噬菌體治療細菌感染的研究進展

伍亞云,黃 勛

(中南大學湘雅醫院醫院感染控制中心，湖南 長沙 410008)

噬菌體在100多年前被科學家發現，是特異性感染細菌的病毒。噬菌體由外層的蛋白質外殼和內層的核酸遺傳物質組成，無完整細胞結構，個體十分微小，直徑在100 nm左右[1]。噬菌體感染細菌具有非常嚴格的特異性，這種特異性取決于噬菌體以及宿主菌表面受體的分子結構及其互補性[2]。早在噬菌體發現之初，就被用于治療細菌感染，但由于當時對噬菌體的基礎研究還不夠充分，無法標準化其生產方法，加之噬菌體制劑產物的純度較低等突出問題，噬菌體療法在臨床上的應用受到相應限制。隨后抗生素問世，由于其高效、方便、便宜的特點，很快在世界各地應用廣泛，至今仍是臨床上抗感染治療的最主要方法，而關于噬菌體的研究也逐漸放緩。近二十余年來，細菌耐藥問題逐漸突出，多重耐藥菌不斷出現，尋找細菌耐藥問題的解決方法是目前抗感染治療的重點及趨勢，因此，曾經快被人們淡忘的噬菌體療法又再次受到研究人員的重視。本研究基于國內外噬菌體的研究現狀，對噬菌體療法的發展、應用、特點作一綜述，綜合歸納噬菌體在細菌感染治療方面的應用，并分析噬菌體療法的優勢和局限性。

1 噬菌體的發現及發展

噬菌體的發現及發展是一個漫長的過程。1915年英國的Frederick Twort首次觀察到了噬菌體，1917年一個法裔加拿大微生物學家Felixd’herelle分離并命名噬菌體[1]。1928年Alexander Fleming發現了青霉素，緊接著人們又發現，與噬菌體的特異性感染相比，青霉素等其他抗生素抗菌譜更廣[3]。由于當時關于噬菌體療法的不確定性以及抗生素的強大抗菌效果，最終導致人們對噬菌體的研究興趣逐漸下降，只有前蘇聯和其他部分東歐國家仍在繼續研究噬菌體療法。近二十余年來，細菌耐藥問題逐漸突出，給臨床感染性疾病治療帶來了極大的挑戰。如何克服細菌耐藥問題是目前抗感染治療，尤其是多重耐藥菌感染的研究重點。針對耐藥問題，有科學家提出研發新型抗菌藥物，尋找新的細菌靶點，找到并破壞細菌的耐藥基因等方法，但這些新方法研發成本大，研究周期長，無法在短時間內有效解決目前日益嚴重的細菌耐藥問題。在此背景下，曾經逐漸淡出人們視線的噬菌體療法又重新受到重視。

2 噬菌體的分類

根據是否能裂解細菌，噬菌體分為烈性噬菌體(溶菌型噬菌體)和溫和噬菌體(溶原型噬菌體)兩大類。烈性噬菌體裂解宿主菌的主要步驟可概括為：吸附、侵入、復制、裝配成熟、裂解。噬菌體吸附在宿主菌細胞表面以后，噬菌體尾部結構的酶可以穿透宿主菌的肽聚糖層，隨后穿透內膜釋放核酸到細菌內部。噬菌體尾部蛋白還可以抑制已注入到宿主菌內部的噬菌體核酸物質被細菌排出，當噬菌體的核酸與宿主菌核酸整合完畢后，與細菌核酸一起復制，并可以與表達的蛋白質外殼重新組裝成新的子代噬菌體，擁有溶菌能力。在細胞溶解酶和/或穿孔蛋白的作用下，最終裂解感染的細菌，裂解后釋放出的子代噬菌體還可以通過一樣的方式繼續侵染裂解周圍的宿主菌[4]。因烈性噬菌體能夠在侵入宿主菌后不斷增殖并裂解細菌，導致宿主菌死亡，因此一般都用烈性噬菌體治療細菌感染。

溫和噬菌體將DNA或RNA整合到宿主菌的核酸后，噬菌體的核酸隨著宿主菌的復制而不斷復制，并隨著宿主菌的分裂不斷進入下一代宿主菌細胞內，一般不會引起宿主菌的裂解。此為溫和噬菌體的溶原期，這種與細胞宿主同時進行增殖但又不使其裂解的現象稱為溶原現象。但在某些外部誘因條件下，整合到宿主菌核酸上的噬菌體DNA或RNA又可以從宿主菌基因組中自發脫離出來，進入溶菌周期，組裝成完整的子代噬菌體，最終可以裂解宿主菌。

3 噬菌體治療不同部位的細菌感染

3.1 皮膚和軟組織感染 目前，利用噬菌體治療皮膚軟組織感染已經在不同的動物模型實驗中得到了廣泛的研究和測試。最常見的是小鼠創傷模型，具體包括燒傷模型、腫瘤手術創傷模型和足部感染模型等。大部分針對皮膚軟組織感染的噬菌體治療研究使用的是混合噬菌體，而不是單一噬菌體。Chadha等[5]在小鼠燒傷感染模型中比較單一噬菌體和噬菌體雞尾酒(多種噬菌體混合制劑)療法的效果，結果證實雖然單一噬菌體療法能夠使細菌數量減少，但噬菌體雞尾酒療法效果更優。在小鼠燒傷創面模型中發現，將噬菌體應用于局部時，噬菌體產生的保護水平高于抗生素提供的保護水平[6]。噬菌體制劑的給藥途徑已被證明對傷口感染治療的效果有重要影響。Mcvay等[7]將三種噬菌體混合在一起，通過三種不同的途徑一次性給藥：肌內注射、腹腔內注射和皮下注射，結果顯示，雖然噬菌體制劑經由三種給藥途徑均能提高小鼠存活率，但腹腔內注射效果最好，這種差異可能是噬菌體經不同給藥途徑后產生的不同藥代動力學結果所致。Yin等[8]通過建立小鼠局部創傷感染模型，比較噬菌體的局部應用和皮下注射的療效，結果證實局部使用噬菌體制劑的小鼠創面愈合更好，提示局部應用噬菌體是治療局部創傷感染的更好選擇。

3.2 呼吸道感染 許多研究者用小鼠和水貂動物模型進行噬菌體治療呼吸道細菌感染。在Cao等[9]試驗中，將多重耐藥肺炎克雷伯菌接種到小鼠肺部，在接種后2 h，通過經鼻吸入肺炎克雷伯菌噬菌體可保護小鼠不患致命性肺炎。該研究團隊還用噬菌體治療肺部感染的水貂，結果顯示給予噬菌體治療12 d后水貂存活率為80%。肺部感染銅綠假單胞菌的小鼠經鼻吸入噬菌體制劑，可以有效地殺滅銅綠假單胞菌，用噬菌體治療6 h后可將細菌負荷降低到不可檢測的水平；而未經噬菌體制劑處理的小鼠，其肺部的銅綠假單胞菌細胞大量增殖[10]。Debarbieux研究團隊也證實了在小鼠肺部感染銅綠假單胞菌2 h后,使用經鼻吸入噬菌體制劑可以挽救95%的小鼠[11]。Oduor等[12]研究發現，靜脈注射噬菌體制劑可以治療金黃色葡萄球菌誘導的小鼠肺炎，以108PFU/mL的滴度給噬菌體，可以將細菌載量從8 CFU/g降低到0.5 CFU/g。為了解噬菌體治療長期慢性肺部感染的效果，一項研究在小鼠肺部感染銅綠假單胞菌6 d后，通過經鼻吸入噬菌體，能有效減少小鼠肺部的細菌數量[13]，提示噬菌體療法在治療慢性呼吸道感染方面具有潛力。

3.3 胃腸道感染 胃腸道感染的常見致病菌有大腸埃希菌、空腸彎曲桿菌、腸沙門菌和單核細胞增生李斯特菌等，一些不常見的致病菌如艱難梭菌和霍亂弧菌也可以引起腸胃炎。在兔感染霍亂弧菌后的6 h和12 h予以混合噬菌體治療，結果證實兩組都可以減少霍亂弧菌的數量[14]。倉鼠模型證實，混合噬菌體可顯著減少艱難梭菌感染36 h后的定植，并將疾病癥狀的開始時間延遲33 h[15]。Galtier等[16]證實噬菌體可以有效減少腸道病原體，且與抗生素相比，噬菌體對腸道微生物群組成的影響也更小。另外，研究表明噬菌體療法的效果和使用噬菌體的時間有關。試驗表明，在兔感染霍亂弧菌之后的6 h和12 h分別口服噬菌體制劑，都能減少霍亂弧菌的載量；但在霍亂弧菌感染之前的6 h和12 h分別口服噬菌體制劑，都不能使霍亂弧菌載量減少[14]。該試驗表明，在感染霍亂弧菌后數小時內口服噬菌體能夠減少病原體，但提前使用噬菌體不能起到預防性抗感染效果。

3.4 泌尿道感染 泌尿道感染多由腸桿菌目細菌引起。研究者先向小鼠膀胱中注射致死劑量的致病性大腸埃希菌，再立即向小鼠腹腔中注入噬菌體，之后觀察到噬菌體被注入腹腔后還可以分泌到尿液中；還發現噬菌體治療泌尿道感染的效果與噬菌體種類和劑量有關：在MOI=60的情況下，T4噬菌體抗感染效果最好，可以使小鼠100%存活[17]。長期留置導尿管的患者容易發生泌尿道感染，有文獻報道在留置的導尿管上涂抹針對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和奇異變形桿菌的噬菌體后，導尿管上細菌生物膜的形成可顯著減少[18]。一例難治性銅綠假單胞菌泌尿道感染的患者，通過抗生素聯合噬菌體輔助治療后最終連續6個月尿培養為陰性[19]。

3.5 菌血癥 菌血癥常導致短時間內的快速死亡，因此通常在細菌感染后不久立即應用噬菌體治療。Schneider等[20]給小鼠注射致死劑量的大腸埃希菌導致菌血癥，分別在注射細菌后的10 min和60 min注射同等劑量噬菌體，觀察到小鼠存活率分別為100%、95%，在細菌感染后3 h注射噬菌體則沒有小鼠存活。另一項研究表明，在大腸埃希菌導致的大鼠菌血癥模型中，分別在注射細菌后7 h和24 h給予噬菌體，大鼠存活率分別為100%和50%[21]。除了小鼠模型外，也有研究者采用果蠅模型評估噬菌體治療菌血癥的療效。通過給黑腹果蠅注射致死劑量的銅綠假單胞菌建立菌血癥模型，再給其喂食噬菌體，結果顯示能夠顯著延緩或防止果蠅死亡。研究表明，與單一噬菌體治療相比，注射三種肺炎鏈球菌噬菌體雞尾酒制劑具有更強的治療效果[22]。關于給藥方式，Oliveira等[23]研究表明，噬菌體治療菌血癥最合適的途徑是靜脈注射。

3.6 其他特殊部位感染

3.6.1 腹腔感染 腹腔感染(intra-abdominal infection，IAI)包括腹腔內單個臟器感染、腹腔膿腫以及腹膜炎，根據其感染范圍及嚴重程度可分為單純性腹腔感染和復雜性腹腔感染。腹腔感染若不能有效控制，還可以引起膿毒血癥、感染性休克、多器官功能衰竭[24]。將致死劑量的金黃色葡萄球菌注射到小鼠單側腹腔內，試驗組分別在感染后0、1、2 h將噬菌體制劑注射到另一側腹腔內，對照組將SM緩沖液注射到另一側腹腔內，結果顯示感染后0、1、2 h，用噬菌體處理的小鼠7 d后存活率分別為80%、80%、50%；用SM緩沖液處理的對照組7 d后存活率為0；同時，給未感染金黃色葡萄球菌的小鼠腹腔內注射噬菌體，7 d后存活率為100%，表明噬菌體治療可以抵抗金黃色葡萄球菌腹腔感染，提高小鼠存活率，且噬菌體療法是安全的[25]。

3.6.2 眼部感染 研究人員用含有銅綠假單胞菌噬菌體的滴眼液外用于正常小鼠的角膜，結果顯示不會引起角膜混濁或炎性細胞浸潤等炎癥反應。隨后選擇銅綠假單胞菌性角膜炎小鼠模型，在角膜感染后30 min用含噬菌體的滴眼液滴眼，結果顯示試驗組小鼠5 d后角膜結構基本恢復正常，而未經噬菌體處理的對照組小鼠5 d后角膜大部分已穿孔[26]。在小鼠角膜感染銅綠假單胞菌30 min以及1、3、6、12 h后，用含有兩種噬菌體的滴眼液滴眼，結果顯示，在角膜感染30 min后給予噬菌體滴眼液可預防角膜炎；在角膜感染后3 h內給予噬菌體滴眼液，小鼠角膜細菌計數與對照組相比差異有統計學意義，表明具有抗菌作用[27]。

3.6.3 耳部感染 將含有6種不同噬菌體的雞尾酒制劑注入患有慢性銅綠假單胞菌性中耳炎的狗耳道中，在治療48 h后臨床評分和細菌計數均下降，且未發現不良反應[28]。一項評價噬菌體制劑治療慢性中耳炎的臨床試驗，研究者將24例持續數年的耐藥銅綠假單胞菌慢性中耳炎患者隨機分為2組，分別用噬菌體和安慰劑進行治療，結果顯示噬菌體治療組患者銅綠假單胞菌數量明顯減少，且未發現局部或全身副作用，而安慰劑組患者細菌計數則沒有明顯變化[29]。

3.6.4 口腔感染 一項研究用腸球菌噬菌體制劑治療大鼠根管感染，將噬菌體制劑注射到大鼠根管中，凝膠化過程中噬菌體在根管內進一步擴散，經過持續3周的治療后，腸球菌細菌計數減少99%[30]。

4 噬菌體治療的優勢和局限性

4.1 噬菌體治療的優勢 噬菌體在自然界中分布廣泛，分離途徑比較簡單，且周期短，一般只需要數周左右。與抗菌藥物研發周期動輒數年甚至數十年相比，噬菌體具有研發周期短、投入成本低的優點。由于抗菌藥物具有廣譜抗菌能力，除了致病菌外還可以殺滅體內其他非致病菌，因此長期使用抗菌藥物會引起體內菌群失調，還可能引發機會感染。噬菌體是特異性感染宿主菌，一種噬菌體只能侵染特定病原菌，因此不會影響機體其他正常菌群。目前，已有大量研究表明噬菌體治療不會產生明顯副作用，噬菌體療法的安全性得到了初步認可。抗菌藥物對細菌生物膜的治療效果有限，但噬菌體可以通過分泌細胞壁水解酶、胞外多糖解聚酶等破壞細菌生物膜結構，從而治療細菌生物膜感染[31-32]。長時間應用抗菌藥物，細菌容易產生抗性，有文獻報道細菌對抗菌藥物產生耐藥性的突變頻率為10-5。雖然細菌對噬菌體也可以產生抗性，但噬菌體可以和細菌共同進化以此來對抗其產生的抗性，相關文獻報道細菌對噬菌體產生抗性的突變頻率為10-7[2,33]。因此，面對目前抗菌藥物耐藥問題逐漸嚴重的形勢，噬菌體可以提供一個新的治療方向。

4.2 噬菌體治療的局限性 細菌被噬菌體裂解后可以釋放內毒素，且噬菌體表面的蛋白質成分也可以作為抗原引發機體的免疫反應，進而影響噬菌體的復制，甚至導致噬菌體的滅活，最終降低其裂解細菌的能力。噬菌體侵染細菌具有高度特異性，抗菌譜也很窄，因此通常需要使用含多種噬菌體的雞尾酒制劑來擴大抗菌范圍，這也使生產難度和成本相應增加[34]。部分噬菌體攜帶有毒力基因，當噬菌體進入宿主菌后，毒力基因可以在裂解細菌的過程中不斷表達，從而產生毒力因子，對人體產生不利影響[35]。雖然目前已有較多針對噬菌體療法的動物試驗，但用于人體的臨床試驗仍相對不足，在除俄羅斯和波蘭等東歐國家以外的大部分地區，噬菌體還缺乏有效的監管標準，也沒有獲得政府部門的授權許可。因此，在未來，噬菌體療法仍有許多挑戰和難題需要解決。

5 總結

日益嚴重的細菌耐藥問題使得既往被忽視的噬菌體重回廣大研究者視線，近年來關于噬菌體的研究也逐漸增多。目前，已有噬菌體治療各部位細菌感染(如皮膚軟組織、呼吸道、胃腸道、泌尿系統等)的相關研究，但這些研究大多都是動物試驗，如小鼠、兔、水貂模型等，用于人體的臨床試驗研究仍很少。雖然大部分在動物模型中進行的噬菌體治療研究顯示出有效性和安全性，但不能完全代表在人類身上也一定能取得同樣效果。因此，未來可以在確保噬菌體療法足夠安全和有效的前提下，逐漸開展臨床試驗。此外，噬菌體還有攜帶毒力基因、誘導機體產生免疫反應、抗菌譜窄等局限性，這些問題也亟待解決。雖然噬菌體為目前細菌耐藥局面提供了一個有前景的發展方向，但要正式應用于臨床還有許多難題和挑戰需要克服。希望在已有的國內外研究基礎上，未來可以早日突破目前的研究難點，解決耐藥細菌感染問題。