番茄過氧化氫酶CRISPR/Cas9敲除突變體的構建

馬銘悅, 韓 毅

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

番茄的種植較為廣泛,營養豐富、口感獨特,是大家喜愛的農作物,但是番茄極其容易染病,常見的細菌性病害主要有青枯病、潰瘍病、細菌性斑疹、瘡痂病、細菌性髓部壞死病、番茄軟腐病、番茄假單孢果腐病等[1],其中丁香假單胞菌[2]是引起植物細菌性病害之首。在番茄種植過程中，利用大量噴灑農藥殺死病原菌的傳統方法會對人類造成傷害,因此基因改造已經成為植物抗病的主要手段[3]。

對植物而言，活性氧是一類有毒的化學物質逐漸被質疑,取而代之的是其在植物生長發育過程中發揮著重要的作用,例如根毛發育[4]、次生壁分化與發育[5]、柱頭與花粉粒發育[6],甚至在植物面臨各種非生物脅迫(如干旱[7]、炎熱、土壤鹽漬[8])和生物脅迫[9]時作為重要的信號分子在脅迫響應中發揮著作用。在植物中,活性氧能夠調控寄主對病原體的抗病反應[10],這為植物抗病提供了思路。H2O2以比較穩定的一種活性氧形式[11]存在于植物體內。H2O2清除系統主要是非酶促反應清除系統和酶促清除系統,非酶促清除系統是通過抗壞血酸[12]、谷胱甘肽[13]、類胡蘿卜素等抗氧化化學物質。酶促清除系統則是由過氧化氫酶(CAT)[14]、抗壞血酸過氧化物酶(APX)[15]、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)[16]、谷胱甘肽還原酶(GR)[17]等組成,其中CAT是H2O2最直接最主要的清除酶。但是光呼吸產生的H2O2作為抗病信號[18],往往以模式植物為研究對象[19],相關番茄的H2O2突變體報道并不多,因此番茄H2O2突變體是否提高抗病性和產量還不是很清楚。

甲基磺酸乙酯和T-DNA插入是使用比較普遍的隨機插入的基因突變技術,但是通過這些方法得到的遺傳材料需要大量篩選,且不能定點突變[20]。鋅指核酸酶(ZFNs)[21]、類轉錄激活因子效應核酸酶(TALENs)[22]雖然可以對基因進行定點編輯,但是構建DNA結構域的表達單位比較復雜、過程繁瑣。成簇的規律間隔的短回文重復序列相關核酸酶9系統(CRISPR/Cas9)[23]由sgRNA(single guide RNA)和Cas9組成,sgRNA[24]根據靶點基因尋找到相匹配的DNA片段、Cas9蛋白切割序列[25],DNA 通過容易出錯的非同源末端連接修復[26]后,基因發生改變。這樣的定點基因編輯技術構建載體方便快捷高效且現在技術逐漸成熟,有更多有效的切割蛋白[27]出現,極大地提高了基因敲除效率。因此本文構建番茄的CAT基因多靶點敲除系統并篩選出陽性苗,為后期研究H2O2抗病提供了遺傳材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

實驗室所用野生番茄(Solanumlycopersicum)野生型Ailsa Craig(AC)來自美國康奈爾大學THOMPSON植物研究所,由本實驗繁殖育種。表達盒質粒pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29,質粒pYLCRISPR/Cas9P35s-N均來自華南農業大學劉耀光實驗室[28]。

1.1.2 實驗試劑與儀器

試劑主要有MS培養基、蔗糖、瓊脂粉、酵母提取物、牛肉膏、無水乙醇、高樂氏(主要成分是次氯酸鈉)、BsaⅠ限制性內切酶、高保真DNA聚合酶、T4連接酶、質粒提取純化試劑盒等。

主要儀器有高溫高壓滅菌鍋、離心機、恒溫培養箱、超凈工作臺、一次性培養板等。

1.2 方法

1.2.1 目的基因與表達盒組合擴增

在華南農業大學劉耀光實驗室設計的網站(http://skl.scau.edu.cn/home/)上輸入基因信息,設計4個靶點引物后合成,稀釋成100倍的母液,F與R 混合并稀釋到1 mol/L。pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29質粒圖[28]如圖1所示,這4個質粒酶切后的產物分別與對應的混合引物在T4連接酶的作用下反應45～60 min。通過巢式聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)對連接產物進行擴增。

1.2.2 目的基因雙元載體構建

對擴增后的4個表達盒分別進行純化,以減少后續不良反應影響。把純化的產物與質粒pYLCRISPR/Cas9P35s-N按照一定摩爾比加入邊切邊連變溫循環酶反應體系,pYLCRISPR/Cas9P35s-N質粒圖[28]如圖2所示。反應結束后把產物加入大腸感受態中,熱擊處理,涂布kana篩選培養基,12 h后挑單克隆并進行菌落PCR鑒定。確定陽性菌后提取質粒且送去測序并轉農桿菌,保存甘油菌備用。

圖2 CRISPR/Cas9載體

1.2.3 番茄愈傷組織的培養

在無菌操作臺,將浸泡在無菌水約6 h的AC種子,75%乙醇消毒5 min,15%高樂氏15 min,無菌水5 min重復10次。在滅菌后的濾紙上晾干后移到1/2 MS培養基生長。待2對子葉伸展后,剪下子葉和莖(其中子葉需要戳孔)放入預培養約3 d,形成愈傷組織。

1.2.4 侵染番茄愈傷組織并篩選陽性苗

將構建的pYLCRISPR/Cas9P35s-N-CAT農桿菌搖菌至OD值約為1.0后配制成侵染液,對愈傷組織進行侵染并把侵染后的愈傷組織放入共培養培養基。2 d后及時移苗至含有kana的篩選培養基,此后每20 d更換1次篩選培養基以及kana濃度。約40 d后,把陽性苗移到生根培養基,待苗生根后再移到土里。

1.2.5 陽性苗Cas9鑒定

取樣,用液氮充分研磨,加入400 mL的SDS提取液,10 000 r/min,4 ℃離心10 min,取200 mL上清與200 mL異丙醇混合,10 000 r/min,室溫離心10 min,棄上清,加75% 乙醇,10 000 r/min,室溫離心5 min。吹干后加入100 μL,無菌水。吸取2 μL DNA作為PCR的目的模板,35個PCR循環:95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s。Cas9引物序列見表1所列。

表1 引物的序列

1.2.6 陽性苗酶活檢測

取樣,用液氮充分研磨,加入1 mL提取液,14 000 r/min 4 ℃離心,10 min,吸取上清放入冰上備用。反應體系為1 mL,970 μL0.1 mol/L NaH2PO4,1 mmol/L EDTA (pH值7.5),20 μL 2 mol/L H2O2, 10 μL提取液,檢測在240 nm處的吸光值。

2 結果與分析

2.1 目的基因雙元載體的構建

本文選擇了4個靶點,設計了靶點接頭引物,具體信息見表1所列。為了提高表達盒的效率,通過pYLgRNA-AtU3b與T1連接, pYLgRNA-AtU3d與T2連接,pYLgRNA-AtU6-1與T3連接,pYLgRNA-AtU6-29與T4連接,將酶切的表達盒質粒分別與對應靶點連接反應。

為了準確擴增含目的靶點的表達盒,選擇巢式PCR,每個含有目的靶點擴增都有2輪PCR反應,巢式PCR鑒定跑膠圖如圖3所示。第1輪用表達盒左端引物UF與靶點接頭R為一對引物即UF+TR的產物,如圖3a所示的1號泳道,靶點接頭F與表達盒右端引物gRNAR為一對引物即TF+gRNAR的產物,如圖3a所示的2號泳道,分別擴增含目的靶點的表達盒。圖3a中1和2只是1個靶點的2個PCR結果,剩下的3個靶點結果應該和圖1保持一致。

第1輪PCR的2個產物稀釋10倍,混合后作為第2輪PCR模板,與對應的10倍位置特異性引物反應做PCR，如圖3b所示。圖3b中的1、2、3、4分別對應4個靶點的第2輪PCR產物。

圖3 巢式PCR鑒定跑膠圖

為了保證PCR產物后續與載體正常高效地酶切和連接,需要對第2輪PCR產物進行純化。4個表達盒與pYLCRISPR/Cas9P35s-N連接后,轉化大腸,挑選單克隆,進行菌落PCR鑒定結果如圖4所示。為了準確檢測目的靶點在載體上,菌落PCR鑒定為5對引物,即CRISPR表達盒左端引物35sF與靶點1的接頭R(產物為圖4的1號泳道),靶點1的接頭F與靶點2的接頭R(產物為圖4的2號泳道),靶點2的接頭F與靶點3的接頭R(產物為圖4的3號泳道),靶點3的接頭F與靶點4的接頭R(產物為圖4的4號泳道),靶點4的接頭F與CRISPR表達盒右端引物35sR(產物為圖4的5號泳道)。其中圖4的左邊空白對照的PCR模板為水。

圖4 陽性單克隆菌落PCR鑒定

挑選陽性菌落,提質粒送去測序，測序結果如圖5所示,從圖5可看出，4個靶點全部與構建的質粒序列相匹配,這個雙元載體成功構建,轉入農桿菌為后續的侵染番茄做準備。

圖5 靶點與雙元載體質粒序列對比圖

2.2 番茄陽性苗篩選與鑒定

通過組織培養獲得番茄的愈傷組織,并用陽性農桿菌侵染愈傷組織,經過多次抗生素濃度提高的培養基來篩選出7顆陽性苗。

把7棵陽性苗移到土里培養一段時間后,取樣進行Cas9鑒定和酶活測量,Cas9鑒定結果如圖6所示,圖6中,空白對照的 PCR模板為野生型,其泳道上沒有條帶,但是1～7號泳道上的條帶和構建成功的雙元載體質粒為模板時的條帶一樣,因此Cas9基因成功轉入陽性苗體內。

圖6 陽性苗PCR鑒定Cas9

對其中7顆陽性苗進行酶活測定,結果如圖7所示。由圖7可知，所有的陽性苗CAT酶活顯著性地低于野生型對照,表明CRISPR/Cas9成功地敲除番茄CAT相關基因。

圖7 7顆陽性苗酶活測定

3 討論與展望

目前CRISPR/Cas9基因編輯技術在動物、植物、微生物等領域都有一席之地,在植物上擬南芥、番茄、水稻、棉花、生菜、大豆等都能看到CRISPR/Cas9的身影[29-31]。

在CRISPR為載體的基因編輯系統中,sgRNA和Cas9甚至靶點序列的選擇都會影響打靶效率。Cas9基因密碼子、啟動子、終止子會影響Cas9的表達水平和活性[28]。靶點目標帶著sgRNA與DNA識別時,會有幾個堿基的誤差,會造成脫靶[32]。CRISPR/Cas9是通過DNA雙鏈斷裂[33],形成DNA損傷,DNA自身會進行修復,但是修復過程中容易出現堿基對缺失或者修復錯誤，其結果千差萬別[26],從而導致遺傳信息的改變。因此修復能力也決定了最終突變體的類型。這些原因就導致最后篩到的突變體各有不同。在今后構建載體時,需要對目的靶點多加篩選,提高sgRNA的特異性,改造Cas9蛋白酶都有利于減少脫靶頻率[34]。

本實驗最終篩選出7顆陽性苗,并對其進行CAT酶活測定。酶活有顯著性的下降,但是所有的材料還具有部分CAT酶活,表明不是所有的CAT基因被敲除,暗示CRISPR/Cas9打靶敲除了其中若干基因,而不是全部。CRISPR/Cas9敲除會導致堿基對的增添、缺失、突變等情況;其次,CAT相關的基因有3個,CDS序列高度相似;而且,無法找到針對其中一個CAT基因的專一性靶點。因此在基因水平上確定每個CAT的精確突變情況會異常困難。PCR鑒定顯示番茄體內存在Cas9,可能會對突變體內其他未突變的CAT繼續敲除,因此期望在后續T1和T2代中可以獲得純合CAT基因全敲除的突變體。

以丁香假單胞菌為代表的病原菌是引發疫病、導致番茄減產的主要原因[2]。植物在遭受病原菌侵害時會出現一種程序性死亡且激活體內一系列抗病防御反應[35],而光呼吸途徑代謝產生的H2O2能顯著抑制丁香假單胞菌對植物的侵染以及提高植物體內免疫防御能力[36]。通過番茄CAT的CRISPR/Cas9雙元敲除載體系統獲得突變體,不管能否獲得全敲除的CAT突變體,本文目前獲得的CAT酶活缺失突變體為后續分析番茄的抗病性和產量提供了重要的遺傳材料，同時分析這些番茄突變體的遺傳穩定性,以期獲得穩定的且抗病能力強的番茄新品種。