荊芥穗多糖的免疫調節活性*

朱瑜丹，李仲昆，梁月琴，夏洪穎，李翠紅，王重娟

(昆明醫科大學附屬延安醫院藥學部，昆明 650051)

荊芥穗(Herbaschizonepetae)為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗，味辛，性微溫，歸肝肺經，是一味常用的中藥解表藥[1]。荊芥穗用藥歷史悠久。民間用于治療頭風、虛勞、婦人血風等[2]。現代藥理學研究證明，荊芥穗具有抗炎、抗病毒和鎮痛作用，并具有一定的抗補體作用[2]。荊芥穗治療婦科血癥、帶下等疾病，也取得較好的效果[3]，因此具有較高的開發價值。目前研究較多荊芥穗有效成分為其揮發油，化學成分種類繁多，主要是單萜和倍半萜成分，還含少量的醛、羧酸和酯類等化合物[4-5]，而對于荊芥穗多糖卻鮮有報道。多糖是中草藥中重要組成成分，具有免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、降血糖等作用。其中植物多糖的來源廣泛、毒副作用小[6]。筆者通過水提醇沉法提取荊芥穗多糖(Herbaschizonepetaepolysaccharide，HSP)，利用高效液相色譜(HPLC)分析HSP的單糖組成，并分別從體內外水平評價HSP的免疫調節活性，為其在食品與醫療保健中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 無特定病原體(SPF)級雄性ICR小鼠，6～8周齡，體質量(20±2)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2013-0004。動物實驗方案已通過昆明市延安醫院實驗動物倫理委員會審批。實驗動物飼養在昆明市延安醫院中心實驗室動物房中，室內溫度(22±2) ℃，相對濕度50%～60%，12 h循環照明，實驗開始前小鼠適應性飼養7 d，自由攝食和飲水。

1.1.2藥物及試劑 荊芥穗(河北百草康神藥業有限公司，批號：1806011)，由昆明市延安醫院李仲昆主任藥師鑒定為荊芥穗。單糖標準品D-甘露糖(D- Mannose，Man，批號：10127360)、L-鼠李糖(L-rhamnose，Rha，批號：GG01)、D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid，GlcA，批號：10136713)、L-半乳糖醛酸(L-galacturonic acid，GalA，批號：KBLFG)、D-葡萄糖(D-glucose，Glc，批號：10145311)、D-半乳糖(D- galactose，Gal，批號：10134490)、L-阿拉伯糖(L-arabinose，Ara，批號：V900920)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP，批號：BCBK6062V)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，批號：WXBC5159V)購自美國Sigma公司；細胞實驗級Lipopolysaccharides(LPS)來源于大腸埃希菌 055：B5(批號：028M4138V)，購自美國Sigma公司；噻唑藍(MTT，批號：829Z051)購自北京索萊寶生物科技有限公司；FITC標記葡聚糖40(批號：20614)購自瑞典TdB Consultancy AB公司；DMEM高糖培養基(貨號：SH30243.01B)；胰蛋白酶(貨號：SH30042.01)購自美國HyClone公司；注射用環磷酰胺(cyclophosv-namide，CY，批號：14122325)購自江蘇盛迪醫藥有限公司；其他化學試劑均為分析純。小鼠巨噬細胞Raw264.7購自加拿大ABM公司。

1.1.3儀器及設備 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；UV-2201型紫外分光光度計(日本島津)；KDC-2046低速冷凍離心機(安徽中佳科學儀器有限公司)；RE-52AA 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；Model 550全自動酶標儀(美國 BIO-RAD公司)；FC-500流式細胞儀(美國Beckman公司)；Nikon50i光學顯微鏡(日本Nikon公司)；FA2004電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司，感量：0.1 mg)。

1.2荊芥穗多糖的提取 稱取荊芥穗粉末300 g，置回流提取裝置中，加入8倍量95%乙醇，70 ℃回流提取3 h以除去醇溶性小分子。藥渣加入10倍量純水，90 ℃回流提取2 h，重復提取2次，合并2次上清液。4000×g離心15 min，上清液于旋轉蒸發儀濃縮至400 mL。向濃縮液中加入95%乙醇，使溶液中乙醇的終濃度為70%，靜置過夜。該步驟重復3次以純化多糖，沉淀置真空干燥箱40 ℃干燥48 h，得荊芥穗多糖(Herbaschizonepetaepolysaccharide，HSP)7.47 g，得率為2.49%，本研究只提取一個批次HSP，以下各實驗均采用該批次HSP。

1.3總糖、糖醛酸及蛋白質含量測定 總糖含量測定采用苯酚-硫酸法[7]；糖醛酸含量測定采用硫酸-四硼酸鈉法[7]；蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[7]。

1.4單糖組成分析 稱取一定量單糖標準品(Man 1.53 mg、Rha 1.54 mg、GlcA1.05 mg、IdoA 1.05 mg、GalA 1.30 mg、Glc 1.07 mg、Gal 1.28 mg、Ara 1.14 mg)以及供試品HSP 7.15 mg，置于5 mL COD管中，以不加供試品的空白管為對照，每管加2 mol·L-1三氟乙酸1 mL，110 ℃中水解4 h。將水解液蒸干，用甲醇洗5次。加水1 mL溶解，取上述水解液50 μL與0.6 mol·L-1的氫氧化鈉溶液50 μL混合；加0.5 mol·L-1PMP甲醇溶液50 μL，70 ℃烘箱反應30 min；取出放置10 min冷卻至室溫；加 0.3 mol·L-1鹽酸溶液100 μL中和；加水至1 mL，使用等體積三氯甲烷萃取3次，將水相用孔徑0.22 μm濾膜濾過后，進樣分析。

色譜條件：Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：0.1 mol·L-1乙酸銨(pH值5.5)緩沖液-乙腈(85：15)；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μL；流速：1 mL·min-1；檢測波長：250 nm。

1.5MTT實驗檢測巨噬細胞增殖 取對數生長期的Raw264.7細胞按每孔1×104個加入96孔細胞培養板中，37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)條件下培養24 h。棄去培養基，分別加入含有各濃度HSP(12.5，25，50，100，200，400，800 μg·mL-1)的新鮮培養基，每孔150 μL，陽性對照組分別加入1 μg·mL-1LPS。繼續培養24 h，每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，37 ℃繼續培養4 h，棄去培養基，每孔加入DMSO溶液150 μL，震蕩混勻，在酶標儀上測定490 nm處吸光度(A值)。細胞生長率(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.6流式細胞儀檢測吞噬活性 取對數生長期的Raw264.7細胞按每孔1×105個加入12孔細胞培養板中培養24 h后，分別加入低、中、高濃度HSP(100，200，400 μg·mL-1)的新鮮培養基，每孔1 mL，陽性對照組加入1 μg·mL-1LPS。培養24 h后，棄去培養基，用PBS洗2次，加入1 mg·mL-1FITC-dextran 40，37 ℃避光培養1 h。棄去培養基，用預冷的PBS洗細胞3次，PBS 500 μL重懸，用流式細胞儀檢測。

1.7動物分組、造模及給藥 參考文獻[8]方法，將小鼠適應性暫養1周后，按體質量分層隨機數字表法分為3組，每組5只：空白對照組、模型對照組、HSP組。模型對照組和HSP組在實驗第1，3，5，7天腹腔注射CY 50 mg·kg-1，空白對照組注射等體積0.9%氯化鈉注射液。HSP組每天灌胃HSP 1.0 g·kg-1[0.1 mL·(10 g)-1]，空白對照組和模型對照組灌胃0.9%氯化鈉注射液，連續8 d。每天稱定并記錄小鼠體質量，同時記錄小鼠活動情況及進食量。實驗終點，小鼠禁食12 h，處死小鼠，沿腹部正中線切開，充分暴露小鼠胸腔和腹腔，取小鼠胸腺、脾臟和全段小腸。記錄小鼠全段小腸上派氏結個數，并計算胸腺、脾臟指數，胸腺指數=胸腺質量(g)/小鼠體質量(g)；脾臟指數=脾臟質量(g)/小鼠體質量(g)。

2 結果

2.1HSP中總糖、糖醛酸及蛋白質含量 本研究采用硫酸-苯酚法測定HSP中總糖含量，以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為Y=77.61X-0.016，R2=0.994。采用硫酸-四硼酸鈉法測定糖醛酸含量，以吸光度為縱坐標，半乳糖醛酸濃度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為Y=10.4X-0.060，R2=0.978。采用考馬斯亮藍法測蛋白質含量，以吸光度為縱坐標，BSA濃度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為Y=39.42X+0.640，R2=0.972。根據回歸方程計算出HSP中總糖、糖醛酸和蛋白質的含量分別為22.93%，25.25%和8.59%。

2.2HSP單糖組成分析 選取常見的8種單糖Man、Rha、GlcA、IdoA、GalA、Glc、Gal、Ara為混合標準品，經PMP衍生化后進行HPLC分析。圖1(A)可以看出8種混合單糖實現良好的分離。參照圖1(A)，HSP由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara 組成。在HPLC圖譜中，峰面積與質量濃度呈正比關系，因此通過峰面積可對單糖進行定量分析[9-10]。根據峰面積比值、各標準單糖和HSP質量計算HSP中各單糖比例，結果見表1所示，從表1可看出，組成HSP的主要單糖為Ara，所占比例達到92.26%，其次是GalA(6.67%)和Rha(4.36%)。

圖1 單糖標準品(A)、HSP(B)經PMP衍生化后的HPLC圖譜

表1 荊芥穗多糖單糖組成分析

2.3HSP對巨噬細胞增殖的影響 為了考察HSP的體外免疫調節活性，本研究以小鼠巨噬細胞Raw264.7為模型，采用MTT法測定HSP對Raw264.7細胞增殖率的影響。結果見圖2。LPS和不同濃度的HSP作用于Raw264.7細胞24 h后均對其增殖率產生不同程度的影響，且HSP對巨噬細胞的促增殖作用呈現出一定的濃度依賴性。低濃度(≤100 μg·mL-1)的HSP對細胞增殖率的影響與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。中濃度(200 μg·mL-1)的HSP能夠促進巨噬細胞增殖(t=-7.89，P<0.05)。高濃度(400，800 μg·mL-1)的HSP能夠顯著促進巨噬細胞增殖(t=-5.12，-3.96，P<0.01)。由于400和800 μg·mL-1的HSP促增殖作用差異無統計學意義，故分別以100，200，400 μg·mL-1為低、中、高濃度進行進一步免疫調節活性研究。

①與空白對照組比較，t=4.45，5.11，3.96，P<0.01；②與空白對照組比較，t=7.89，P<0.05。

2.4流式細胞術檢測吞噬活性 本研究采用流式細胞術考察濃度為100，200，400 μg·mL-1的HSP對Raw264.7細胞吞噬活性的影響，結果見圖3。低濃度HSP組與空白對照組比較，熒光強度相當，差異無統計學意義(P>0.05)。中濃度和高濃度的HSP能夠顯著增強巨噬細胞的吞噬活性(t=-191.22，-28.82，P<0.01)，且隨HSP濃度的增加，熒光強度增強，表明HSP對巨噬細胞的促吞噬作用呈現一定的濃度依賴性。

2.5HSP對巨噬細胞形態的影響 在倒置顯微鏡下觀察Raw264.7細胞形態結果見圖4。與空白對照組比較，經HSP和LPS處理后的細胞數量增多，與MTT法測定細胞增殖結果一致，進一步證實HSP具有促進細胞增殖的作用。此外，經HSP和LPS處理后細胞形態發生了顯著變化?？瞻讓φ战M中Raw264.7細胞呈圓形或橢圓形，貼壁良好，較少見突起，細胞內未見空泡。經LPS和不同濃度的HSP處理24 h后，細胞數量明顯增多，細胞體積變大，呈圓形、橢圓形、菱形、梭性或不規則形，可見較多偽足，細胞內出現較多顆粒和空泡，呈現激活狀態，且隨著HSP濃度的增加，其對Raw264.7細胞形態的影響越顯著。

A.空白對照組(4 ℃)；B.空白對照組；C.陽性對照組；D.HSP低濃度組；E.HSP中濃度組；F.HSP高濃度組；①與空白對照組比較，t=22.72，22.08，8.10，P<0.01。

2.6HSP對免疫抑制小鼠免疫功能的調節作用 為了評價HSP的體內免疫調節作用，本研究通過腹腔注射50 mg·kg-1CY誘導建立免疫抑制小鼠模型，考察HSP對免疫抑制小鼠體質量增長、脾臟指數、胸腺指數及派氏結數量的影響。結果見表2，與空白對照組比較，模型對照組小鼠體質量增加值、脾臟指數和胸腺指數均顯著降低(t=6.34，5.49，11.72，P<0.01)，提示造模成功。與模型對照組比較，HSP能夠提高小鼠的體質量增加值和腸道派氏結數量，但差異無統計學意義。HSP能夠顯著提高免疫抑制小鼠的脾臟指數和胸腺指數，與模型對照組比較，差異有統計學意義(t=-2.36，-2.98，P<0.05)。

圖4 HSP對巨噬細胞形態的影響

表2 3組小鼠體質量增值、臟器指數及派氏結結果

3 討論

多糖是自然界廣泛存在的一類天然有機大分子物質，其與脂肪、核酸、蛋白質一起被稱為構成生命體的四大基本物質，具有重要的生物學功能。近年來，中草藥多糖成為眾多學者研究的熱點，它不僅參與細胞骨架的構成，也是多種內源性生物活性分子的重要組成部分，其中，免疫調節作用是其主要的藥理作用之一[11]。中藥多糖來源廣泛，來源于不同動植物的多糖，可能由于其單糖組成或連接方式不同而具有不同的藥理活性[12-13]，即使是來源于同一物種的多糖，由于自然環境或采收季節變動也可能使多糖的組成發生變化，進而影響其藥理活性[14]。因此，本研究初步對HSP的化學組成進行研究，分別測定其總糖、糖醛酸和蛋白質含量。并通過PMP衍生化后進行HPLC分析，研究HSP的單糖組成。結果表明HSP由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara 組成，其中最主要的單糖種類為Ara，占比達到92.26%。此外，還含有部分酸性多糖GalA、GlcA和蛋白質，因此HSP可能是一種酸性雜化蛋白多糖，但僅從目前的實驗數據不能確定蛋白質是否與多糖連接，還需進一步的實驗加以驗證。此外，HSP中單糖的連接方式還有待于進一步研究。

免疫系統由免疫器官、免疫細胞和免疫分子組成。本研究首先在體外研究HSP對免疫細胞的調節功能。免疫細胞包括淋巴細胞、樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞等。其中巨噬細胞是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象，也在機體免疫應答和防御中發揮著至關重要的作用[15]。因此，本研究選擇醫學研究中常用的小鼠單核巨噬細胞白血病細胞作為細胞模型，評價HSP對Raw264.7細胞增殖、吞噬活性以及形態的影響。結果顯示，低濃度的HSP促增殖作用不顯著，當濃度高于200 μg·mL-1時，HSP表現出顯著的促增殖作用，且隨著濃度的增加，促增殖作用增強，表明HSP的促增殖作用具有濃度依賴性。同樣，隨著HSP濃度的增加，巨噬細胞吞噬活性增強，且細胞形態發生顯著變化，出現偽足和胞內空泡，呈現出激活狀態。體外細胞實驗證實HSP能夠劑量依賴性的活化Raw264.7細胞。

為了進一步評價HSP在體內的免疫調節活性，本研究采用CY誘導建立免疫抑制小鼠模型，并選擇體質量增長值、胸腺指數、脾臟指數、腸道派氏結數量作為評價指標。胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，其發育狀態直接影響機體免疫能力，因此胸腺和脾臟指數可以作為反映機體免疫狀態的初步指標[16]。派氏結是存在于哺乳動物小腸段的集合淋巴小結，其中富含胸腺源性T細胞和B細胞，是腸道黏膜免疫系統的免疫誘導部位[17]。派氏結的大小、數量及其中淋巴細胞的數量和活性狀態等可以反映腸道黏膜局部的免疫狀態[18]。本研究中，通過隔日腹腔注射50 mg·kg-1CY的方法，注射4次后，小鼠的脾臟指數和胸腺指數均顯著降低，提示小鼠免疫力被抑制，造模成功。而HSP能夠顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺脾臟指數，表明HSP在體內仍然具有一定的免疫調節作用。此外，與空白對照組比較，模型對照組中免疫抑制小鼠腸道派氏結數量減少，HSP能夠一定程度上恢復免疫抑制小鼠腸道派氏結水平，但由于組內差異較大，三者之間差異均無統計學意義，有待擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，本研究從荊芥穗中分離得到的酸性雜化多糖，分別從體內外實驗證實了其在適當劑量下能夠活化巨噬細胞，增強免疫抑制小鼠免疫功能。本研究為荊芥穗多糖在免疫調節中的應用提供一定的理論依據，但該多糖的結構及具體免疫調節機制仍不清楚，有待深入研究。