基于透明質酸構建的功能材料及其在生物醫藥領域中的應用

朱益銳， 蔡志祥， 郭亞龍， 張洪斌

（上海交通大學化學化工學院，高分子科學與工程系，流變學研究所，變革性分子前沿科學中心，上海 200240）

透明質酸（HA）是在1934年由Meyer從牛眼玻璃體液中分離得到的一種多糖[1]。20世紀50年代Meyer等[2]確定了HA的分子結構，它是一種天然存在的聚陰離子多糖，其化學結構是由交替的β-1,4和β-1,3糖苷鍵連接的D-葡萄糖醛酸和N-乙?；?D-葡萄糖胺的二糖重復單元組成（圖1（a））。在生理條件下，HA表現出弱酸性，但通常以鈉鹽的聚電解質形式存在，因此HA也被稱為透明質酸鈉。

在人體內，超過50%的HA存在于皮膚、肺和腸等器官中，也存在于滑液、臍帶和血液中。研究表明，HA與細胞調節有很強的相關性，如細胞遷移和增殖等[3]。此外，HA在傷口愈合、血管生成和細胞間質構建等方面都發揮了關鍵作用[4]。HA具有較寬的重均分子量分布（1×106～1×109）[5]，高分子量的HA會被降解成小分子進入淋巴管、淋巴結、血液、肝臟和腎臟等組織[6]。不同分子量的HA在人體中的功能不同，高分子量HA與維持細胞間質完整性和含水量密切相關，而低分子量HA與受體介導的細胞內信號傳導密切相關[7]。許多研究報道了HA受體與細胞內吞作用、降解和信號傳導等生理活動密切相關。HA受體主要有分化簇44（CD44）[8]、HA 介導的運動受體（RHAMM）[9]、HA 內吞受體（HARE）[10]和淋巴管內皮細胞受體 1（LYVE-1）[11]等類型。

HA除了與人體生理活動有強關聯性外，還具有可降解性、非免疫性、黏彈性、靶向性和生物相容性等優點，在生物醫藥領域展現出廣闊的應用前景[12]。在早期階段，HA大多從人臍帶和公雞雞冠中分離得到，主要作為眼科手術中玻璃體補充劑和治療骨關節炎的黏彈性補充劑。近幾十年，利用生物發酵技術已經實現HA的規?；苽洌@使得HA被廣泛應用于生物醫藥領域成為可能。然而，HA本身具有穩定性差和生物半衰期短等缺點，在一定程度上限制了其在生物醫藥領域中的應用[13]。通過化學修飾法制備HA衍生物，可以克服上述HA的不足之處，而且基于這些HA的衍生物可以制備凝膠[14]、納米載體[13,15]和雜化材料[16]等，應用于組織工程、靶向藥物釋放和疾病診斷等生物醫藥領域。

1 結構、合成與降解

HA是由一組高度特異化的膜蛋白HA合成酶（HAS）在質膜上合成的[3]。哺乳動物中含有3種HAS同工酶：HAS1、HAS2和HAS3，每種HAS同工酶含有2個不同的尿苷二磷酸 (UDP)-糖（尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）和尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc））結合區域[17]。HA聚合過程（圖1（b））發生在質膜的內表面，HAS交替地將UDP-GlcA和UDP-GlcNAc單體添加到聚合物的還原端。隨著聚合過程的進行，糖鏈的非還原端通過HAS結構中的孔道轉移到細胞外空間。研究表明，盡管這3種同工酶具有55%～70%的結構同一性，但它們合成HA的能力各不相同。對于UDP-GlcA和UDP-GlcNAc來說，HAS1較之于HAS2和HAS3具有更高的米氏常數（Km）和較低的HA合成速率[18]。另外，HAS1和HAS2能夠產生高分子量的HA（分子量可達 2×106），而 HAS3 產生較低分子量的 HA（105～106）[18,19]。因此，HAS 同工酶可能是對多種細胞行為進行有效調節的至關重要的精細控制系統。

圖1 （a）HA 化學結構；（b）HA 合成示意圖；（c）HA 降解示意圖[20]Fig. 1 （a） Chemical structure of HA; Schematic representation of （b） biosynthesis and （c） biodegradation of HA[20]

HA的合成和降解受到嚴格的生理控制，不同組織中HA的半衰期差異很大，例如皮膚和血清中的HA半衰期小于1 d，而軟骨中的半衰期長達14～21 d[20]。HA從細胞間質中去除主要是由于HA局部分解代謝或進入淋巴系統在區域淋巴結中分解代謝。HA可以被HA酶（HAase）家族中的許多酶分解代謝。透明質酸酶1（Hyal1）和透明質酸酶2（Hyal2）是兩種最常見且最重要的HA酶，兩種酶存在于幾乎所有的體細胞組織中[21]。Hyal1以兩種同種型酶存在，第1種是重均分子量為5.7×104的糖基化蛋白質，第2種是缺失了約100個氨基酸形成的重均分子量為4.5×104的糖基化蛋白質[22]。體內和體外研究都證實，較大的同種型酶可能是由細胞分泌的，而較小的同種型酶則在酸性細胞囊泡中[23]。Hyal2通常以與糖基磷脂酰肌醇（GPI）結合的形式固定在質膜的細胞外側[24]。研究表明，Hyal1和Hyal2通過協同作用來完成HA降解過程（圖1（c））。與糖基磷脂酰肌醇結合的Hyal2在細胞外結合HA，隨后內吞HA（可能通過HA受體內吞）并在酸性內吞囊泡中對長鏈HA聚合物進行初步切割，而且Hyal1可以在β-外切糖苷酶的幫助下進一步分解這些囊泡中的HA寡聚體[25]。基因敲除研究證明了Hyal1的分解作用在很大程度上可以通過β-外切糖苷酶得到補償，而Hyal2則可以使小鼠胚胎致死或產生嚴重缺陷[26]。除了酶促降解外，HA還可以在應激條件下由多種細胞產生的活性氧進行降解，借助各種損傷模型已經初步明確了超氧化物和過氧亞硝酸鹽對HA的降解機理[20]。

2 在人體中的功能

HA結構中的親水基團（如羥基、羧基和乙酰氨基）不僅可以形成分子間氫鍵，而且還能與水分子相互作用，從而賦予HA很好的親水性能[27]。值得注意的是，與典型的親水聚合物不同，HA含有由軸向氫原子形成的疏水區域（圖2）。由于親水基團和疏水基團共存于HA的主鏈上，因此HA具有獨特的兩親性。當HA通過靜脈注射到體內時，其半衰期只有幾分鐘，在血液循環期間即消失，大部分HA被運送至肝臟。HA通過內吞作用進入肝臟的肝竇內皮細胞并被降解，注射后20 min可在血液循環中檢測到HA的降解產物。注射HA至皮膚和關節組織的半衰期（HA的半衰期為將其注射到各種組織后測定的半衰期）為12 h，眼前房為1～1.5 h，玻璃體為 70 d[3]。

盡管單獨的HA具有獨特的物理化學特性和生理功能，但是HA的生理功能主要是通過與受體蛋白（HABP）相互作用表現出來的。這些受體蛋白在組織表達、細胞定位、特異性、親和力和生理調節方面表現出顯著差異[28]。根據與HA的結合基序不同，HABP可大致分為：分化簇44、淋巴管內皮細胞受體1、HA內吞受體和HA介導的運動受體等[28]。通常，HA-蛋白受體相互作用所產生的細胞信號傳導反應強烈依賴于HA分子量和細胞表型[29]。HA受體分布在人體肝臟、關節、眼睛和皮膚等器官中（圖2），這些受體在HA的內吞和降解及調節細胞增殖、遷移和分化中發揮關鍵作用。其中，CD44是最受關注的受體，因為它在各種細胞中廣泛分布。HA與CD44的結合與細胞黏附、細胞遷移、誘導造血分化以及細胞信號傳導激活等活動密切相關[30]。據報道，除了成纖維細胞和平滑細胞對生長因子的細胞反應外，HA與RHAMM的結合還能調節與內皮細胞增殖相關的血管生成[31]。HARE和LYVE-1在受體介導的內吞作用和淋巴系統中HA降解均發揮著重要作用[10]。由于HA受體在體內的廣泛分布及其與生物組織的獨特作用，HA已成功應用于藥物輸送和組織工程的靶向配體[32]。

圖2 HA的化學結構和體內HA受體分布示意圖[12]Fig. 2 Schematic illustration of chemical structure of HA and distribution of HA receptors in the body[12]

3 化學改性制備 HA 衍生物和凝膠

HA可以作為眼科手術中的玻璃體補充劑和治療骨關節炎的黏彈性補充劑，在生物醫藥領域廣泛應用。盡管HA已經成功商業化，但半衰期短的缺點嚴重限制了其進一步臨床應用。對HA進行修飾或交聯可延長HA在體內的存留時間，現在的合成策略主要通過對HA的羧基和羥基進行修飾或交聯，包括HA的酯化[33]、碳二亞胺修飾HA[34]以及使用二乙烯基砜修飾HA[35]、縮水甘油醚或二醛交聯HA[36]等。這些化學修飾的目的主要是根據特定應用條件和特殊要求來制備HA材料，同時盡量避免損失原始HA的生物相容性、生物降解性以及與細胞和其他生物組織等相互作用的性能。

圖3為基于不同官能團修飾得到的HA衍生物化學結構示意圖，化學修飾位點主要是HA的羧基。由于HA的羧基是HA受體和HA酶的識別位點，因此對HA的羧基修飾會改變HA在體內的生物學行為[37]。隨著HA羧基修飾程度的增加，HA衍生物的降解速率下降[38]。HA可以被設計成含有各種官能團的天然高分子，如可以通過己二酸二酰肼（ADH）、六亞甲基二胺（HMDA）或胱胺與HA的羧基發生共軛反應來制備氨基修飾的HA[39,40]。另外，HA的羧基可以和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）共軛制備具有活性官能團的氨基[41]。巰基修飾的HA可以通過HA羧基與胱胺的反應以及隨后用二硫蘇糖醇（DTT）斷裂雙硫鍵制備得到，還可以用HA與3-（2-吡啶基二硫代）丙酰肼（PDPH）反應，隨后用碘乙酰胺斷裂雙硫鍵來制備巰基功能化的HA[42,43]。同樣地，多巴胺可以修飾HA制備HA-多巴胺衍生物。為了提高HA在DMSO中的溶解性，HA可以用離子交換樹脂制備四丁基銨鹽修飾的HA（HA-TBA）[44]。HA-TBA在DMSO中可以分別與甲基丙烯酸氨基乙酯（AEMA）、氨丙基甲基丙烯酰胺（APMAm）或乙烯基砜（VS）反應制得HA-AEMA、HA-APMAm和HA-VS衍生物[44,45]。

圖3 HA在水中或者DMSO中進行化學修飾制備各種HA衍生物的示意圖[5]Fig. 3 Schematic illustration of chemical modification of HA in water or in DMSO for the preparation of various kinds of HA derivatives[5]

制備HA水凝膠的交聯反應有3種類型：HA直接交聯、HA衍生物交聯以及兩種不同HA衍生物之間的交聯。根據二胺與HA羧基的物質的量之比不同，可以制備HA水凝膠或者氨基功能化的HA衍生物。如果二胺與羧基的物質的量之比遠高于1/1，可將二胺接枝形成氨基功能化HA衍生物；相反，如果該值低于1/1，則二胺可用作交聯劑形成HA凝膠。因此，可以采用此方案制備HA-ADH、HA-HMDA和HA-胱胺水凝膠。

除此之外，還可以通過向化學改性的HA溶液中加入交聯劑進行交聯反應制備水凝膠。HA-ADH、HAHMDA和HA-胱胺可以利用辛酸雙（磺基琥珀酰亞胺基）酯作為交聯劑進行交聯[39]。具有雙鍵的HA衍生物如HA-AEMA、HA-APMAm和HA-VS可以通過邁克爾加成與二硫醇（如二硫蘇糖醇（DTT）和聚乙二醇（PEG）-二硫醇）或具有半胱氨酸基團的肽進行交聯。具有硫醇基團的HA衍生物如HA-巰基（HA-SH）和HA-半胱胺可以使用二硫蘇糖醇和PEG-二硫醇進行交聯。

制備HA水凝膠的另一種方法是混合兩種不同的HA衍生物。如果一種HA衍生物的官能團與另一種HA衍生物的官能團反應，則可以簡單地通過混合兩種HA衍生物來制備HA水凝膠。邁克爾加成反應是制備HA水凝膠最常用的反應之一，主要是前體沒有任何有毒副產物以及不需要任何額外的試劑。具有雙鍵的HA衍生物可以與巰基功能化的HA衍生物進行交聯反應，通過該方法可以在體內原位形成水凝膠。

另外，還可以通過冷凍解凍等物理方法制備HA物理凝膠。本課題組[46]通過對影響HA冷凍解凍凝膠過程中各種因素的研究，以及對所制備的凝膠性質的表征和分析表明，凝膠性質受冷凍解凍過程（冷凍時間和冷凍解凍次數）、HA分子量以及小分子添加物等多方面因素的影響。隨著冷凍時間的延長或者冷凍解凍次數的增加，溶液中更多的自由鏈參與了物理交聯的凝膠網絡的形成，從而促進了其力學性能的提高。隨著冷凍時間的延長，纖維網絡結構及其密度相應增加，凝膠的熱穩定性也相應提高。凝膠形成的機理為：在酸性和低溫條件下，HA富集于高濃度的非凍結區域，更多的HA分子采取更易堆積的兩重折疊分子構象，分子間通過多重氫鍵結合在一起。在酸性凝膠中，?COOH所參與的有效分子間氫鍵促進了凝膠三維網絡結構的形成，而在中性凝膠中，分子間的相互作用主要是—COO?和—NHCOCH3之間的氫鍵（圖4）。

圖4 透明質酸冷凍解凍物理凝膠制備過程中的分子鏈不同狀態示意圖[46]Fig. 4 Scheme for molecular states of HA chains during the preparation of HA cryogel[46]

4 在藥物釋放中的應用

癌癥已經成為本世紀嚴重危害人類健康的重大疾病之一，目前臨床上普遍采用化學藥物治療，但是化療藥物缺乏選擇性和靶向性，會對人體產生不同程度的毒副作用。為了克服當前癌癥治療中存在的這些問題，在過去幾十年中，許多研究者致力于開發各種藥物傳遞系統（DDS），旨在實現以腫瘤細胞為目標的藥物傳遞和在病變部位的藥物控制釋放，通過被動和主動靶向模式將抗癌藥運輸到腫瘤部位來提高治療效果并減少副作用[47-49]。在不同類型的DDS中，基于聚合物的DDS極具吸引力，例如膠束和聚合物囊泡納米顆粒在生物相容性、生物降解性和穩定性方面比其他類型的納米材料具有顯著優勢[49]。然而，同時將腫瘤環境敏感性、高載藥量、優異的靶向能力和體內安全性等優勢整合到一種基于聚合物的DDS中，仍然是一個巨大的挑戰。由于HA易于化學修飾且對癌細胞具有靶向性，HA及其衍生物在藥物釋放領域已經成為一個極具發展前景的藥物載體。如前面所述，細胞表面的多種受體中，CD44顯得尤為重要，因為CD44涉及到表面受體與HA的相互作用、細胞增殖、特定細胞表面遷移、血管生成、細胞存活和HA的內吞作用等。此外，已經證明CD44受體會在許多腫瘤細胞表面過度表達，這些過度表達與腫瘤發生和腫瘤轉移密切相關[50]?；谶@種受體在癌細胞表面的過度表達，可采取受體介導的靶向策略用于腫瘤診斷和治療。由于HA可以與CD44、LYVE-1、RHAMM和HARE等受體以非特異性方式結合，因此HA可以作為向細胞內遞送抗癌藥物的載體[51]。

HA主要是通過與藥物或藥物載體進行化學連接[52]（圖5）而廣泛應用于藥物釋放領域。HA與藥物結合形成復合物或者與藥物載體（膠束和納米顆粒等）結合，在藥物釋放中表現出諸多優勢。首先，通過將藥物與多糖直接結合可解決藥物的溶解性問題。其次，HA可能會改善藥物的血漿半衰期，減緩清除速率，起到與聚乙二醇相似的作用[53]；再者，由于HA增強的藥代動力學特性，一些HA-藥物復合物和HA-藥物載體具有增強的滲透和保留（EPR）效應，從而提高腫瘤組織中的藥物分布。最后，CD44在腫瘤細胞尤其是癌癥干細胞或循環細胞中過度表達可以提高藥物對癌癥細胞的靶向性。

圖5 HA 衍生物用于藥物釋放的示意圖[54]Fig. 5 Schematic illustration of HA and its derivatives fordrug delivery[54]

為了進一步提高化學藥物治療的特異性，可以采用納米技術設計構造不同類型的刺激響應性藥物釋放系統（SDDS）。SDDS能夠實現在特定位點和時間的藥物釋放，并能降低藥物的毒副作用、增強其治療效果[55]。藥物的控制釋放可以通過各種外部或內部的熱量、溶劑極性、離子強度、生物大分子的作用、電/磁場或光的影響等來觸發，如圖6所示[56]。其中，pH、氧化還原和酶活性被稱為內部刺激；光、磁場和溫度等被認為是外部刺激。SDDS甚至可以響應不同刺激的多種組合，進一步提高其靶向和控制藥物輸送的特異性[56]。

4.1 HA 與藥物形成絡合物

Ringsdorf[57]首先提出制備大分子-藥物絡合物的方法并將小分子疏水性藥物遞送到靶向位點。這種藥物釋放系統主要包含水溶性的聚合物和共價連接的疏水性小分子藥物。該方法的主要優點在于：（1）增加低溶解性或不溶性藥物的水溶性，從而提高藥物的生物利用度; （2）保護藥物免于失活并保持其在循環過程中的活性;（ 3）最重要的是，它可以將藥物遞送到特定的腫瘤組織。

紫杉醇（PTX）是一種強效抗癌藥物，主要用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、食道癌、黑色素瘤、卡波西氏肉瘤和其他類型的實體瘤[58]。然而，由于PTX溶解性差且毒副作用大，使得PTX在抗癌方面的應用受到了一定限制。為了解決這一問題，在20世紀90年代后期有研究者嘗試將PTX與HA結合，以期提高其化療效果并減輕其副作用，結果表明HA載藥量達到20%[59]。起初，這種結合藥物主要用于治療淺表性膀胱癌，后來發現其對過渡性膀胱細胞癌、卵巢癌和胃腫瘤的局部區域治療均有積極作用。

喜樹堿（CPT）是一種抑制DNA拓撲異構酶I的細胞毒性化合物。CPT難溶于水，而且在水中會打開內酯環產生水溶性的CPT羧酸鹽，導致細胞攝取率低，因此會明顯降低CPT的抗癌活性[60]。為了提高CPT的穩定性和溶解性，Fidia制藥公司通過丁酸使CPT與HA結合，體外實驗研究表明HA-CPT對幾種不同的CD44細胞系表現出強烈的體外細胞毒性，而體內實驗表明HA-CPT對結腸腺癌、胃癌、乳腺癌、食道癌、卵巢癌和人肺癌具有明顯的抗癌活性[61]。Xu等[62]以不同分子量的HA為原料，通過ADH與CPT連接制備HA-CPT，研究表明HA的分子量會影響絡合物的水溶性和穩定性，但對絡合物的抗癌活性沒有影響。

圖6 不同物理化學刺激響應性顆粒用于藥物釋放控制示意圖[56]Fig. 6 Schematic illustration of different physical and chemical stimuli exploited for triggering smart nanoparticles in controlled release of drugs[56]

多柔比星（DOX）是用于治療癌癥的最有效化療藥物之一，但同時也會對腎、肝和心臟產生嚴重的毒副作用從而使應用受到限制[63]。Cai等[64]開發了pH響應型的HA-DOX藥物絡合物。與靜脈注射DOX治療相比，腫瘤組織周圍注射等效DOX劑量的HA-DOX可以產生有效的藥物淋巴內遞送和抑制腫瘤生長。此外，組織學研究表明注射HA-DOX后注射部位沒有炎癥或壞死。為了進一步調節DOX的釋放量，HA-ADH被硫醇基團修飾，HA-ADH水溶液發生自凝膠化[65]。在pH和還原雙重響應模式下，DOX持續從凝膠中釋放，這種方法對卵巢或胃癌的局部區域治療效果較好。

順鉑（CDDP）是一種重要的含鉑抗癌藥物，鉑類抗癌藥還有卡鉑和奧沙利鉑。在臨床上，CDDP用于治療不同類型的癌癥，包括肉瘤、軟組織、骨骼、肌肉和血管的癌癥。雖然鉑類具有高效的抗癌活性，但它的劑量依賴性副作用（包括腎毒性、神經毒性和骨髓抑制等）已經嚴重限制了鉑類抗癌藥的應用。為了降低鉑類抗癌藥毒性并增加其在腫瘤部位藥物釋放量，研究者已經設計了幾種合成HA-CDDP絡合物的方案。與標準CDDP制劑相比，HA-CDDP絡合物的淋巴管內遞送不僅顯著增加了局部區域結節組織中的藥物濃度，而且表現出持續釋放動力學，肝臟、脾臟和腎臟中的藥物攝取量增加[66]。另外，研究還報道了HA-CDDP在過表達CD44非小細胞肺癌的體外模型中的選擇性抗癌作用。在最近的體內研究中，當在局部晚期的頭頸部鱗狀細胞癌中給予制劑時，HA-CDDP抗腫瘤功效顯著提高并且毒性降低[67]。

4.2 有機納米材料

4.2.1 HA膠束藥物釋放 兩親性多糖膠束已被廣泛用于遞送水不溶性抗癌藥物，因為它們具有較小的粒徑、核-殼結構、高溶解性、良好的體外穩定性、EPR被動靶向效應、靶向性以及延長的循環周期[68]。設計膠束結構可以將熱敏感或pH敏感組分添加到自組裝共聚物結構中，通過控制外部或內源刺激釋放藥物。水溶性差的藥物可以通過物理方式嵌入或共價連接到聚合物主鏈上，改善藥物的生物利用度，實現藥物持續釋放和降低藥物毒副作用。許多因素均會影響膠束的性質，主要包括結構中親水部分與疏水部分的比例、顆粒大小以及藥物與共聚物的相容性等[69]。雖然膠束有助于增加藥物的水溶性，但它們也存在藥物負載量小、包覆效率低和體內穩定性差等局限性。因此，必須選擇具有某些特定性質的共聚物來制備多功能聚合物膠束克服這些限制。基于HA的膠束載藥體系引發了研究人員的廣泛興趣，HA一方面可作為形成膠束外殼的親水性聚合物，另一方面可賦予膠束CD44癌細胞的靶向性。

通過物理或化學方法包覆藥物的納米載體具有“增強的滲透性和保留（EPR）效應”，能夠將藥物有效運送至腫瘤部位[70,71]。為了利用EPR效應，納米載體需要長時間停留在體循環中才能滲入腫瘤組織，這對于腫瘤靶向運輸至關重要。與單純的HA膠束相比，PEG修飾的HA膠束能更好地聚集在腫瘤部位[72]。然而，由于藥物存在于納米顆粒內部，導致其在腫瘤部位釋放效率低下，成為納米顆粒藥物發揮功效的最大障礙[70]。為了克服這一障礙，可以通過設計刺激響應性納米藥物載體，利用溫度、超聲、光、磁和電化學等外源刺激，觸發藥物從納米載體中高效釋放[48]。另外，基于腫瘤病理生理學表現出的特征變化，如pH、酶活性或氧化還原性質，可作為內部刺激來加速藥物釋放[73]。

眾所周知，癌細胞的生理pH低于血液和正常組織的pH，細胞內早期溶酶體和晚期溶酶體中的pH分別約為6.0和5.0。因此，通過利用腫瘤中的酸性微環境，可以設計pH響應性藥物遞送系統用于細胞外和細胞內藥物釋放，主要有以下3種不同機制：（1）通過引入可質子化基團；（2）載體聚合物含有酸敏感的化學鍵；（3）pH響應型“PEG脫離”，最終實現可在細胞外或細胞內低pH下促進細胞攝取和細胞內藥物遞送（圖7）[70]。

圖7 腫瘤部位pH響應型藥物3種釋放途徑示意圖[70]Fig. 7 Schematic illustration of three pathways for pH-triggered targeted drug release at the tumor[70]

HA可通過其羧基與聚（L-組氨酸）（PHis）（pH敏感型的聚合物）的氨基官能團連接，通過自組裝并負載抗癌藥物（DOX載藥率4%～6%）形成具有腫瘤靶向的共聚物（HA-PHis）。由于PHis能夠在酸性條件下質子化，使得HA-PHis共聚物在其結構中含有pH響應性嵌段，包覆的DOX能夠在癌細胞（較低的pH）中加速釋放（圖8）[74]。研究者基于這一結構進一步設計了HA-PHis和D-α-生育酚（PEG 2000）構成的pH敏感型共聚物用于包覆和釋放DOX，以期克服DOX的多藥耐藥性。與負載DOX的HA-PHis膠束載藥系統相比，這種載藥系統（載藥率10%）對乳腺癌MCF-7細胞表現出強細胞毒性。小鼠體內實驗顯示，在肝臟和腫瘤中均積聚了膠束，而且其濃度隨時間逐漸增加[75]。

圖8 自組裝的HA-PHis膠束和pH敏感型的藥物釋放系統示意圖：（a）DOX包覆的HA-PHis；（b）通過EPR效應載藥顆粒聚集在腫瘤細胞內；（c）通過CD44介導細胞內吞運輸到細胞質，并在細胞質內加速釋放，提高釋放量和抗癌效率[74]Fig. 8 Schematic illustration of self-assembly HA-PHis micelles and pH-responsive intracellular drug delivery: （a） DOX-encapsulated micelles based on HA-PHis copolymers are formed in aqueous condition;（b） Particles of suitable size promote nanocarrier accumulation in tumor tissue by the EPR effect;（c） Micelles are selectively taken up by tumor cells via CD44 receptor-mediated endocytosis and delivered to the lysosomes,triggering the release of DOX into the cytoplasm,improving intracellular drug release and increasing the antitumor efficacy[74]

Zhong等[76]基于HA-樹突寡聚甘油設計開發了一種新型pH敏感的紫杉醇前藥膠束（HA-dOG-PTX-PM），并用于治療CD44過表達的人乳腺癌。HA-dOG-PTX-PM具有較高的載藥量和較小的顆粒直徑，可以實現PTX在pH 7.4條件下緩慢釋放，以及在酸性條件下加速釋放，而且這種膠束對過表達CD44受體的MCF-7人乳腺癌細胞具有靶向性。HA-dOG-PTX-PM在裸鼠體內具有較長的循環時間并且在MCF-7腫瘤中具有較高的積累量，可以有效治療MCF-7人乳腺腫瘤。因此，負載PTX的pH敏感型HA膠束在治療CD44癌細胞方面具有巨大的潛力。

近年來，設計還原敏感型膠束并用于藥物釋放也引起了研究者的廣泛興趣[77]。這些還原敏感型膠束通常在主鏈、側鏈或交聯劑中含有特征性的二硫鍵（SS），在輕度氧化的細胞外環境中二硫鍵相當穩定，而二硫鍵在還原性條件下易于通過硫醇-二硫鍵交換反應在細胞內快速裂解[78]。谷胱甘肽（GSH）在細胞溶質和亞細胞區室中以毫摩爾濃度存在（2～10 mmol/L），而在人血漿中濃度較低（約2～20 μmol/L）。細胞外和細胞內環境GSH濃度的顯著差異是設計還原敏感型膠束的前提。此外，與正常組織相比，腫瘤組織是高度還原型環境，腫瘤細胞質中GSH濃度比正常細胞高幾倍，使得還原敏感型膠束可用于腫瘤特異性藥物和基因釋放[77]。

基于還原敏感型的HA-脫氧膽酸（HA-SS-DOCA）絡合物成功用于紫杉醇（PTX）的靶向細胞內遞送（圖9）[15]。該絡合物在水性介質中自組裝成納米級膠束，對PTX表現出優異的載藥率（34.1%）和包覆率（93.2%）。HASS-DOCA膠束在正常生理條件下可保持穩定，但在20 mmol/L還原劑谷胱甘肽存在下能夠快速分解。HA-SSDOCA膠束通過HA受體介導的內吞作用被攝取到人乳腺癌細胞（MDA-MB-231）。與不敏感對照組相比，載有PTX的HA-SS-DOCA膠束具有更強的細胞毒性、更高的細胞內藥物釋放速率和腫瘤靶向能力。 Zhong課題組[79]研究報道了由HA-b-聚（三亞甲基碳酸酯-二硫戊環三亞甲基碳酸酯）二嵌段共聚物自組裝形成的新型HA二硫化物交聯的可生物降解聚合物膠束（HA-XPS），并用于抗體藥物（mertansin毒素，DM1）的釋放。HA-XPS對DM1具有較高的載藥量和較低的粒徑（約80 nm）。在生理條件下，納米顆粒的藥物滲漏量低；而在腫瘤細胞內，納米顆粒具有快速還原響應性從而導致藥物快速釋放。體內實驗證明HA-XPS-DM1具有高效抗癌效果，為CD44過表達的惡性腫瘤治療提供了一種新穎獨特的方法。

圖9 還原敏感型的HA-SS-DOCA膠束自組裝、腫瘤聚集以及胞內運輸示意圖[15]Fig. 9 Illustration of the self-assembly,accumulation at tumor tissue and intracellular trafficking pathway of redox-sensitive HA-SS-DOCA micelles[15]

在納米膠束的結構設計中同時引入兩種具有刺激響應性的化學結構，即可獲得具有雙重響應型的納米膠束載體，在研究中最為常見的是pH/還原雙重響應體系。pH/還原雙響應型可生物降解的膠束能夠同時在酸性條件下和還原性細胞質中引發藥物釋放，從而產生優異的抗腫瘤效果。例如，通過將磷酸膽堿和DOX化學接枝到HA骨架上制備具有pH和還原雙重響應性的仿生HA前藥膠束[80]。通過對pH敏感的腙鍵將DOX與HA連接，該膠束可在酸性條件下斷裂，從而釋放DOX。HA前藥膠束通過二硫鍵交聯以改善膠束的穩定性。在CD44受體高表達的MDA-MB-231細胞系中觀察到較高攝取量的DOX。這種pH/還原雙響應型膠束可以增強對癌細胞的選擇性抑制并為癌癥治療提供有利平臺。另外，雙重響應型HA膠束可以通過將疏水性6-巰基嘌呤（MP）接枝到硫醇HA，HA膠束可以作為將DOX遞送至結腸癌細胞的藥物載體[81]。藥物釋放研究結果顯示，在GSH存在下，pH 5.0下的藥物釋放量高于生理pH下的釋放量。離體生物分布研究表明，負載DOX的HA-SS-MP膠束在腫瘤區域比在任何其他器官中累積更多。體內實驗結果表明，負載DOX的HA-SS-MP膠束在抑制裸鼠的腫瘤生長方面表現出比游離藥物更好的治療效果。

4.2.2 脂質體 脂質體作為靶向藥物的載體運送藥物至特定細胞已經受到了廣泛研究，并且在提高抗腫瘤功效方面取得了巨大發展。DOX脂質體形式的藥物例如Myocet?或Caelyx?（Doxil?）已經上市[82,83]。與游離DOX相比，脂質體形式的DOX具有高效的抗腫瘤效果。脂質體作為藥物釋放載體主要有3個方面的優勢：（1）可以分別在脂質雙層和水性核中包覆親脂性和親水性活性藥物；（2）基于天然化合物構建的脂質體具有高度的生物相容性和生物降解性，并且表現出低毒性和低免疫原性[84]；（3）脂質體作為多功能的囊泡，可通過調節其結構特別是表面結構來控制腔內藥物釋放的途徑[85]。

HA修飾的脂質體用于靶向CD44表達細胞的藥物釋放研究主要集中在選擇性遞送抗腫瘤藥物（小分子或大分子）[86]。通過兩種基本方法可以將HA嵌入到脂質體膜上：（1）利用HA的羧基與脂質體上的氨基形成酰胺鍵，可以將HA有效包覆到脂質體表面，但必須在每批次上進行包覆，相當耗時[87]；（2）將低分子量的HA嵌入到雙分子層中形成HA修飾的脂質體[88]。如磷脂酰乙醇胺（PE）、二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DPPE）或二羥甲?；视土字?sn-甘油-3-乙醇胺（DiPhPE））的氨基均能夠與HA的羧基形成酰胺鍵，從而將HA與脂質連接，采用該方法可以快速制備HA修飾的脂質體。

Park等[87]制備了由兩親性HA-神經酰胺（HACE）包覆的納米雜化脂質體，用于靶向遞送抗癌藥物和體內成像試劑。與生理pH（7.4）相比，在酸性（pH為5.5和6.8）條件下，脂質體中DOX的釋放速率明顯提高，通過HACE包覆納米雜化脂質體的外表面來減少由空白脂質體產生的細胞毒性。與普通脂質體相比，HA和CD44受體相互作用增強了DOX的細胞攝取。在大鼠的藥代動力學研究中，納米雜化脂質體明顯降低了DOX的體內清除率，表明藥物在血液中循環時間延長并且治療功效提高。

同樣地，Jiang等[89]制備了具有pH響應性多肽和靶向HA的雙功能化的脂質體用于腫瘤靶向藥物遞送（圖10）。通過疏水作用將硬脂酰（R6H4）固定在脂質體表面，構建R6H4修飾的脂質體（R6H4-L）。進而通過靜電效應屏蔽R6H4-L的正電荷構建HA功能化的R6H4-L，以保護脂質體免受血漿蛋白的侵襲。在HA酶處理后，負載紫杉醇的HA-R6H4-L（PTX/HA-R6H4-L）對肝癌細胞（HepG2）顯示出更強的細胞毒性。體內成像表明，當用過量的HA預處理小鼠時，近紅外染料15（NIRD15）負載的HA-R6H4-L（NIRD/HA-R6H4-L）在腫瘤部位的積累量減少，說明脂質體是通過HA與CD44相互作用，從而使PTX/HA-R6H4-L對鼠肝癌（Heps）腫瘤異種移植模型具有高效的抗腫瘤效果。

圖10 PTX/HA-R6H4-L 脂質體的制備及用于藥物釋放示意圖[89]Fig. 10 Schematic illustration of the dual-decorated liposomes PTX/HA-R6H4-L for tumor-targeted drug delivery[89]

盡管低分子量HA本身能促進血管生成而且會引發炎癥，但研究表明用不同分子量HA修飾的脂質體對過度表達CD44的腫瘤細胞增殖無明顯影響[90]。這些納米載體似乎不會引起巨噬細胞活化，而且無論包覆脂質體表面的HA分子量多大，均未觀察到細胞因子誘導。因此，HA修飾的脂質體藥物載體具有較高的生物相容性。

4.3 納米顆粒

納米顆粒是一類不均勻的載體，它們都具有共同的亞微米尺寸，但在組成、結構、制備方法和基質降解方面各不相同，已被廣泛研究用于藥物遞送和成像，主要功能包括控制藥物釋放、防止降解、增強生物利用度和更好的藥代動力學特征、靶向釋放以及更高的藥理學功效。基于納米粒子的PTX配方（Abraxane?）已經上市，盡管它們的毒性低于常規療法，但載藥納米顆粒仍然會導致不良反應。為了進一步增強納米載體的抗癌活性并減少副作用，現在已經廣泛用HA作為靶向劑[91]。許多研究報道了使用HA將納米顆粒靶向于過度表達CD44的癌細胞，并且增加載體血液循環半衰期。獲得HA基納米顆粒的主要方法有：HA修飾的納米顆粒和基于HA的納米凝膠。

4.3.1 HA修飾的納米顆粒 聚合物納米顆?？勺鳛榭拱┲委熤械乃幬镙d體，在某些條件下表現出更強的體內穩定性。由于聚合物種類豐富，納米顆粒制備方法多樣，而且許多合成和天然聚合物具有生物降解性，因此聚合物納米顆粒作為一類安全的藥物載體在藥物釋放中得到了廣泛應用。特別是，脂肪族聚酯與HA結合用于藥物釋放最為常見，如聚丙交酯（PLA）、聚（丙交酯-co-乙交酯）（PLGA）、聚己內酯（PCL）和聚（丁基氰基丙烯酸酯）（PBCA）。將PLGA和HA連接可以獲得具有兩親性的HA-PLGA聚合物，它們能夠形成具有核-殼結構的納米顆粒，其中親水性HA形成納米顆粒的外殼，而疏水性PLGA形成內核。當這種聚合物納米顆粒用于負載DOX時，其載藥量高達11.7%，實驗表明聚合物顆粒是通過受體介導的內吞作用選擇性攝取到CD44過度表達的HCT-116細胞[92]。miR-542-3p是靶向腫瘤抑制因子p53和凋亡抑制劑survivin的有效腫瘤抑制分子。Wang等[93]開發了 HA修飾的聚乙烯亞胺-聚（D,L-丙交酯-共-乙交酯）（PEI-PLGA）納米顆粒系統用于靶向遞送多柔比星（DOX）和miR-542-3p來治療三陰性乳腺癌（TNBC）。該納米顆?？梢杂行Х乐筸iR-542-3p在血清中的降解。HA/PEI-PLGA納米顆粒具有在組合TNBC療法中共同遞送化學藥物和腫瘤抑制性miRNA的潛力，可提高MDA-MB-231細胞的藥物攝取量。

4.3.2 基于HA的納米凝膠 納米凝膠是具有高含水量的納米級網絡，屬于軟性給藥系統，通常具有生物相容性和穩定性，還可以通過與各種分子連接進行化學修飾[94]。在納米凝膠中，親水聚合物可以通過物理或化學作用進行交聯。物理交聯的納米凝膠由聚合物鏈之間通過非共價力（氫鍵、疏水作用和離子鍵）形成，而化學交聯的納米凝膠由聚合物通過形成共價鍵相連接形成，具有較高的穩定性[95]。

Jain等[96]制備了含有5-氟嘧啶（5FU）的HA-殼聚糖納米顆粒（HACTNP）用于靶向治療結腸腫瘤。通過離子凝膠法制備負載5FU的殼聚糖納米粒子，再使用化學法制備HA包覆的殼聚糖納米顆粒。與未偶聯HA的殼聚糖納米粒子（CNTPs）相比，裝載5FU的HACTNP制劑具有更高的細胞攝取量，并且對HT-29細胞系具有更強的細胞毒性。另外，Jain等[97]還制備了含有奧沙利鉑的HACTNPs，用以研究在小鼠結腸腫瘤模型中口服給藥后的體內抗癌活性和體內生物分布。HACTNPs可以將藥物有效運載至腫瘤部位，與CNTPs或游離奧沙利鉑相比具有更有效的結腸腫瘤治療效果。同樣地，HA和殼聚糖可通過自組裝形成聚離子納米復合物，進而基于靜電相互作用包覆帶正電荷的DOX和帶負電荷的microRNA-34a（miR-34a），用于治療三陰性乳腺癌（圖11）。HA與殼聚糖偶聯形成顆粒，而非偶聯到納米顆粒的表面。這兩種藥物在體外和體內均產生協同抗腫瘤作用[98]。

5 HA 及其衍生物在生物醫學中的應用

HA作為人體組織的主要成分之一，在組織工程中的應用受到了高度關注。HA在室溫下具有高度溶解性，并且具有高降解速率，其降解速率主要取決于分子量和在人體內的分布位置。然而這些性質可能成為制造HA支架和保持結構完整性的障礙。為了克服這些障礙，往往需要對HA進行化學修飾和交聯[14]。通過對HA的羧基和羥基化學修飾可獲得HA衍生物，這些衍生物在細胞存在下進行交聯，可用于軟骨再生、傷口愈合以及骨關節炎治療等。

圖11 HA-殼聚糖納米凝膠制備并用于遞送DOX和miR-34a至腫瘤細胞示意圖[98]Fig. 11 Schematic illustration of the construction of HA-CS-based nanosystem for the simultaneous co-delivery of DOX and miR-34a to human breast cancer cells[98]

5.1 軟骨組織工程

關節軟骨是關節的骨表面，它是一種復雜的活組織。關節軟骨的主要功能是提供低摩擦表面，使得關節能夠在進行日?；顒雍瓦\動所需的不同運動范圍內承受壓力。然而，關節軟骨很少或沒有自我修復能力，任何損傷都需要手術干預。這可能是由于軟骨細胞的增殖潛力有限以及它們對病理介質的分解代謝反應和無血管性質阻止了再生細胞的遷移[99]?，F有技術如微骨折、鑲嵌成形術、自體軟骨細胞移植和骨軟骨同種異體移植治療軟骨缺損是緩解疼痛和改善關節功能的主要方法，但這些方法生產的軟骨通常由I型膠原組成，在化學性能和力學性能方面不如透明軟骨。軟骨組織工程的基本原理包括：（1）分離可在體外擴增的細胞；（2）封裝在3維基質中進行增殖或與原位凝膠系統混合；（3）植入/注入損傷部位（圖12）[99]。細胞可以通過培養原代自體/異源軟骨細胞、間充質干細胞和胚胎干細胞獲得，支架必須具備可提供初始力學強度以及保留細胞浸潤、增殖和分化以響應信號分子和機械刺激等性能。軟骨細胞具有高度環境特異性，并且已觀察到整聯蛋白受體與軟骨細胞的相互作用導致產生細胞外分子如II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖[99]。

圖12 軟骨組織工程示意圖[116]Fig. 12 Schematic representation of cartilage tissue engineering[116]

Burdick等[100]研究表明軟骨細胞可以在光交聯的HA網絡上生長，在多孔網絡中產生軟骨。Jin等[101]合成了由葡聚糖-酪胺結合物（Dex-TA）改性的HA，可作為可注射水凝膠應用于軟骨組織工程。與單純的Dex-TA水凝膠相比，在HA-g-Dex-TA水凝膠中培養的牛軟骨細胞具有更強的繁殖能力，該水凝膠作為軟骨組織工程的可注射支架具有很強的應用潛力。同樣地，基于HA和聚乙二醇形成的可注射水凝膠也可用于軟骨組織工程[102]。當軟骨細胞與前體溶液混合時，交聯后獲得具有均勻細胞分布的水凝膠。體外實驗顯示軟骨細胞存活并且發生細胞分裂，凝膠細胞基質在約21 d內降解，在第21 d，糖胺聚糖和II型膠原在水凝膠中積累。

人胚胎干細胞（hESCs）可作為提供軟骨細胞的來源，hESCs在選擇性生長因子存在的條件下衍生得到可擴增的軟骨細胞，用于軟骨修復和再生。Toh等[103]研究表明hESCs衍生的軟骨細胞在HA基水凝膠中培養時產生細胞外基質（ECM）富集的軟骨組織（圖13）。在軟骨缺損模型中，hESCs衍生的軟骨可形成細胞工程軟骨（HCCEC），這些HCCEC在84 d內進入軟骨組織進行有序重建，并與相鄰宿主軟骨完全整合；同時，移植的hESCs衍生的軟骨細胞具有維持長期生存的能力且沒有致瘤性風險，此結果表明HA水凝膠提供了一種安全、高效和實用的生物基材料用于軟骨組織工程。

圖13 軟組織再生過程中HCCEC重塑過程的MicroCT模型[103]Fig. 13 Illustration of MicroCT model of HCCEC remodeling process in cartilage regeneration[103]

5.2 傷口愈合

皮膚作為人體最大的器官，可以保護身體免受微生物、感染、高溫和輻射等方面的危害。燃燒、傷害、刮傷或刺傷等損傷通常會使皮膚產生不規則形狀。雖然輕微的傷口可以在沒有治療的情況下愈合，但是發生嚴重的傷害時，例如真皮層和下面組織產生缺陷，皮膚不會自愈合而且還需要額外治療。許多研究采用制備生物材料用于傷口愈合，特別是基于聚合物的水凝膠，因具有高含水量（超過90%）而作為傷口愈合的敷料引起了很多關注[104]。HA是一種重要的糖胺聚糖（GAG），存在于許多人體組織的細胞外基質中，包括皮膚、結締組織和神經組織。HA可參與傷口愈合過程中的許多步驟，包括炎癥和表皮再生。在傷口愈合的早期階段，HA提供了一種基質來幫助成纖維細胞和內皮細胞的重組、增殖和遷移。此外，HA在傷口愈合過程中能夠促進血管生成。有趣的是，各種研究證明HA在胎兒無疤痕愈合中起關鍵作用。綜上所述，基于HA水凝膠的生物材料在促進皮膚傷口愈合方面具有廣闊的應用前景[105]。

Kirket等[106]開發了一種腙交聯的HA水凝膠薄膜，可顯著促進表皮再生。研究發現，包含膠囊化促血管生成血管內皮生長因子質粒（pVEGF）的HA化學交聯水凝膠，在糖尿病小鼠傷口愈合模型中表現出促進傷口快速愈合的能力[107]。但是，這些化學交聯的HA水凝膠缺乏可塑性和自我修復的動態性質，無法填充不規則形狀傷口。最近Shi等[108]制備了動態金屬-配體用于制造具有自修復特性的可塑性超分子HA水凝膠（圖14）。為了實現HA分子鏈的可逆交聯，利用碳二亞胺偶聯和點擊反應制備雙膦酸鹽（BP）修飾的HA，向含有BP基團的HA溶液（HA-BP）中添加銀離子（Ag+）便可立即形成水凝膠（HA-BP-Ag+）。與此前其他基于HA的水凝膠相比，HA-BP-Ag+水凝膠非常適合臨床應用，因為可以填充不規則形狀的傷口缺陷而無需預先成型。HA-BP-Ag+水凝膠對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌菌株均具有抗菌特性，可預防傷口護理中的感染。通過大鼠全層皮膚傷口模型的體內評估顯示，與未經治療的對照組相比，治療組的傷口殘留率顯著降低并且再生表皮層更厚。這種具有即用特性的可模塑和自愈合超分子HA水凝膠在傷口愈合上表現出巨大的應用潛力。

圖14 （a）HA-BP 的合成示意圖；（b）HA-BP-Ag+的合成示意圖；（c）HA,HA-BP,Ag+的 UV-Vis譜圖[108]Fig. 14 （a）Schematic illustration of synthesis of HA-BP derivative; （b） Schematic illustration of synthesis of HA-BP-Ag+; （c） UV-Vis spectra of native HA,HA-BP,free Ag+ ions,and mixtures of different HAs with Ag+ ions[108]

Wang等[109]報道了一種新合成的傷口愈合制劑（REG），將其嵌入在HA基水凝膠敷料中用于增強急性切除傷口的修復。HA基水凝膠主要利用二苯并環辛基官能化的HA與4-臂聚（乙二醇）疊氮化物，通過無銅點擊化學交聯制備。HA基水凝膠含有REG肽（一種紅細胞分化調節劑），具有高效的細胞刺激能力，可持續釋放生理活性肽。HA有助于傷口愈合，再加上HA基水凝膠中的REG，可以加速皮膚傷口愈合。REG-HA凝膠不僅提高了傷口愈合率，而且提高了膠原蛋白沉積量，同時提高了微血管的形成。因此，嵌入活性肽的HA基水凝膠有望作為一種新型的傷口敷料用于治療不同類型的傷口。

5.3 術后防黏連

黏連是由廣泛的間質液滲漏引起的纖維蛋白交織引起的，常見于手術切口、創傷和其他病理情形中[110]。當富含毛細血管的顆粒組織逐漸取代壞死組織時，原位形成纖維蛋白網絡，最終可導致纖維蛋白黏連和隨后的組織功能障礙。一般而言，在損傷后3 h內形成纖維蛋白的膠體基質，標志著肉芽組織浸潤的開始。成纖維細胞和巨噬細胞與纖維蛋白基質一起聚集到局部受損組織，在1～3 d形成肉芽組織[110]。隨后第4 d成纖維細胞和巨噬細胞數量的增加有助于形成纖維蛋白網絡。在損傷后大約14 d，在原位形成纖維黏連，同時網絡中的大多數細胞消失。手術后腹膜黏連可能引起慢性疼痛、不孕、甚至致命的腸梗阻[111]，是十分常見且嚴重的并發癥。在先前剖腹手術患者的臨床和尸檢研究中，腹腔內黏連的發生率高達90%。體內黏連主要包含肌腱黏連、心包黏連、腹部黏連、硬膜黏連和宮內黏連等（圖15）[110]。

圖15 組織黏附示意圖[110]Fig. 15 Illustration of tissue adhesion[110]

防止黏連的常用策略在于治療受損組織或生物材料。基于組織治療的方法涉及切斷黏連形成過程，特別是通過減輕局部組織的炎癥和滲出，抑制纖維蛋白的沉積和凝結以及保護傷口表面免受摩擦。作為產生纖維蛋白和引發組織過度生長的主要細胞類型之一，成纖維細胞是抗黏連治療的目標，在臨床實驗中也廣泛研究了如何抑制這些細胞的生成?；谏锊牧系姆椒ㄍǔ＠貌牧系奈锢砗突瘜W性質來實現抗黏附，生物材料作為抑制黏附形成的物理屏障或生物活性劑。許多局部或全身性抗炎藥和抗凝藥，包括阿司匹林、地塞米松和肝素，在預防術后黏連上都沒有達到令人滿意的臨床效果[112]。物理屏障系統常用于防止黏連，主要有聚合物溶液、預成型固體片和水凝膠等[113-115]。其中一些已經商品化，如HA溶液（Sepracoat?，Genzyme，Cambridge，MA）、氧化纖維素（Interceed?，ETHICON Women's Health and Urology，Somerville，NJ）和 HA 鈉-羧甲基纖維素膜（Seprafilm?，Genzyme，Cambridge，MA）[116]。然而，對于聚合物溶液，如N,O-羧甲基殼聚糖（NOCC）、HA和羧甲基纖維素（CMC）的功效持續時間都很短。對于固體阻擋片，實現受傷表面完全覆蓋是比較困難的，操作上也很難將這些材料固定到受損組織上，從而影響其預防黏連的有效性。

可注射的原位交聯水凝膠系統受到了廣泛關注[106,116-118]，許多基于HA的交聯水凝膠已被用作阻止黏連的屏障。然而，相對較長的膠凝時間是不切實際的[119]。此外，一些保留相當長時間（超過7 d）的水凝膠也可能危及腹膜傷口的愈合過程[120]。因此，開發一種安全、有效、便于給藥且具有適當體內保留時間的抗黏連劑仍是一個巨大的挑戰。Li等[116]報告了一種由羧甲基殼聚糖（NOCC）和醛基功能化的HA（A-HA）制備的可注射、可生物降解和無毒的水凝膠。通過將羧甲基引入殼聚糖的N-位和O-位來制備NOCC，并使用高碘酸鹽氧化法制備A-HA。凝膠化主要是利用NOCC的氨基與A-HA中的醛基之間發生Schiff堿反應。NOCC、A-HA和NOCC/A-HA水凝膠表現出非常低的細胞毒性和溶血性，急性毒性實驗也表明水凝膠是無毒的。高度多孔的3維水凝膠有利于包裹在水凝膠中的細胞生長和增殖，不利于成纖維細胞附著到表面，這表明可以開發NOCC/A-HA水凝膠用于防術后黏連。此外，他們采用側壁缺損-盲腸磨損大鼠模型來研究NOCC/A-HA水凝膠在預防術后腹膜黏連中的功效。與HA水凝膠和生理鹽水組相比，在NOCC/A-HA處理組中腹膜黏連顯著減少。Amano等[121]制備了3價鐵離子螯合的HA衍生物水凝膠。先利用亞氨基二乙酸（IDA）修飾HA獲得HA衍生物（HA-IDA），其修飾程度為其二糖單元HA的22%，而且HA-IDA具有與HA幾乎相同的降解速率。HA-IDA通過與鐵離子（Fe3+）交聯形成水凝膠（FeHA-IDA）。FeHA-IDA顯示出對間皮細胞系優異的生物相容性。最重要的是，FeHA-IDA可以大幅減少大鼠側壁缺損-腸道磨損模型中的黏連形成。

5.4 骨關節炎治療

骨關節炎（OA）是一種全球性關節疾病，主要是由機械應激、促炎細胞因子和基質降解蛋白酶破壞細胞外基質（ECM）而引起的，這種疾病已經成為50歲以上患者生活質量降低的最主要原因之一[122,123]。關節潤滑是降低兩個關節表面之間的摩擦力并減少關節磨損的重要措施，關節潤滑劑已經成為治療骨關節炎的關鍵成分。許多研究者針對軟骨中的摩擦和磨損過程以及潤滑機理進行了深入探究[124]，關節液中的成分（如潤滑素、脂質和HA）在關節潤滑中發揮著重要作用，特別是其中的HA，由于具有獨特的黏彈性，有助于改善潤滑液的潤滑作用。當高分子量HA以高濃度溶解時，HA分子通過鏈內和鏈間相互作用形成物理交聯的分子網絡。在HA網絡中，一條HA鏈的疏水區可與另一條HA鏈的疏水區可逆地相互作用，表現出與單個HA鏈不同的性質。當長時間施加應力時，HA鏈緩慢移動并在網絡中排列整齊，表現出黏性特性，HA鏈還能在短時間內抵抗快速應力并恢復到原始狀態，表現出彈性性質[125]。此外，HA可以與組織表面的蛋白質潤滑素相互作用[126]。

圖16顯示了軟骨中HA/潤滑素復合物用于關節潤滑的作用機理示意圖[127]。HA作為關節中的電流體動力和邊界潤滑劑，可以避免關節磨損。當施加生理壓力時，通過在狹窄區域中的HA來減少軟骨組織的變形。具體而言，與潤滑素復合的HA分子在低壓下松散地纏結并在膠原和滑液中延伸，而在高負荷壓力下，由負載和剪切力引起的組織變形可以誘導在狹窄區域膠原網絡中的HA提供額外的磨損保護。因此，關節潤滑用HA治療旨在增強關節中滑液的黏彈性。

圖16 HA在低壓（左）和高壓（右）條件下，在關節接觸區域的作用機制示意圖[127]Fig. 16 Schematic illustration for the “mechanical trapping mechanism” of HA in the joint contact area during the physiological sliding under low （left） and high （right） pressure[127]

隨著OA的惡化，HA的分子量和濃度降低，滑液的黏度變得太低而不能潤滑關節[128,129]。由于滑液的降解不能提供潤滑作用，從而導致關節疼痛[130]。通過向關節腔內注射游離HA用于減輕關節疼痛已經得到了廣泛應用。關節內游離HA可以減震、促進蛋白多糖合成和提供關節潤滑[131]。特別是高分子量的HA對于減少摩擦和吸收沖擊非常有用。除天然HA外，潤滑脂修飾的HA可以提供更高的磨損保護[126]?，F在已經開發了許多HA制劑用于OA的臨床治療。來自生物發酵的HA是高純度物質并且不含任何致敏蛋白，并且已經以商品名Sinovial?、Adant?、Arthrum?、Durolane?、Euflexxa?、Fermathron?、Jointex?和 Hyalubrix?實現了商業化應用。不同分子量的HA具有不同的關節潤滑效果。相對較低重均分子量的HA（5×105～10×105）對于減輕滑膜炎癥是有效的，而高重均分子量HA（5×106～10×106）具有黏彈性。低分子量HA的代表性產品是 Sinovial?（8×105～12×105）和 Hyalgan?（5×105～7×105），高重均分子量 HA 的典型產品是 Synvisc?（6×106）。

然而，在生理條件下，HA通過酶或者水解反應迅速降解，從而導致HA在體內被迅速清除[38]。來自臨床實驗的結果證明，HA的功效很大程度上取決于HA的分子量?，F在有很多HA商品化的產品包括相對低分子量的HA制劑（Hyalgan和ARTZ），中等分子量但低于正常關節液中的HA制劑（ORTHOVISC），以及高分子量的交聯HA（Hylan，SYNVISC）?，F有證據表明，OA治療期間注射HA唯一的潛在危險就是關節感染、無菌性關節炎和炎癥[132]，而且其毒副作用直接依賴于注射次數。盡管采用低分子量HA制劑治療骨關節炎似乎是有效的，但是相對低分子量的HA制劑需要更多的注射次數，這可能導致更高的成本和感染機率。為了延長HA在關節炎中的治療效果并降低由于多次注射引起的感染風險，現在有研究者通過化學交聯HA形成水凝膠來延長降解時間，提高治療效果。Barbucci等[132]合成了HA新型水凝膠，通過控制化學計量反應和條件來預測最終所需的交聯度，從而獲得具有高度可再現特性的凝膠。在一系列基于HA的水凝膠中，他們選擇交聯度50%的水凝膠（Hyal 50%）研究其潛在應用價值。在OA治療中，他們研究了HA水凝膠的流變行為，特別研究了HA水凝膠是否具有可注射性。體內實驗證明HA水凝膠對兔膝關節中軟骨缺損具有治療效果。

圖17 HA流動凝膠的制備及骨關節炎治療示意圖[133]Fig. 17 Schematic representation of the formation of HA-based viscosupplements for osteoarthritis treatment[133]

為了進一步克服HA在關節腔內快速降解問題以及商品化的HA凝膠生物相容性低等問題，本課題組基于乙烯基砜改性的HA與巰基功能化的PEG，通過點擊化學方法制備了一種新型的、高度生物相容性的HA凝膠（HA-VS / SH-2-PEG）[133]。將 HA-VS / SH-2-PEG 微凝膠添加到 HA 溶液中制得具有黏彈性可調和、降解速率可控的可注射流動凝膠（圖17）。可注射流動凝膠表現出增強的黏彈性性能、較高的潤滑性能與藥物（曲安奈德）負載能力、良好的抗降解性能、高度的生物相容性以及體內抑制骨關節炎惡化的能力。總體而言，此流動凝膠為骨關節炎的臨床治療提供了技術指導及研究方向。

6 結 論

隨著對HA在人體中作用的日益了解，HA在許多生物學與病理學過程中的重要作用被不斷揭示。由于HA具有獨特的黏彈性、持水性、生物相容性、非免疫原性以及靶向性，自被發現80余年來，在諸多領域特別是生物醫藥領域受到了廣泛關注與應用。HA分子中含有羥基、羧基和乙酰氨基等官能團，通過化學修飾可制備得到HA衍生物以及HA基生物材料，進一步擴大了HA的應用領域和范圍。由于癌細胞表面含有大量HA受體，基于這一特點可以利用HA構建不同類型的藥物載體用于靶向藥物治療。

然而需要指出的是，之所以HA及其衍生物被廣泛應用于藥物釋放領域，主要是利用其對癌細胞上的CD44受體具有高度靶向性，因此當化學修飾HA時，繼續保持其對CD44受體特異性結合能力尤為重要。由于HA分子鏈與CD44的特異性結合最少涉及6～8個糖單元[134]，對HA的過度化學修飾可能會改變其生物學功能。本課題組研究表明[135]，35%的羧基被取代后的HA仍能保持結合CD44的能力，但68%的羧基被取代的HA則失去了其CD44靶向性。目前，詳細研究化學修飾對HA與CD44之間相互作用影響的文獻尚不多?？紤]到羧基對于保持HA獨特生物學功能的重要性，必須確保改性HA衍生物制備的納米材料具有CD44靶向性。分子量過低的HA會引發炎癥等副作用的問題也需得到重視[16]。此外，利用HA來修飾一些功能性無機納米材料（如磁性納米粒子、量子點、碳點、石墨烯及其衍生物、碳納米管、介孔二氧化硅等）的研究，近些年也有了很大進展。這類雜化材料的水分散性和生物降解性得以改善，毒性也得以降低并被賦予了靶向性，更能滿足藥物傳遞的嚴格要求[40]。

HA獨特的生理功能也使得HA基材料在組織工程中得到了廣泛應用，包括傷口愈合、軟骨再生、術后防黏連和骨關節炎治療等。需要特別指出的是，盡管HA作為基礎材料在生物醫藥中的應用已有數十年的研究和探索，但是目前對HA基材料的細胞功能及其作用機制的認識仍然十分缺乏，HA在動物體中的功能和作用機理尚有待進一步揭示。如HA在不會患癌裸鼴鼠臟器內的多級結構和特殊功能受到重視。HA在臟器內形成高度折疊的結構，而且其特征形態取決于組織類型。裸鼴鼠皮膚中的HA形成緊密包裝的組件，除了對水具有很強的親和力外，還具有類似于彈簧的力學性能。裸鼴鼠腦中的HA形成3維折疊結構，類似于人腦的回球和溝的外觀。裸鼴鼠肺中的HA形成了無法折疊的交織網眼，其形態類似于雪人。另外，HA是非凝膠多糖，但HA在裸鼴鼠體內不需化學交聯便能形成強凝膠，脫水或反復加載后，HA凝膠從黏彈性急劇轉變為類彈性物質[136]。盡管已經認識到這些形態各異的HA在裸鼴鼠抗癌中起到根本作用[137]，但HA在裸鼴鼠不同臟器內的精細聚集體結構和分子構象及形成機理尚不清晰。因此，了解HA在正常和疾病環境中的作用及其潛在機制可能為開發針對這些疾病的HA基材料提供新思路和新技術途徑。此外，在某些醫療應用領域，如骨關節炎外源性黏彈性補充治療和術后防黏連，由于并不要求HA材料具有超高力學性能和超長穩定性，這使得不需化學改性和交聯，僅由物理改性和交聯（如采用凍融法處理）能完全保留HA自身功能性和特性的生物材料的開發成為可能。這類物理交聯的生物材料在使用安全性方面具有優勢。