5個檸檬品種果皮揮發性物質差異分析

王小柯，羅 懌，鄭乾明，林 乾，韓秀梅，李金強，蔡永強，李文云

(貴州省農業科學院果樹科學研究所，貴陽，550006)

檸檬屬于蕓香科柑桔屬植物，其果實風味獨特，富含檸檬酸，具有鮮食、藥用等價值，有較高的經濟效益。香氣是檸檬果實感官品質的一個重要指標[1,2]。有研究表明，檸檬果實香氣成分主要包括萜烯類(單萜、倍半萜)和含氧化合物，其中含量最高的為檸檬烯，約占香氣物質總量的50%左右[3-5]。當前大部分的研究都集中于檸檬果皮精油成分的分析，對不同品種果皮揮發性物質含量差異的比較研究較少[6-10]。氣相色譜-質譜聯用技術(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer-computer，GC-MS)則是利用氣相色譜進行代謝物分離，然后使用高分辨率質譜進行代謝物檢測，具有分辨率高、靈敏度高、有較為完善的數據庫等特點[11-13]。何朝飛等[1]利用頂空固相微萃取技術結合氣質聯用技術對3個檸檬品種進行果皮香氣成分的分析測定，結果表明檸檬感官品質的差異除受環境影響外，基因型的不同也起到決定性作用。涂勛良等[3]對8個檸檬品種果皮的香氣成分進行了檢測和比較分析，結果表明8個品種中共有成分含量最高的為D-檸檬烯，特異成分物質和共有成分含量的差異可作為區分品種的重要特征。朱春華等[8]利用氣質聯用技術分析3個檸檬品種果皮精油揮發性成分，結果顯示烯烴類物質是檸檬果皮精油揮發性成分的主要組分，D-檸檬烯、β-蒎烯、檸檬醛等在艾倫尤力克檸檬中含量最高。本研究在貴州省果樹科學研究所試驗基地5個檸檬品種初結果樹上采果實樣品，通過GC-MS技術檢測果皮揮發性物質，并比較分析差異。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以5個檸檬品種為試驗材料，分別為阿聯粗檸檬(ALC)、木里檸檬(ML)、阿特摩檸檬(ATM)、喬化無刺檸檬(QWC)、黃花尤力克檸檬(HYLK)。5個檸檬品種容器苗(砧木為枳)于2015年春季從重慶引入，當年定植在貴州省果樹科學研究所試驗基地(貴州省惠水縣好花紅鎮好花紅村)。該地海拔300 m左右，東經106°35′16.5″，北緯26°0′52.90″，年降水量1 100 mm，年平均日照1 165.0 h，年均溫16.0 ℃，無霜期280 d，1月平均溫度5.9 ℃，土壤類型為黃壤或黃砂壤[14]。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

在定植后3年進行采樣分析。每個品種隨機選取5株樹，于樹冠中部不同方位，采集果面光滑無明顯病斑、果皮淺黃色、著色均勻、大小一致的成熟果實帶回實驗室。用蒸餾水將果實表面清洗干凈，取其果皮切成小塊，于液氮中充分磨碎混勻后送往武漢普奈斯生物科技有限公司檢測。每個品種各稱取3份混樣作為生物學重復實驗，每個重復稱取2.5 g粉末進行萃取。樣品的萃取參照涂勛良[3]、尚雪波[15]、馮璐璐[16]等的方法，并進行略微改進。稱樣后加入9 g氯化鈉，用電熱套加熱；在另一100 mL圓底燒瓶中加入45 mL二氯甲烷，60 ℃水浴加熱，蒸餾萃取2 h。在所得的二氯甲烷萃取物中加入10 g無水硫酸鈉，置于旋轉蒸發儀中，50 ℃下濃縮至1 mL。

1.2.2 氣質聯用分析

使用安捷倫HP GC7890串聯MS5975高分辨質譜儀，參考Barrek等[17]、Mohammad-Taghi 等[18]、吳洪梅等[19]、陳婷婷等[20]的方法，稍加調整。色譜條件：色譜柱為毛細管柱HP-VOC(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(J&W scientific，USA)；進樣量為10 μL，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，流速為3 mL/min；載氣為He，柱流速為1 mL/min。升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持2 min；之后以5 ℃/min升至180 ℃，保持2 min；再以5 ℃/min升至240 ℃，保持8 min。質譜條件：傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電離電壓70 eV，掃描范圍(質荷比，m/z)35～550。

1.2.3 數據處理

參考涂勛良等[3]、謝煥熊等[21]的方法，用GC-MS光譜全波段掃描法分析樣品的芳香族化合物。使用XCMS軟件對得到的原始數據進行預處理，同時設置相應參數，得到數據矩陣，其中包含質荷比(m/z)、保留時間及峰面積等信息，將上述數據導出至Excel表格中，進行后續的數據整理。物質的定性：根據質荷比及保留時間，在NIST數據庫中查找與之相匹配的物質。利用SIMCA-P軟件進行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)和偏最小二乘法判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminate Analysis，OPLS-DA)。物質含量數據采用極差法進行歸一化處理后，通過R軟件(www.r-project.org/)對物質在不同樣本間的積累模式進行聚類分析(Hierarchical Cluster Analysis，HCA)。

2 結果與分析

2.1 檸檬果皮揮發性物質成分

從5個檸檬品種果皮的揮發性物質中，共檢出95種化合物(見表1)。其中，萜烯類43種，醇類26種，醛類10種，酮類6種，酯類3種，其他7種。阿聯粗檸檬、阿特摩檸檬、木里檸檬、喬化無刺檸檬及黃花尤力克檸檬果皮揮發性物質中檢測到的化合物數分別為57、53、51、49及46種。5個檸檬品種的共有化合物為22種，包括10種萜烯類物質(α-蒎烯、3-蒈烯、D-檸檬烯、β-羅勒烯、γ-松油烯、4-蒈烯、α-佛手柑油烯、石竹烯、γ-依蘭油烯、β-紅沒藥烯)，6種醇類物質(芳樟醇、松油烯-4-醇、香葉醇、β-白檀油烯醇、桉油烯醇、α-紅沒藥醇)，3種醛類物質(香茅醛、異檸檬醛、檸檬醛)，1種酯類物質(反式-香葉酸甲酯)，1種酚類物質(百里香酚)，1種烴類物質(對傘花烴)(見表1)。

表1 5個檸檬品種果皮的揮發性物質成分

2.2 主成分分析

根據各樣品所測化合物情況進行主成分分析的結果顯示，木里檸檬、黃花尤力克檸檬、喬化無刺檸檬組內樣本均較為聚集，組內差異較小，重復性和穩定性較好；阿聯粗檸檬和阿特摩檸檬存在明顯離散的樣本。木里檸檬與其他4種檸檬明顯分開，說明木里檸檬與其他品種差異明顯(圖1)。

注：ALC—阿聯粗檸檬，ML—木里檸檬，ATM—阿特摩檸檬，QWC—喬化無刺檸檬，HYLK—黃花尤力克檸檬。圖2至圖5同。圖1 全部檸檬樣本的主成分分析

2.3 聚類分析

通過在揮發性物質中檢測到的化合物進行聚類分析的結果顯示，5個品種組內樣本分別聚在一起，說明組內重復性較好(見圖2)。阿特摩檸檬和木里檸檬聚為一類，喬化無刺檸檬、阿聯粗檸檬和黃花尤力克檸檬聚為另一類(見圖3)。

圖2 檸檬各組樣品聚類

圖3 5種檸檬總代謝物的聚類熱圖

2.4 代表性差異物質篩選

基于OPLS-DA結果，從獲得的多變量分析OPLS-DA模型的VIP(變量重要性投影)，可以初步篩選出不同品種間差異的代謝物。同時結合單變量分析的p value(p值)和fold change(差異倍數值)來進一步篩選差異代謝物(篩選標準為：fold change≥2和 fold change≤0.5，且p value≤0.05)，不同品種間差異統計見圖4。各分組比較中 OPLS-DA 模型中 VIP 值大小排在前面的差異表達代謝物有15種，分別為γ-松油烯、反式-芳樟醇、D-檸檬烯、β-羅勒烯、芳樟醇、β-紅沒藥烯、石竹烯、β-蒎烯、L-α-龍腦烯醛、3-蒈烯、萜品醇、檸檬醛、香葉醇、γ-蓽澄茄油烯、D-香芹酮(見圖5)。

注：橫坐標為兩兩品種比較，縱坐標為代謝物數量。圖4 檸檬樣品間代謝物差異統計

注：橫坐標為VIP值，縱坐標為差異代謝物。圖5 5種檸檬差異代謝物VIP值

3 討論與結論

有研究表明[22,23]，檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯、異松油烯和辛醛是柑桔類的主要特征香氣物質。本試驗中，異松油烯和辛醛在5個品種中均未檢出，月桂烯在阿特摩檸檬中未檢出，β-蒎烯在阿聯粗檸檬、喬化無刺檸檬及黃花尤力克檸檬中也未檢出。說明，5個檸檬品種之間香氣成分物質的差異較大。香氣成分的差異受生長環境的影響較大，但本試驗中5個檸檬品種生長環境一致，因此推測其產生差異的主要因素是各個品種間不同的基因型[24,25]。

萜烯類化合物是柑桔香氣主要成分，尤以檸檬烯含量為主[3,26]。在5個檸檬品種中，D-檸檬烯表達量最高的是黃花尤力克檸檬，并且γ-松油烯、3-蒈烯、β-羅勒烯及β-紅沒藥烯在黃花尤力克檸檬中也有較高表達。

醛類化合物是檸檬風味形成的主要物質，總醛含量決定檸檬香氣質量[7]。黃花尤力克檸檬和阿聯粗檸檬中檸檬醛含量高表達，喬化無刺檸檬中L-α-龍腦烯醛高表達。

醇類化合物是柑桔果香的重要成分，其形成多與果實中的酯酶有關[1,27]。芳樟醇和香葉醇是重要的香氣成分，木里檸檬和阿特摩檸檬中二者均為高表達。

果實的風味是由味感和嗅感構成，前者以甜酸味為主體，與糖、酸的種類和含量有關，后者取決于揮發性芳香物的種類和含量[28]。本研究通過GC-MS檢測5個檸檬品種果皮的揮發性物質，從種類上來分析，黃花尤力克檸檬揮發性物質種類最多。因本研究是基于物質相對含量進行的后續分析，故無法明確各化合物在不同品種果皮中的含量，因此不能判斷某個品種的風味好壞，還需結合果實糖、酸、香氣成分等數據進一步分析。

本研究利用GC-MS技術對5個檸檬品種果皮進行揮發性物質檢測，發現同一生長環境下不同品種的檸檬，其果皮的香氣成分存在一定的差異；同時對不同品種的所有檢出物進行聚類分析，結果表明阿聯粗檸檬和黃花尤力克檸檬之間差異較?。缓Y選到15種代表性差異代謝物，后續可進行相關代謝通路分析。