心臟hERG 鉀通道結構及其電壓門控調節分子機制

鄭澤群 廉姜芳

自從1994 年鑒別出了KCNH2（hERG）基因，眾多研究逐漸揭示了該基因編碼的快速激活延遲整流鉀電流（IKr）在構成完整動作電位中的重要地位。KCNH2 基因全長包含1 159 個氨基酸，發生在不同位點的突變影響了通道的電壓門控特性，稱為Ⅲ類突變[1-2]。Ⅲ類突變發生在hERG 通道的不同結構域改變了其門控動力學，主要表現為通道的激活減慢或去激活加速[3-4]。因涉及復雜的通道結構域間相互作用，理解hERG 通道在心肌復極化過程中正常的電壓門控機制，需要全面認識不同結構域在其構象改變中發揮的作用。

同屬電壓門控鉀（Kv）通道的Shaker 通道為hERG 通道的結構及動力學提供了研究基礎，加上定點突變鑒定出了調節hERG 通道構象改變的重要結構域以及藥物結合的高親和力位點，逐步奠定了hERG 鉀通道在心臟動作電位的重要角色。近來，hERG 冷凍電鏡結構顯示出的結構細微差異，提示了門控機制可能涉及的新觀點以及藥物高敏感性的分子基礎[5]。由于hERG 通道各個不同的結構域都可能參與了其構象改變的調節，無論是先天性基因突變還是藥物導致通道功能改變，結合定點突變后的功能研究與新的結構差異性認識，以及分子動力學模擬等可以更好地理解潛在的復雜機制[6]，為糾正hERG 通道功能喪失帶來希望。本文就近年來心臟hERG 鉀通道結構及其電壓門控調節分子機制的研究新進展作一綜述。

1 動作電位中的hERG 鉀通道

Ether-a-go-go（EAG）鉀通道家族包含ether-ago-go（eag）、eag-like（elk）和eag-related（erg）亞 家族。心臟hERG 通道也稱為Kv11.1 通道或ERG1 鉀通道，隸屬于erg 亞家族，是EAG 鉀通道家族成員之一[7-8]。hERG 基因編碼了IKr的成孔α 亞基，與KCNE2 編碼的輔助β 亞基MiRP1 共同形成完整鉀通道發揮作用。hERG 通道蛋白的生物合成順序依次是：翻譯和插入內質網膜，天冬酰胺連接（N-連接）聚糖的添加，α- 亞基的四聚化以及電壓傳感器、孔域、NH2和COOH 末端的正確或自然折疊[9]。hERG 通道主要在動作電位的平臺期及復極化階段起作用，構成心臟復極化儲備的重要成分，是除復極化的鈉或鈣內向電流外，負責心肌復極化時程最重要的外向離子流[10]。

除了先天性突變導致功能改變外，眾多藥物的脫靶效應靶向hERG 通道，引起IKr電流減少，由此引發的心臟毒性有時是致命的。hERG 基因的失功能突變使其蛋白表達呈現單倍型不足或顯性負效應，使IKr電流部分或完全減少，延長復極化時程；同樣地，心臟毒性藥物直接結合在hERG 鉀通道高敏感芳香族氨基酸殘基位點（Y652、F656 等）上產生了直接的通道阻滯效應[11]，或者阻礙了通道蛋白的成熟表達使電流減少，這些可表現為心電圖的QT 間期延長，如果延長超出正常范圍（男性為440 ms，女性為460 ms），臨床上稱為長QT 綜合征（LQTS）[12]。專家共識表明：在先天性LQTS 中，QT 間期的長度為心臟事件（包括心源性猝死）風險的重要預測指標，并且當使用延長QT 間期的藥物（如索他洛爾或多非利特）時，QT 間期≥500 ms 時應減少或終止藥物使用[13]。QT 間期的過度延長促使早后除極的發生，并可能觸發尖端扭轉型室性心動過速甚至心室顫動[14]。

2 hERG 鉀通道結構

hERG 通道與其他Kv 通道具有結構同源性[15]。不同的是，4 個hERG 亞基在膜上呈環狀而非線性排列[16]。IKr通道四聚體的每個亞基包含6 個跨膜片段（S1-S6），N 端Per-Arnt-Sim（PAS）域和C 端環狀核苷酸結合域（cNBD）[7，17]。S1-S4 作為電壓感應域（VSD），有多個帶正電的殘基，感受跨膜電壓變化，其中尤以S4 最重要。而S1-S3 含一些帶負電荷的氨基酸，被認為是整個VSD 的抵消電荷。4 個以正方形排列的跨膜螺旋S5-S6 是構成通道孔區（PD）的重要結構，通過與4 個亞基的中間孔環耦聯形成圍繞中心傳導途徑的四聚體結構，并構成離子滲透孔結構域[7，18]。S4 和S5 之間的連接部分稱為S4-S5接頭，將VSD 感受到的電壓變化信息傳遞到PD，起到重要的橋梁作用（圖1）。N 端PAS 域和PAS-Cap一起被稱為“Eag 域”。據報道，Eag 域在穩定hERG亞基組裝和轉運中至關重要[19]。此外，該結構域還參與了hERG 通道門控動力學的調節[20-21]。

近來，電壓門控鉀通道的冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構引起了極大的關注。先是hERG 同源家族Eag1（Kv10.1）結構的出現，該結構去除了C 端非結構化的114 個殘基（773～886）。這種高達3.78 A分辨率的結構被稱為rEag1Δ，它保持了與全長通道相似的所有特性[15]。之后的hERG cryo-EM 結構（hERGT）刪除了兩個片段（N 端141-350 和C 端871-1005），剩下的814 個氨基酸殘基同樣與通道擁有類似的主要門控特性（圖1）。hERGT結構的分辨率高達3.8 A，顯示出了與先前結構的細微差異，它的S4-S5 接頭與rEag1Δ 結構一樣，是一個含有5 個殘基的短環[5]。不同于Shaker Kv 通道，該結構S4 螺旋僅有5 個正電荷的氨基酸，且前3 個K1、R2和R3 位于胞外，而R4 和R5 在下方，提示以S4 為主的VSD 處于去極化的激活狀態[22]。此外，hERGT中的孔區處于開放狀態，并且通道中央腔的體積非常小，中央腔周圍有4 個深的細長的疏水性口袋，藥物敏感性的氨基酸正好排列在這些口袋表面上，經典的hERG 通道阻滯劑阿司咪唑和多非利特在進入狹小的中央腔后嵌入到口袋中，這對于解釋藥物對hERG 通道的異常敏感性可能有用[5，23]。

cryo-EM 結構提供了完整的通道結構的開創性見解，但其對于通道在胞內的固有結構域的原子分辨率細節的推導是有限的。分辨率為1.5 A 的第1 個hERG 通道高分辨率晶體結構鑒別出了新的鹽橋（E807-R863），這并未在cryo-EM 結構中出現，電生理學分析表明該鹽橋可能既支持了內在配體的空間組織，又維持了細胞內的復雜界面[24]。

圖1 心臟hERG 鉀通道在細胞膜上的單個α 亞基（A），冷凍電鏡結構刪除了N 端（Δ141-350）和C 端（Δ871-1005）部分氨基酸序列（B）

3 hERG 通道電壓門控及其分子機制

3.1 hERG 通道電壓門控 同其他Kv 通道一樣，hERG 通道具有3 種不同的構象，分別是閉合、開放和失活[11，16-17]。但hERG 也有其獨特的門控動力學，即快速的失活及從失活中恢復，而激活和去激活則相對緩慢[11，17]。也就是說，hERG 通道的滅活性質比活化更活躍，這導致了其向內整流特性[25]。

在動作電位的早期，hERG 通道緩慢打開，但迅速失活。隨著去極化電壓的持續降低，通道逐漸從失活中恢復。當膜電位為-40 mV 時，跨膜電流達到峰值。IKr電流在復極化過程中逐步升高，隨后是通道緩慢的去激活過程（圖2）。可見，通道在整個動作電位時程中經歷了激活、失活、再激活及去激活狀態，且通道在靜息電位以下仍保持很長一段時間的打開狀態（200～300 ms），產生了典型的尾電流[11，26]。尾電流的分析和繪制激活曲線對于研究通道打開、關閉和失活的動力學非常有幫助。通道性質的改變會導致激活曲線向左或向右移動，尾電流衰減過程變得更快或更慢。

圖2 心臟hERG 鉀通道電壓門控（動作電位早期，hERG 激活后然后快速失活，隨后在復極化時再次快速激活，之后是緩慢的去激活過程產生了經典的尾電流）

3.2 hERG 通道門控的分子機制 hERG 通道不同構象變化的調節十分復雜，因為幾乎所有結構域都參與了這種調節。因此，很難闡明門控動力學的確切機制。研究證實：包括C 端和N 端的胞質結構域在hERG 通道門控調節中起關鍵作用，它們可能通過PAS 域與不同亞基中cNBD 域之間的相互作用而產生效應，稱為PAS/cNBD 復合物[17，26-27]。這種不同亞基的不同結構域之間的物理作用，通過進一步的耦聯能夠產生電活動，是電壓門控鉀通道的不同構象變化的經典解釋。但是，在近來的研究中這種機-電耦聯模式遭到了質疑。

3.2.1 激活 hERG 通道的激活過程很慢，其電壓閾值為-40 mV 至-30 mV，在+20 mV 至+40 mV 達到平臺。緩慢激活的生理學意義是使通道的使用最小化以促進去極化的完成[17]。一般認為，VSD 中的結構重排通過S4-S5 接頭與S6 螺旋的胞質末端之間的物理作用轉移至PD，從而打開和關閉激活門，稱為VSD/PD 耦合機制[7，17-18，28-29]。這種模式的基礎是S4 帶正電的殘基感應了跨膜電場施加的力而發生移動，成為導致孔區構象變化的驅動力[30]。此外，S4的緩慢移動也可能解釋了緩慢的激活。然而，切斷了S4-S5 接頭從而打斷了VSD 與PD 的聯系并沒有改變通道的激活動力學[31]。通過在VSD 與PD 間的S4-S5 接頭的不同位點插入熒光非標準氨基酸標記的研究表明：S4-S5 接頭運動與S6 運動沒有關聯，但通道仍正常打開[29]。

hERGT結構同樣對VSD/PD 模式提出了質疑。如前所述，S4-S5 接頭是一個含有5 個殘基的短環，無法充當機械杠桿因而并未進行域交換，它與S6段C 末端之間的相互作用發生在同一亞基中，并不涉及另一個相鄰的亞基[5]。但是，即使是在包含有2個α 螺旋的相當長的S4-S5 的小電導鈣激活的鉀通道中，非域交換的架構仍然存在[32]；并且即使沒有明顯的S4-S5 接頭或只有一個短的S4-S5 接頭，域交換也可以發生[33]。與經典的Kv 通道相比，這種非域交換結構表明VSD 的運動作為通道開口的機制有所不同。此外，S4 螺旋中的電荷重排表明VSD 處于去極化狀態下也可能進一步改變了其對門控特性的影響。基于新的結構差異，研究人員提出了VSD/PD 的另一種模式，表明S4 直接與C 端接頭相互作用造成S6 的彎曲和松弛，而并不需要S4-S5接頭的作用。S6 的彎曲和松弛是由S4 的不同狀態引起的，在VSD 處于去極化狀態時，S4-S5 接頭與S6 的細胞內部分相互作用從而將S4 的C 端引向C端接頭，引起S6 松弛打開通道，相反，超極化狀態下的VSD 造成S6 彎曲關閉了孔門[5，15，23]。

綜上，VSD/PD 耦合機制并不能簡單地解釋通道緩慢的激活，雖然新的模式提供了可能的解釋，但確切的VSD 的構象狀態與激活門控間的關系仍有待證實。并且，如前所述，cryo-EM 對于蛋白質結構外圍的分辨率通常較低，這阻礙了對側鏈構象的明確鑒定和對通道功能特征的精確建模[9，34]。因此，進一步的分子動力學模擬可能是一種有效的工具來支持上述假說。

3.2.2 失活 hERG 通道緩慢激活后，在復極化階段出現異常快速的失活過程，在+60 mV 處通道能夠在1～2 ms 內失活[17]。hERG 通道的失活本質上是P/C 型的，因為它并不受N 端缺失的影響。與其他K+通道一樣，hERG 失活涉及選擇性過濾器（SF）中一個或多個位點的K+占位丟失[35]。這種類型的失活對SF 中的離子占有率很敏感，表明失活可能涉及SF 的結構重排。不同于其他Kv 通道，hERG通道位于PD 上的SF 部分殘基并不保守，且具有一些輕微的序列差異，這些殘基使SF 更容易發生構象變化進而導致失活[36]。功能研究也證實位于SF殘基的特定突變可能會改變hERG 通道的失活特性[37]。結合cryo-EM 獲得的通道結構現實模型和計算機模擬，將KCNH2 基因組信息與功能結果聯系起來，新的研究為位于SF 的功能獲得突變N629D（影響失活及離子轉運）如何影響K+的選擇性滲透提供了新的見解[38]。最近，對S5 螺旋上的滅活減弱I560T突變的研究表明：S5 螺旋的構象干擾很可能通過與孔螺旋的相互作用而與SF 相關聯[39]。在分子動力學模擬中，SF 中的幾個殘基在孔軸中發生了位移，尤其是GFG 基序中的F627[40]。

F627 的位置特殊性在cryo-EM 結構下得到證實，hERGT中F627 的方向是偏移的。Wang 等[5]還構建了非滅活的S631A 突變體的結構hERGTs S631A 來模擬其他Kv 通道的非瞬時失活，結果顯示其SF 中F627 的位置同其他Kv 通道相似。F627的獨特位置代表了SF 構象的細微差別，提示可能通過調節單個殘基引起hERG 快速失活。同時，他們強調SF 的構象變化十分細微，當觀察到K+從SF中流出時，它不同于KcsA K+通道那樣發生較大的構象變化[5，22]。

3.2.3 去激活 快速的從失活中恢復之后，hERG通道經歷了緩慢去激活。去激活代表了hERG 通道的關閉過程，是其重要的標志性特征。去激活的調控非常復雜，并無法用VSD 的緩慢移動來解釋。N端Cap 結構域（N-Cap）、PAS 和cNBD 間的相互作用對于調節緩慢去激活十分重要[41-42]。N-Cap 的突變加速了通道的去激活[42]，而PAS 和cNBD 之間的直接相互作用決定了緩慢的去激活，特別是在PAS的R56 和cNBD 的D803 之間以及N-Cap 的N12和cNBD 的E788 之間的作用[20]。這些結果表明在去激活的調節過程中，PAS/cNBD 復合物占據著中心地位，而包含N-Cap 和PAS 的Eag 域尤為突出。

hERGT結構也進一步證明N 端確實整合在VSD/PD 界面上，表明N 端PAS 域在緩慢的去激活過程中可能會向質膜移動以改變VSD/PD 的相互作用[43]。最近，研究表明VSD 的弛豫是導致hERG 通道緩慢去激活門控的原因之一[17，44]。弛豫現象是VSD 的固有屬性，它是在hERG 通道激活后將激活的VSD 穩定在松弛的構象中。這種弛豫會導致通道激活和去激活路徑的能量分離，從而產生磁滯現象進而調節去激活門控[44]。hERG 通道VSD 弛豫的動力學模型也表明VSD 弛豫狀態的不穩定可能會加速去激活過程。

調控hERG 通道的去激活門控動力學似乎更加重要，因為無論是通道的阻滯劑還是激活劑，通過作用于相應的結構域改變了這一過程均可能產生致病或治療效應。而基于更加詳細的關于Eag 域、VSD 以及VSD/PD 之間的作用可能有益于開發更加有效的通道激活劑。

4 結語

參與調節心肌細胞動作電位的鉀通道種類繁多，hERG 鉀通道因其在心肌復極化過程中的重要角色而備受重視。隨著研究不斷深入，新的hERG 通道結構顯示出與既往經典結構的細微差異，結合精確的動力學模型為解釋通道的門控動力學機制提供了新的觀點。這些成果提供了進一步的證據說明hERG 鉀通道在心肌細胞電活動中的重要地位以及藥物對該通道的高度親和力的原因，并且將在開發針對通道阻滯的糾正劑中有所裨益。