鋰藻土基可注射材料制備及其體外成骨分化

張澤人， 李亞民， 劉天舒， 蔣 佳， 趙金忠， 李玉林， 劉昌勝

（1. 華東理工大學材料科學與工程學院，教育部醫用生物材料工程研究中心，上海 200237；2. 上海交通大學附屬第六人民醫院，上海 200233）

近年來，交通事故及人口老齡化引起的骨科疾病日益增多，嚴重威脅人類身體健康和生活質量。人工骨具有安全、結構可設計和來源豐富等優點。其中，可注射人工骨材料可通過微創注射的方式植入不規則骨損傷處，降低手術的復雜性，減少病人的痛苦[1,2]，因而獲得了廣泛關注。然而，當前的可注射人工骨材料通常存在著制備工序復雜、組成復雜、骨修復活性較低和成骨能力差等缺點[3]。通過簡單的組成和操作制備出高成骨活性的可注射人工骨材料，成為當前骨修復研究的熱點和難點。

眾所周知，天然骨主要由I型膠原纖維有機相和羥基磷灰石（HAp）無機礦物相組成，作為天然骨的主要礦物相成分，HAp占整個骨組織的70%，天然骨中的HAp主要是由鈣磷組成的六方晶系結晶體（長40～60 nm，寬20 nm，厚1.5～5 nm）。這些納米棒鑲嵌在I型膠原纖維之間，共同構成了骨的基本結構，天然骨有機無機相的獨特組成和結構組裝不但賦予了天然骨優異的強度和韌性，而且賦予了其強大的自我更新能力[4]。天然骨中HAp納米棒通常具有不太完善的半晶結構，這種結構使其在維持較高強度的同時具有一定的生物可吸收性能，能及時地參與到骨整合和骨重塑的動態過程中。HAp可釋放出鈣磷等離子，利于促進成骨相關細胞的黏附、增殖或分化，同時其獨特的納米棒結構，能明顯促進成骨誘導活性。因此，近年來人們研究了不同形狀HAp的成骨性能，并制備了多種摻雜HAp的復合材料。Priya等[5]通過化學沉淀法制備了球形（長徑比2.12）和稻米形（長徑比3.19）兩種不同形狀的HAp，結果表明長徑比2.12的HAp成骨活性更高。Kim等[6]以聚乳酸為基體，HAp作為納米增強材料通過3D打印技術制備的復合纖維長絲，是一種潛在的骨修復材料。Ding等[7]制備了絲素蛋白/海藻酸鈉/HAp復合可注射水凝膠，體外研究表明材料具有良好的細胞相容性和一定的成骨活性。然而，當前的HAp可注射材料制備過程較為復雜，且可注射性和可塑性不足[8]。

鋰藻土（LP）作為一種合成的硅酸鹽納米材料，具有明確的化學組成和結構，可避免天然黏土中存在的雜質帶來的毒副作用。當分散到水中后，LP會逐漸剝離成均勻分散的納米盤狀結構，納米盤的直徑為25 nm、厚度為0.92 nm，納米盤邊緣呈現正電性，中央帶有負電荷。這一獨特的電荷分布使LP能在水溶液中自組裝形成觸變性的凝膠材料，因而可作為可注射材料的理想候選。同時，LP具有生物降解性，可在降解過程中釋放原硅酸和Mg2+、Li+，其中Li+有利于干細胞的增殖和成骨向分化[9]，Mg2+有利于干細胞的礦物沉積和成骨向分化[10]，原硅酸利于干細胞的遷移、黏附、鋪展及成骨向分化[11]。Gaharwar等[12-14]研究表明在各種人工合成高分子材料中引入LP能夠有效增加細胞的黏附和增殖，同時LP能夠在無因子的情況下促成人骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化。Dawson和Gibbs等發現LP可有效吸附生物活性因子血管內皮生長因子（VEGF）[15]、骨成型蛋白2（BMP-2）[16]，提高生物活性因子穩定性和生物活性。Nagahama等[17]發現LP能夠強烈吸附生物活性蛋白和多糖類細胞外基質。Gaharwar等[18]利用LP自組裝的特性制備了高質量濃度（90 mg/mL）LP黏性材料，巨噬細胞共培養結果表明LP沒有明顯的細胞毒性和趨炎作用。盡管如此，LP缺少鈣磷成分且在體內缺乏足夠的骨傳導性[19]。目前很少有關于LP作為基體材料摻雜其他無機材料的研究，我們設想將具有良好骨誘導能力和可注射性的LP與具有良好骨傳導性的鈣磷材料相結合，開發出一種高活性可注射骨再生活性材料。

基于此，本研究通過化學沉淀法合成了HAp納米棒，并將其摻雜到LP分散液中，通過后者的分散黏性化特性發展了具有觸變性的鋰藻土羥基磷灰石復合可注射材料（LHIM），并與純LP可注射材料（LIM）進行對比研究。通過Transwell實驗研究材料對干細胞遷移活性的影響；用掃描電鏡觀察細胞在材料表面的黏附形態；通過堿性磷酸酶活性染色評估材料的成骨活性，最后通過免疫熒光染色法初步研究了材料成骨機理。結果表明，LP的存在可有效抑制HAp的團聚，形成的雜化可注射材料利于干細胞的遷移、黏附，有效促進干細胞的骨向定向分化。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

四水合硝酸鈣（Ca（NO3）2·4H2O）、氨水（NH3·H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、無水乙醇、肝素、L-抗壞血酸、丙酮、氯化銨（NH4Cl）：分析純，上海泰坦化學試劑有限公司；磷酸氫二銨（（NH4）2HPO4）：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；戊二醛：w=25%，上海麥克林生化科技有限公司；鋰藻土（LP）：分析純，洛克伍德公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）：分析純，美國GBICO公司；3-[雙（2-羥乙基）氨基]丙烷-三乙氧基硅烷：分析純，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司；透析袋：Mw=14×104，25 mm扁寬，上海源聚生物科技有限公司；新西蘭大白兔骨髓間充質干細胞（rBMSCs）：上海交通大學附屬第六人民醫院提供；DMEM培養基、青霉素/鏈霉素雙抗：分析純，美國 GE Healthcare HyClone公司；FITC-鬼筆環肽、Runx2抗體、骨鈣蛋白（OCN）抗體、Alexa Fluor 488-羊抗兔 IgG 抗體、羅丹明標記鬼筆環肽、4，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）：分析純，美國 Abcam公司；牛血清蛋白（BSA）：分析純，中國賽默飛世爾科技有限公司；HRP-羊抗兔IgG二抗：美國CST公司；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X 100）：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 測試與表征

X 射線衍射儀：瑞士梅特勒托利多國際股份有限公司 AL104 型，Cu 靶，40 mA，40 kV，3（°）/min；傅里葉變換紅外光譜儀：美國賽默飛世爾公司 Nicolet 6700型，溴化鉀壓片，波長范圍為 4 000～500 cm?1；等離子體發射光譜儀：美國 PerkinElmer公司 Agilent 725 ICP-OES 型；激光共聚焦顯微鏡：日本尼康公司 Zeiss LSM510 型；透射電子顯微鏡：日本電子株式會社JEM-1400型；掃描電子顯微鏡：日本日立集團公司S-4800型；倒置顯微鏡：日本Nikon公司。

1.3 實驗過程

1.3.1 化學沉淀法制備納米級 HAp 顆粒 首先分別配制 400 mL 0.08 mol/L 的 Ca（NO3）2·4H2O 水溶液和240 mL 0.048 mol/L 的（NH4）2HPO4水溶液。之后滴加氨水調節（NH4）2HPO4溶液的 pH 至 10～12，并在強磁力攪拌條件下將Ca（NO3）2溶液快速倒入調好pH的（NH4）2HPO4溶液中，再次滴加氨水維持混合溶液的pH至10～12，在30 ℃下反應24 h。最后，真空抽濾反應溶液，并用超純水和乙醇交替洗滌濾餅3～4次后凍干24 h得到納米HAp顆粒。

1.3.2 LHIM 的制備 稱取 100 mg HAp 分散于 5 mL 超純水中，超聲 10 min 至 HAp 充分分散形成乳白色懸浮液。將300 mg LP粉末與HAp懸浮液混合后劇烈震蕩30 s，繼續超聲10 min至混合液失去流動性，最后將混合液置于37 ℃恒溫恒濕箱24 h用以穩定體系，最終得到LHIM。

作為對照組的LIM制備過程如下：將300 mg LP粉末與5 mL超純水混合后劇烈震蕩30 s，繼續超聲10 min至分散液失去流動性，最后將分散液置于37 ℃恒溫恒濕箱24 h用以穩定體系，最終得到LIM。分別將LHIM和LIM凍干成粉末。采用X-射線衍射儀表征兩種粉末的晶態和結構，傅里葉變換紅外光譜儀表征兩種粉末的官能團，帶能譜儀的掃描電鏡研究兩種粉末的表面形態以及元素分布。

1.3.3 LHIM 的體外離子釋放 在透析袋內加入 1 mL PBS（pH=7.4）溶液和 1 mL LHIM 并放入裝有 9 mL PBS的 15 mL 離心管中，置于 37 ℃ 恒溫搖床（80 r/min）中進行緩釋，分別在緩釋的 1、3、5、7、14 d 對離心管內的PBS溶液進行收集和更新。用等離子體發射光譜儀對收集的溶液進行Ca、Mg、Li、Si元素含量分析。每組準備3個平行樣進行實驗。

1.3.4 rBMSCs的接種 將可注射材料注射到12孔板底部，并均勻涂覆，向每個孔板中加入1 mL PBS溶液以保持材料濕潤，紫外照射24 h對材料進行滅菌后將PBS吸出，之后在每個孔加入3萬個細胞的rBMSCs懸液（體積分數1%青霉素鏈霉素雙抗的DMEM培養基，體積分數10%的血清，1 mL），并在37 ℃，體積分數5%的CO2條件下培養，隔天換液。

1.3.5 復合可注射材料表面干細胞的黏附表征 按照1.3.4的步驟接種細胞，材料與干細胞共培養24 h后將培養液吸出，用無血清的DMEM培養基緩慢漂洗以去除未黏附在材料表面的細胞，吸出培養基后以質量分數2.5%的戊二醛固定細胞20 min后，吸出戊二醛溶液，再用PBS清洗以徹底去除殘留的戊二醛溶液，之后依次用質量分數25%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的梯度乙醇溶液進行脫水處理，每個濃度乙醇脫水5 min，最后在37 ℃烘箱中干燥24 h，以掃描電鏡對細胞黏附形態進行觀察。

1.3.6 復合可注射材料表面細胞死活染色 通過死活染色觀察LIM以及LHIM材料上的死細胞和活細胞數量來分析其細胞相容性。按照 1.3.4的步驟接種細胞，材料與細胞共培養1、3、7 d后，吸走培養基，依次加入適量的由 1 mL FITC（5 mg/mL，溶劑為丙酮）和 1 μL PI（5 mg/mL，溶劑為 PBS）配制的染色工作液，25 ℃ 避光染色15 min后用PBS進行漂洗，通過熒光倒置顯微鏡觀察結果，用Image J軟件進行半定量分析。

1.3.7 復合可注射材料對細胞遷移能力的影響 采用膜孔徑為8 μm的聚碳酸酯膜Transwell 12孔板研究LIM和LHIM對rBMSCs遷移能力的影響。具體實驗步驟如下：使用無血清培養基對細胞進行24 h的饑餓處理。在細胞重懸液體內加入2%（體積分數） FBS，將細胞接種至Transwell的上室（每個孔加入500 μL，細胞密度為每孔105個）。在下室加入LIM或LHIM。培養24 h后，移去上室內的培養基，用棉簽將上室細胞擦去，使用顯微鏡觀察結果，用Image J軟件進行半定量分析。

1.3.8 復合可注射材料堿性磷酸酶染色 堿性磷酸酶（ALP）染色的實驗步驟：將可注射材料均勻鋪在12孔板底部，向每個孔板中加入1 mL PBS溶液保持材料濕潤，紫外照射24 h滅菌后將PBS吸出，rBMSCs接種密度為每孔3×104個，在普通培養基，37 ℃，體積分數5%的CO2條件下培養7 d后移去培養基，每個孔板用PBS沖洗2次以洗去多余的培養基，使用質量濃度40 g/L的多聚甲醛溶液于室溫下固定15 min，用PBS清洗3次以洗去多余的多聚甲醛，加入四唑氮藍/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（NBT/BCIP）染液，室溫下孵育12 h，用PBS清洗3次以洗去多余染液，在室溫下干燥后拍照觀察，用Image J軟件進行半定量分析。

1.3.9 復合可注射材料免疫熒光 采用免疫熒光法進一步研究LIM和LHIM對rBMSCs的成骨誘導活性。將適量可注射材料與普通培養基在37 ℃條件下混合4 d，離心分離培養液獲得LIM材料和LHIM材料萃取培養液。將rBMSCs（每孔3萬個細胞）在材料萃取培養液條件下孵育14 d后，用體積分數4%的多聚甲醛進行固定細胞，之后以體積分數0.1%的Triton-X 100在室溫條件下透膜10 min，并以1%的BSA溶液封閉抗原30 min。在4 ℃下將細胞與500倍稀釋的OCN抗體和Runx2抗體溶液孵育過夜。對OCN和Runx抗體進行回收，再以 PBS 反復仔細清洗 3 次，在孔板中加入上述兩抗體（500 μL、10 μg/L，Alexa Fluor 488 標記）在室溫下對Runx2和OCN染色2 h。移去培養基，用PBS反復仔細清洗5次，進一步用羅丹明標記的鬼筆環肽染色細胞肌動蛋白30 min，DAPI染色細胞核15 min，以PBS反復仔細清洗3次。倒置熒光顯微鏡下觀察，用Image J軟件進行半定量分析。

1.3.10 數據統計分析 本文中的數值數據均以平均值±標準偏差表示。統計分析采用單因素方差分析，在p＜0.05時被認為具有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 材料表征

圖1為所合成HAp的透射電鏡圖。HAp顆粒呈長 25～35 nm，寬 10～20 nm 的納米棒狀結構。圖2為各樣品的X射線衍射圖。LHIM除了有HAp 的特征衍射峰外，在 2θ=28.1°和 2θ=17.6°還有LP水化后特有的衍射峰。圖3為各樣品的紅外光譜圖。LHIM 在 3 440 cm?1處的吸收峰為羥基的伸縮振動峰，1 032 cm?1處為磷酸根的伸縮振動吸收峰，563 cm?1和 602 cm?1處是磷酸根的變形振動峰，1 300～1 000 cm?1處寬而強的吸收峰來自于 LP 的Si―O―Si鍵。以上結果均表明了LHIM材料的成功制備。

圖4為各樣品的掃描電鏡圖。結果表明LIM表面十分平整，而LHIM表面有明顯的礦化結構。進一步對LIM和LHIM的X射線能譜結果進行分析，圖5表明LHIM中的Mg、Si、Ca和P元素分布十分均勻，其中Si和Mg元素均為LP所含元素，Si、Mg元素分布均勻表明LP在材料中無明顯團聚。Ca和P元素均為HAp中元素，Ca和P元素分布均勻表明HAp在材料中無明顯團聚。因此，掃描電鏡和X射線能譜的結果表明由于HAp的引入，LHIM表面呈明顯的礦化結構且HAp和LP在復合材料中均勻分散無明顯團聚。

圖1 HAp 的透射電鏡圖Fig. 1 TEM image of HAp

2.2 復合可注射材料的體外離子釋放

圖6為LHIM在體外的離子釋放曲線。結果表明，LHIM可以釋放出Ca2+、Mg2+等利于成骨的離子，在5 d以后各種離子的釋放速率開始趨于平穩并達到平衡。其中Si是LP納米盤的骨架結構，Si的大量釋放意味著材料骨架結構的破壞與降解。

圖2 LIM、HAp 和 LHIM 的 XRD 圖譜Fig. 2 XRD patterns of LIM、HAp and LHIM

圖3 LIM、HAp 和 LHIM 的 FT-IR 譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of LIM,HAp and LHIM

2.3 復合可注射材料的細胞相容性

圖7為rBMSCs在材料表面的黏附圖。結果表明，rBMSCs能在LIM和LHIM材料表面黏附，而且LHIM材料表面細胞黏附的形態更好，表明LHIM材料的細胞相容性更好，這可能是由于LHIM表面較為粗糙更利于細胞黏附。圖8細胞死活染色分析結果顯示，rBMSCs在LIM和LHIM材料表面均生長良好，表明兩種材料均能夠支持細胞的生長，且1 d時LHIM材料表面細胞更多更密集。以上結果說明LIM和LHIM材料均具有良好的細胞相容性。

圖4 LIM 和 LHIM 的 SEM 圖Fig. 4 SEM images of LIM and LHIM

圖5 LHIM 樣品的 EDS 圖譜Fig. 5 EDS spectra of LHIM

圖6 LHIM 的離子釋放曲線Fig. 6 Ion release curves of LHIM

圖7 rBMSCs在 LIM 和 LHIM 上培養 1 d 的 SEM 圖Fig. 7 SEM images of rBMSCs cultured on LIM and LHIM after 1 d

2.4 復合可注射材料對干細胞遷移能力的影響

圖9為rBMSCs的Transwell實驗結果。結果顯示LIM和LHIM均能提高干細胞的遷移能力，且LHIM提高干細胞的遷移能力更強，可能的原因是由于LHIM中的HAp能釋放鈣離子，從而進一步提高了干細胞的遷移能力。

2.5 復合可注射材料成骨活性

ALP染色結果及半定量分析結果如圖10所示。與rBMSCs共培養7 d后，LIM和LHIM復合材料表面均有大量的ALP生成，表明兩種材料均能在無因子的情況下誘導刺激干細胞向成骨細胞分化，且LHIM表面干細胞產生的ALP更多，從而證明LHIM復合材料相比LIM具有更強的骨誘導能力。

圖11為OCN和Runx2蛋白染色結果，結果顯示LIM和LHIM材料表面的rBMSCs均能很好地鋪展開，表明兩種材料均具有良好的細胞相容性。進一步分析兩種OCN和Runx2蛋白表達。Runx2蛋白在成骨細胞分化的多種信號途徑中起中心作用，在成骨前期過程中起到了關鍵性的作用。從圖11（a）中可見，14 d后LIM和LHIM材料表面干細胞均有明顯的Runx2蛋白免疫熒光，且LHIM表面細胞的Runx2蛋白免疫熒光強度更強，表明LHIM材料更能刺激干細胞分泌Runx2蛋白；OCN是一種由成骨細胞分泌的蛋白，在調節骨鈣代謝中起重要作用。從圖11（b）可見，LHIM材料表面細胞的OCN蛋白免疫熒光強度明顯高于LIM材料的相似值，表明LHIM材料更能刺激干細胞分泌OCN蛋白。以上結果均表明LHIM比LIM更能刺激干細胞分泌Runx2和OCN，LHIM具有更強的骨誘導能力。

圖8 rBMSCs 在 LIM 和 LHIM 上培養的死活染色結果Fig. 8 Live/ dead staining of rBMSCs cultured on LIM and LHIM

圖9 LIM 和 LHIM 對 rBMSCs遷移能力的影響（t=1 d）Fig. 9 Effects of LIM and LHIM on migration of rBMSCs（t=1 d）

圖10 LIM和LHIM分別與rBMSCs共培養7 d的ALP染色結果（普通細胞培養基）Fig. 10 ALP staining of rBMSCs cultured on LIM and LHIM after 7 d（Ordinary cell culture medium）

圖11 LIM和LHIM分別與rBMSCs培養14 d后成骨標志物Runx2和OCN的免疫熒光染色結果Fig. 11 Immunofluorescence staining of the osteogenic marker Runx2 and OCN after rBMSCs cultured on LIM and LHIM for 14 d

3 結 論

（1）合成了長 25～35 nm，寬 10～20 nm 的棒狀納米級的 HAp。

（2）制備了具有觸變性的LHIM，HAp的引入顯著增加了材料的粗糙度，納米HAp可在材料中均勻分布。

（3）LHIM和LIM均具有良好的細胞相容性，LHIM比LIM更能促進干細胞的黏附、遷移以及成骨分化。