 公司)；BSC-1300Ⅱ B2 型生物安全柜(上海博訊醫療生物儀器股份有限公司)；二氧化碳(CO2)培養箱(Thermo Forma公司)，7500 Fast型實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)系統(美國 Applied Biosystems 公司)。倒置顯微鏡(日本 Olympus 公司)，電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]。

1.1.3藥材 鮮鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)，來源于廣西上林縣，新鮮鐵皮石斛切碎加純水，料理機制得鐵皮石斛漿，離心除渣，濃縮滅菌，4 ℃ 保存備用(每毫升相當于鮮藥材0.68 g)。本藥品由廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥學部制劑中心制得，并由廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥學部黃敏主任中藥師鑒定為正品。

1.1.4藥品與試劑 環磷酰胺(百特醫療用品貿易有限公司，批號：8F246A)，胎牛血清(FBS，南美Lonsa公司)、鼠抗人ki67單克隆抗體及免疫組化(SP法)試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司，批號分別為1907170672h、190704S407b。Beclin1單克隆抗體(美國Abcam公司，批號：GR3204186-2)。RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒均購于天根生化科技(北京)有限公司，批號分別為RN05004M、FP205-02。

1.1.5細胞 人肺腺癌A549細胞購自中科院細胞庫，后由實驗室接種并保存。

1.2A549肺腺癌細胞培養 生物安全柜紫外照射30 min后，將肺腺癌A549細胞置于含有配好達爾伯克改良伊格爾培養基(dulbecco's modified eagle's medium，DMEM)中(FBS、青霉素-鏈霉素溶液和DMEM高糖比例10：1：90)，在37 ℃二氧化碳培養箱中培養，并保存A549細胞，每天潤洗換液。當細胞生長達到臨界值(約80%覆蓋率)時，收集細胞并傳代。

1.3A549肺腺癌細胞收集 在細胞生長的對數階段，細胞處于良好狀態。在細胞中加入胰酶進行消化，離心處理后，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)。再次離心后，加入供種植移植瘤所需要PBS(每只裸鼠種植0.1 mL，含細胞1×107個)。

1.4動物分組及造模 裸鼠適應約1周，取30只。隨機取5只，作為空白對照組，25只進行腫瘤模型的建立。腹腔注射戊巴比妥 0.1 mL·(10 g)-1。取肺腺癌A549單細胞懸液，皮下注射至裸鼠右側背部0.1 mL。7 d后出現腫瘤，觀察裸鼠成瘤情況。25只裸鼠在細胞接種后7 d成瘤，第10天腫瘤達到90～110 mm3。造模大鼠再隨機分為5組，模型對照組，環磷酰胺組，鐵皮石斛小、中、大劑量組，每組5只。

1.5動物給藥方法 環磷酰胺組腹腔注射環磷酰胺0.025 g·kg-1，每隔1天給藥，共13次；鐵皮石斛小、中、大劑量組分別灌胃給予0.68 g·mL-1鐵皮石斛6.25，12.50，25.00 g·kg-1，連續25 d。空白對照組和模型對照組灌胃0.9%氯化鈉溶液，每天30 mL·kg-1，連續25 d。

1.6裸鼠移植瘤體生長情況以及取材 每天在固定時間段內觀察被接種細胞裸鼠的活動、精神、飲食、瘤體生長情況。每3天測定小鼠腫瘤體積(腫瘤體積=長×寬2×0.5)及體質量，4周后處死動物。取移植瘤時，冰上操作，用無酶鑷子和眼科剪剝離出完整的移植瘤，快速將周圍脂肪和壞死組織，以及包膜、血水去除，用眼科剪剪成兩塊，其中一塊迅速放入RNA保存液中，置于冰上，經梯度凍存(4 ℃ 20 min，-20 ℃ 50 min，-80 ℃)待用。另一塊置于10%甲醛溶液中固定保存待用。

1.7免疫組化方法檢測瘤體Beclin1、Ki67的表達 常規石蠟包埋及切片(厚度4 μm)；取一定量pH值6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波爐中，脫蠟、水化；封閉后，分別加一抗Beclin1(1：80)、Ki67，4 ℃過夜，加二抗37 ℃孵育30 min(MaxVision-HRP鼠/兔二抗)，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。評判標準：由兩位病理科主治及以上醫師獨立進行閱片。

根據 5 個 400倍隨機視野內 Beclin1染色強度和陽性細胞比例判定。Beclin1顯示胞質陽性。染色強度分別是不著色、淡黃色、棕黃色、黃褐色，分別對應0 分、1 分、2 分、3 分。陽性細胞(胞質有黃色或黃棕褐色顆粒)<5%、5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、> 75% 分別對應 0 ，1，2，3 ，4分。

表達強度=染色強度X陽性細胞，陰性(-)、弱陽性(+)、中陽性(++)、強陽性(+++)分別對應總分0 分、1～4分、5～8分、9 ～12分；“- ”為不表達，“+”為低表達，“++”及以上為高表達[11]。

Ki-67的陽性表達根據細胞著色的強度和陽性細胞數綜合判定結果，其陽性表達判斷標準為: 染色強度分別是不著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色，分別對應0 分、1 分、2 分、3 分，于高倍鏡下(×400)計算每張切片陽性細胞百分率，根據陽性細胞所占百分比打分: <5%判為0分，5%～<25%判為1分，25%～<50%判為2分，≥50%判為3分，并以每個組織著色程度及染色細胞百分率得分相加的和為最后得分：0～1分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)[12]。

1.8RT-PCR方法 檢測瘤體表皮生長因子(EGFR)、p53、p16 mRNA表達取瘤體組織50 mg，提取總RNA后，用Avian Myeloblastosis Virus逆轉錄酶(AMV)進行逆轉錄，以β-actin作為內參，檢測 EGFR、p53 和p16 mRNA的表達。建立RT-PCR 反應體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，β-actin的上、下游引物各0.6 μL，EGFR，p53和p16上、下游引物各0.6 μL，RNase-free ddH2O加至20 μL。PCR反應條件為：95 ℃，15 min；95 ℃，10 s；60 ℃，32 s。計算2-△△CT，得出數據以模型對照組數值為1，比較環磷酰胺組及鐵皮石斛小，中，大劑量組表達量，與模型對照組比較，數值>1則為上調，數值<1則為下調。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

2.1用藥裸鼠狀態比較 鐵皮石斛給藥前，各組裸鼠生長情況和精神狀態正常。灌胃給藥后，與空白對照組比較，鐵皮石斛小、中、大劑量組裸鼠精神、活動、食欲差異無統計學意義。與模型對照組比較，鐵皮石斛小、中、大劑量組肺腺癌移植瘤生長較慢，環磷酰胺組移植瘤同樣生長緩于模型對照組，但與空白對照組比較，環磷酰胺組裸鼠出現活力降低、精神萎靡。

2.2腫瘤移植瘤瘤體體積變化情況 前期研究表明[10]，不同濃度鐵皮石斛均對肺腺癌移植瘤有一定的抑制作用。環磷酰胺組和鐵皮石斛小、中、大劑量組抑瘤率分別達到62.0%，51.0%，52.0%，56.0%，呈現劑量依賴關系。與模型對照組比較，鐵皮石斛小、中、大劑量組腫瘤體積生長緩慢，且抑瘤率高。其中鐵皮石斛大劑量組瘤體(平均0.9 cm)較模型對照組(平均1.8 cm)明顯縮小，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2移植瘤形態學改變情況

2.2.1肉眼觀察移植瘤大體 早期裸鼠移植瘤瘤體光滑，多為圓形或橢圓球狀，隨著時間推移，裸鼠移植瘤瘤體形狀開始出現不規則現象，個別移植瘤瘤體表面會出現凹凸不平。模型對照組由于瘤體體積大，瘤體表面會有破潰出現。剝離的移植瘤與皮下組織分界清楚，少有浸潤性粘連現象，移植瘤瘤體肉眼觀見大部分呈現淡紅色，多數呈圓球狀或橢圓球狀，瘤體質地堅硬，切開橫斷面組織呈蒼白色，可見血管。

2.2.2移植瘤組織壞死情況 前期研究結果顯示[10]，模型對照組可見肺腺癌腺體，癌細胞排列緊密且均勻，癌細胞核仁體積大，出現核分葉，雙核，巨核以及核分裂象增多，有細胞核漿比例失調的現象，失去正常的細胞形態。移植瘤組織癌細胞壞死面積較少。環磷酰胺組和鐵皮石斛小、中、大劑量組移植瘤組織癌細胞均有不同程度壞死，癌細胞相比于模型對照組數目少，癌細胞完整性差，細胞壞死部分有核溶解，核固縮和碎裂等現象。與模型對照組比較，鐵皮石斛小，中，大劑量組移植瘤組織細胞壞死面積顯著升高。組間進行比較，鐵皮石斛大劑量組和環磷酰胺組壞死面積多個視野達到一半以上，鐵皮石斛中，小劑量組同樣可見移植瘤組織細胞壞死。見圖1。

2.3Beclin1蛋白表達情況觀察 結果顯示，自噬基因Beclin1蛋白在模型對照組中低表達。鐵皮石斛干預后，與模型對照組比較，鐵皮石斛中劑量組和大劑量組、環磷酰胺組Beclin1陽性高表達率逐漸升高，且呈劑量依賴性特點，其中環磷酰胺組差異有統計學意義(χ2=4.412，P<0.05)，見圖2，表2。

2.4Ki67免疫組化表達情況觀察 結果顯示，增殖指數Ki67蛋白在模型對照組中呈現高表達，經鐵皮石斛干預用藥后，與模型對照組比較，鐵皮石斛大劑量組以及環磷酰胺組的增殖指數Ki67陽性率逐漸降低，且呈劑量依賴性特點，其中環磷酰胺組的差異有統計學意義(χ2=4.412，P<0.05)，見圖3，表2。

2.5EGFR、p16、p53mRNA表達 結果見表3。RT-PCR實驗結果顯示，與模型對照組比較，鐵皮石斛大劑量和中劑量組裸鼠移植瘤組織中EGFR mRNA水平均顯示下調。其中，鐵皮石斛大劑量差異有統計學意義(P<0.05)，鐵皮石斛中劑量和小劑量組差異無統計學意義(均P>0.05)。與模型對照組比較，鐵皮石斛大，中，小劑量組裸鼠移植瘤組織中p53和p16mRNA水平均顯示上調。其中，鐵皮石斛大劑量和中劑量組裸鼠移植瘤組織中p16mRNA差異有統計學意義(均P<0.05)，鐵皮石斛小劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。與模型對照組比較，鐵皮石斛大，中，小劑量組裸鼠移植瘤組織中的p53 mRNA均差異有統計學意義(均P<0.05)，見表3。

A.模型對照組；B.環磷酰胺組；C鐵皮石斛大劑量組；D鐵皮石斛中劑量組；E鐵皮石斛小劑量組。

A.模型對照組；B 環磷酰胺組；C鐵皮石斛大劑量組；D鐵皮石斛中劑量組；E鐵皮石斛小劑量組。

A.模型對照組；B 環磷酰胺組；C鐵皮石斛大劑量組；D鐵皮石斛中劑量組；E鐵皮石斛小劑量組。

表2 5組裸鼠移植瘤Beclin1和Ki67蛋白表達的陽性率比較

表3 5組裸鼠腫瘤組織中EGFR、p16、p53mRNA表達

3 討論

我國肺癌發病率也在不斷上升，且腫瘤細胞侵襲和轉移導致患者病死率越來越高[13-14]。尋找更為有效的治療方法和緩解藥物是當前臨床醫學和藥學領域研究的熱點。鐵皮石斛證明有抗癌的效用[15]，但其抑制肺癌的作用機制尚不明確。有臨床試驗研究發現，經鐵皮石斛治療患者實體瘤療效總有效率要優于使用臨床常規化療方案組，且患者因化療導致的毒副作用得到緩解。這提示鐵皮石斛可提高中晚期非小細胞肺癌患者化療后的整體生活質量，并明顯延長患者無進展生存期。

本實驗所采用的BALB/c品系裸鼠由于缺少免疫器官免疫力低下，對異種人肺腺癌細胞無排斥反應。種植后肺腺癌細胞移植瘤組織形態良好，根據《現代腫瘤治療藥物學》關于抗腫瘤中藥有效的標準，抑瘤率>30%則代表抑制腫瘤有效，根據筆者前期實驗證實，鐵皮石斛對A549細胞裸鼠移植瘤的生長具有抑制作用。此外，經鐵皮石斛干預的移植瘤組織癌細胞均有不同程度壞死，高劑量鐵皮石斛用藥組壞死面積多個視野達到一半以上[10]。

EGFR參與多種實體腫瘤疾病進展過程，EGFR的下調使非小細胞肺癌細胞增殖活力以及侵襲能力降低[16]。此外，與EGFR相關通路磷酸化激活的抑制可以抑制腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤血管生成，降低腫瘤細胞的侵襲能力[17]。本實驗過程結果顯示，與模型對照組比較，鐵皮石斛大劑量和中劑量組裸鼠移植瘤組織中EGFR mRNA水平均顯示下調。其中，環磷酰胺組和鐵皮石斛大劑量組差異有統計學意義(P<0.05) 。根據前述研究，提示鐵皮石斛可通過下調EGFR mRNA的表達達到抑制肺腺癌移植瘤生長，同時推測其抑制肺腺癌的作用機制可能通過與抑制EGFR相關通路激活有關。

自噬在促進非小細胞肺癌細胞凋亡中起到積極作用，抑制自噬意味限制細胞克服壓力和維持體內平衡的能力。在腎部腫瘤組織中，自噬相關基因Beclin1表達低于正常組織，而Beclin1的低表達腫瘤患者預后比Beclin1高表達的腫瘤患者差[18]。同樣，Beclin1對非小細胞肺癌有抑癌作用，低表達的Beclin1導致肺癌中的自噬體形成減少，腫瘤細胞的自噬能力降低，異常的腫瘤細胞凋亡減少且有持續增加的趨勢，最終導致肺癌的發生發展[19]。Beclin1通過誘導自噬的發生抑制肺癌，且Beclin1陽性表達水平和腫瘤體積、TNM分期呈負相關，同分化程度呈正相關[20]。這與本實驗免疫組化結果中Beclin1在模型對照組高表達一致。此外，在肺腺癌進展過程中，發現Beclin1基因表達呈下降趨勢，而Beclin1低表達會抑制癌細胞的自噬功能，癌細胞的凋亡受到抑制，導致癌細胞的惡性增殖，促進肺腺癌的發生發展。而本實驗免疫組化結果顯示，鐵皮石斛大，中劑量組以及環磷酰胺組肺腺癌移植瘤中Beclin1陽性表達率較模型對照組升高，分析鐵皮石斛可能通過上調自噬相關基因Beclin1的表達，促進細胞自噬，最后抑制肺腺癌腫瘤細胞的惡性增殖。另有研究者表明，Beclin1是維持肺腺癌發生發展的關鍵組成部分，它可以通過介導自噬機制抑制腫瘤發生，其異常表達常會破壞自噬和凋亡通路[21]。由此可見，自噬基因Beclin1的表達與肺腺癌的發生發展密切相關，在一定條件下可誘導癌細胞凋亡。另有研究表明，p53和Beclin1可以通過Beclin1-p53相互作用，研究者提出[22]，BECN1+/-細胞中Beclin1水平的降低可能通過促進Bcl-2的活性，從而增加細胞存活，促進腫瘤的發生。其中Bcl-2的凋亡相關Bax蛋白是p53下游的應答蛋白，協同參與細胞凋亡調節過程。Beclin1的減少會導致p53水平低下，可能導致DNA的損傷以及促進基因組的不穩定性，最后導致腫瘤發生。本實驗結果顯示，鐵皮石斛給藥組裸鼠移植瘤組織中p53 mRNA水平均顯示上調，差異有統計學意義(P<0.05)，提示鐵皮石斛抑制A549肺腺癌細胞的作用機制可能通過上調腫瘤自噬相關基因Beclin1和抑癌基因p53有關，過表達Beclin1會上調p53，提示可能通過Beclin1-p53途經相互作用，修復基因不穩定性，抑制腫瘤發生。

p16是檢測腫瘤常用指標，同時也是最受關注的抑癌基因之一[23]，其作為一種腫瘤抑制劑，可以阻止細胞周期的進展和增殖，參與誘導細胞周期阻滯[24]。在過表達p16的轉基因小鼠中，細胞增殖顯著減少，組織再生相應減少[25]。有研究發現[26]，p16基因的突變是小鼠惡性腫瘤發生轉移的驅動因素，它參與并調控細胞周期，達到抑制腫瘤細胞異常增殖的目的[27]，對腫瘤細胞起到負性調節作用[28]。高越等[29]研究發現，在p16低表達的非小細胞癌患者更容易發生淋巴結轉移，越是晚期的患者p16 蛋白的缺失情況越明顯。本實驗中各劑量鐵皮石斛給藥組裸鼠移植瘤組織中的p16 mRNA水平上調，鐵皮石斛中，大劑量組裸鼠移植瘤組織中p16 mRNA差異有統計學意義(P<0.05)。武世伍等[30]對非小細胞肺癌中p16和Ki67進行了相關性分析，研究發現癌組織中Ki67的表達水平同p16表達率呈負相關關系。這提示p16和 Ki67和非小細胞肺癌的增殖發生相關，且抑癌基因p16可能與增殖指數Ki67協同作用。其中增殖因子Ki67是細胞增殖的標志，對腫瘤的發生、發展和判斷腫瘤細胞活性有著重要意義。Ki67陽性預示著肺癌細胞增殖活躍，病情容易進展。本實驗結果顯示，Ki67蛋白經鐵皮石斛干預后，與模型對照組比較，鐵皮石斛大劑量組、環磷酰胺組Ki67陽性率降低。各劑量鐵皮石斛給藥組裸鼠移植瘤組織中p16 mRNA水平顯示上調。其中，鐵皮石斛大劑量組和中劑量組裸鼠移植瘤組織中p16 mRNA差異有統計學意義(P<0.05)。據如上文獻以及本實驗結果所述，提示鐵皮石斛抑制A549肺腺癌細胞的作用機制可能與上調抑癌基因p16和抑制癌增殖因子Ki67有關，可能通過p16和Ki67之間的負調控關系相互制約維持平衡，最后達到抑制肺腺癌發生發展的目的。

綜上所述，鐵皮石斛抑制肺腺癌裸鼠移植瘤組織的作用機制可能與自噬相關因子Beclin1相關，通過Beclin1-p53和p16-Ki67相互協同作用以及調控與腫瘤血管生成相關因子EGFR表達量實現抑制移植瘤組織生長的目的，可能通過啟動細胞自噬從而誘導細胞凋亡。