沃柑樹冠不同結(jié)果部位光照條件對果實(shí)品質(zhì)的影響

賈聚金，陳香玲，孫權(quán)，包心茹，張紅艷，徐娟，柴利軍，鄧秀新，葉俊麗

1.園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢 430070；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，南寧 530007

柑橘是我國南方栽培面積最廣、經(jīng)濟(jì)地位最重要的果樹[1]，其果實(shí)外形美觀、色澤多樣、風(fēng)味獨(dú)特，深受消費(fèi)者的喜愛。柑橘果實(shí)品質(zhì)受到多種環(huán)境因素和農(nóng)業(yè)技術(shù)措施的影響，其中光照被認(rèn)為是影響柑橘果實(shí)品質(zhì)的重要環(huán)境因素之一[2]。

色澤作為果實(shí)外觀品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，是消費(fèi)者最直觀的感官體驗(yàn)，直接決定了果實(shí)的經(jīng)濟(jì)效益[3]。柑橘果實(shí)的外觀色澤由其主要呈色色素——類胡蘿卜素的種類和含量決定。在生產(chǎn)上，光照條件對柑橘色澤的影響因品種而異。大多數(shù)柑橘品種在樹冠外圍光照充足的條件下比樹冠內(nèi)遮陰的果實(shí)顏色更鮮艷[4-6]。對一些柑橘品種進(jìn)行套袋處理后，成熟期不套袋果實(shí)比套袋果實(shí)顏色更鮮艷[7-9]。然而也有研究表明，生長在樹冠內(nèi)遮陰的紅葡萄柚(Citrusparadisicv. ‘Star Ruby’)比樹冠外圍光照充足的果實(shí)在成熟期具有更深的紅色[10]。Gao 等[11]測定了光照和黑暗條件下4個(gè)不同品種的柑橘愈傷組織中類胡蘿卜素含量和相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，只有紅馬敘葡萄柚(C.paradisiMacf.)愈傷組織中的類胡蘿卜素含量在光照下顯著下降，其他3種愈傷組織中類胡蘿卜素含量均顯著增加。可見，光照對柑橘類胡蘿卜素代謝的影響因基因型而異。

光照對果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)也具有十分重要的影響。樹體冠層不同部位光照條件的差異被認(rèn)為是造成果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)差異的重要原因。在柑橘[12]、梨[13]、桃[14-15]和蘋果[16]等果樹上的研究結(jié)果顯示，樹冠上層及外圍光照條件較好的果實(shí)可溶性固形物、總糖含量均顯著高于樹冠下部及內(nèi)膛遮陰的果實(shí)；可滴定酸含量的差異則表現(xiàn)不一致。除糖酸外，光照對抗壞血酸的積累也有顯著影響[17]。有研究結(jié)果表明樹冠外圍光照充足的柑橘果皮中抗壞血酸含量顯著高于遮陰的果實(shí)，但是果肉中的抗壞血酸含量未受影響[18]。在蘋果上的研究也表明遮陰的蘋果果皮中抗壞血酸含量顯著降低，果肉中抗壞血酸含量無顯著差異[19]。

沃柑(C.reticulata)果實(shí)色澤艷麗，果肉細(xì)嫩多汁，口感濃甜，品質(zhì)佳，是市場熱銷的晚熟雜柑品種。因種植效益高，近年來沃柑產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，僅廣西的沃柑種植面積已超10萬 hm2[20]。成熟沃柑果實(shí)的果皮有時(shí)呈現(xiàn)誘人的橙紅色，有時(shí)又呈黃色、亮黃色，一定程度上影響了果品的市場歡迎度。本研究前期對多個(gè)沃柑果園進(jìn)行了田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)沃柑樹體不同結(jié)果部位果實(shí)的外觀色澤存在顯著差異，其中光照條件可能為主要影響因素。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對比分析沃柑樹冠外圍光照充足的果實(shí)和樹冠內(nèi)膛遮陰的果實(shí)的內(nèi)外品質(zhì)差異，探究樹體不同結(jié)果部位光照條件差異對沃柑果實(shí)品質(zhì)的影響，以期為深入探究光照調(diào)控果實(shí)風(fēng)味及著色的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為沃柑樹體整形修剪及優(yōu)質(zhì)果品生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理

試驗(yàn)于2021年在廣西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘試驗(yàn)基地進(jìn)行，選取長勢一致的5年生沃柑為試材，砧木為資陽香橙，共9株，每3株作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)。果園樹體栽植方向?yàn)闁|西行向，株行距為2 m×4 m，樹形為自然生長圓頭形，按照常規(guī)栽培措施進(jìn)行管理。于2021年1月中旬果實(shí)成熟期進(jìn)行采樣，每株樹選取樹冠外圍受光照充足的果實(shí)與樹冠內(nèi)部遮陰的果實(shí)各12個(gè)，采樣后立即裝入黑色塑料袋帶回實(shí)驗(yàn)室，拍照后進(jìn)行常規(guī)品質(zhì)測定，之后將果皮和果肉分別取樣，放入液氮速凍后貯存于-80 ℃冰箱中，用于測定類胡蘿卜素、可溶性糖和可滴定酸等生理指標(biāo)以及相關(guān)基因的表達(dá)量。

1.2 測定方法

1)色差值的測定。所用色差儀型號為 Konica Minolta CM-5，在每個(gè)沃柑果實(shí)的赤道面選取 6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行色差測定，并記錄下L*值(亮度值)、a*值(紅綠色度值)、b*值(黃藍(lán)色度值)、H°(色相角)、CCI(色差指數(shù))。其中H°=arctan (b*/a*)，CCI=1000×a*/(L*×b*)，取平均值進(jìn)行分析[14]。

2)類胡蘿卜素的提取與測定。沃柑果皮類胡蘿卜素的提取參照Cao等[21]方法，高效液相色譜(HPLC)分析參數(shù)參照Zheng等[22]。類胡蘿卜素的鑒定根據(jù)標(biāo)樣或其已報(bào)道的特征吸收峰和出峰時(shí)間及順序來判斷[21]。

3)果皮總RNA提取和熒光定量PCR。沃柑果皮RNA提取所用試劑盒(RN38 EASYspin Plus)購自北京艾德萊生物科技有限公司。操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。第一鏈 cDNA 的合成用 HiScript II Q RT Super Mix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒完成。該試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。類胡蘿卜素代謝途徑相關(guān)基因的引物序列參見Cao 等[21]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)參照姜啟航[8]的方法進(jìn)行。actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

4)果實(shí)常規(guī)品質(zhì)的測定。用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測定其橫縱徑，天平測量其單果質(zhì)量，對采自每株樹的12個(gè)果實(shí)進(jìn)行測量，計(jì)算平均值；可溶性固形物和可滴定酸利用PAL-BX/ACID 1糖酸一體機(jī)進(jìn)行測定，抗壞血酸含量用2,6-二氯靛酚滴定法測定[8]。

5)果實(shí)可溶性糖和有機(jī)酸的提取與測定。果肉中可溶性糖和有機(jī)酸的提取、衍生化及氣相色譜的分析參數(shù)參照許讓偉等[23]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel(2010)軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，使用IBM SPSS Statistics 25軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異比較，使用比較平均-獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行測驗(yàn)，柱形圖繪制使用Graphpad Prism 8軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照與遮陰對成熟沃柑果皮著色的影響

與直接暴露在光照下的成熟沃柑果實(shí)相比，遮陰的成熟沃柑果實(shí)果皮顏色表現(xiàn)出更深的橙紅色(圖1)。兩者的亮度值(L*)、紅綠色度值(a*)、黃藍(lán)色度值(b*)存在顯著差異(表1)，其中光照下的沃柑果皮的L*值和b*值顯著高于遮陰果實(shí)，a*值顯著低于遮陰的果實(shí)；且遮陰的果實(shí)色相角(H°)顯著降低，色差指數(shù)(CCI)顯著提高。綜上，遮陰的沃柑果皮紅色程度高，其顏色更深且偏紅；光照充足的沃柑果皮黃色程度高，其呈亮黃色。

圖1 光照與遮陰的成熟沃柑果實(shí)著色差異Fig.1 Differences in coloration of mature Orahmandarin fruits under light and shaded

表1 光照與遮陰的沃柑果皮色差值比較 Table 1 Comparison of color difference values of Orah mandarin peel under light and shaded

2.2 光照與遮陰條件下成熟沃柑果皮的類胡蘿卜素組分和含量變化

利用HPLC對2種光照條件下沃柑果皮中的類胡蘿卜素組分和含量進(jìn)行了測定分析。如圖2所示，成熟的沃柑果皮中富含葉黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、β-檸烏素、紫黃質(zhì)等多種類胡蘿卜素組分，總類胡蘿卜素與各類胡蘿卜素組分均在2種光照條件的沃柑果皮中顯著差異積累。遮陰的沃柑果皮中總類胡蘿卜素含量達(dá)1 898.57 μg/g，其中主要呈色色素9-順式紫黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和β-檸烏素的含量分別達(dá)1 186.78、306.59和215.77 μg/g，分別占總類胡蘿卜素含量的63%、16%和11%。而光照充足的沃柑果皮中總類胡蘿卜素含量僅為490.90 μg/g，其中9-順式紫黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和β-檸烏素的含量分別為158.81、208.85和12.04 μg/g，分別占總類胡蘿卜素含量的32%、43%和2%。與光照充足的沃柑果實(shí)相比，遮陰的沃柑果實(shí)中總類胡蘿卜素、9-順式紫黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和β-檸烏素的含量分別增加了2.87、6.47、0.46和16.93倍，并且紅色色素β-檸烏素的占比也由2%增加到11%。此外，其他類胡蘿卜素組分如八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、β-隱黃質(zhì)等的含量也在遮陰的果實(shí)中顯著升高。這些結(jié)果表明遮陰果實(shí)中總類胡蘿卜素含量、橙色色素9-順式紫黃質(zhì)含量以及紅色色素β-檸烏素含量及其占比均顯著增加，導(dǎo)致其果實(shí)著色加深，最終呈現(xiàn)出深橙紅色。

Phy：八氫番茄紅素 Phytoene； Phytof：六氫番茄紅素 Phytofluene； α-car：α-胡蘿卜素 α-Carotene; β-car:β-胡蘿卜素β-Carotene； Lut：葉黃質(zhì) Lutein；β-cry：β-隱黃質(zhì) β-Cryptoxanthin； Zea：玉米黃質(zhì) Zeaxanthin； β-cit：β-檸烏素β-Citraurin；Vio：紫黃質(zhì) Violaxanthin；9-cis-Vio：9-順式紫黃質(zhì) 9-cis-Violaxanthin； Tot：總量 Total。光照和遮陰的差異用“*”(P<0.05)和“**”(P<0.01)表示。以下同。The difference between light and shaded was makerd by “ * ”(P<0.05) and “ ** ”(P<0.01).The same as below.

2.3 光照和遮陰條件下沃柑果皮類胡蘿卜素代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)差異

為了進(jìn)一步探究遮陰誘導(dǎo)類胡蘿卜素積累的內(nèi)在機(jī)制，本研究測定并對比分析了類胡蘿卜素代謝通路主要結(jié)構(gòu)基因在光照充足與遮陰的沃柑果皮中的表達(dá)量變化。由圖3可知，類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平在2個(gè)處理間存在顯著差異，除LCYE和LCYB1的表達(dá)未受影響，其他主要結(jié)構(gòu)基因在遮陰的沃柑果皮中的表達(dá)量均有不同程度的提高。其中，控制β-檸烏素合成的關(guān)鍵基因CCD4b的表達(dá)差異最顯著，其在遮陰果實(shí)中的表達(dá)量較光照充足的果實(shí)升高了11.78倍，該結(jié)果與β-檸烏素在遮陰果實(shí)中積累量顯著增加相吻合。由此可見，遮陰可通過誘導(dǎo)沃柑果皮類胡蘿卜素代謝通路基因的表達(dá)從而促進(jìn)類胡蘿卜素的高積累。

2.4 光照與遮陰對沃柑果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的影響

對成熟期樹冠外圍光照充足和樹冠內(nèi)部遮陰的沃柑果實(shí)進(jìn)行常規(guī)品質(zhì)的測定與分析，所得結(jié)果如表2所示。兩者間單果質(zhì)量以及果實(shí)大小沒有顯著差異，可溶性固形物、可滴定酸和抗壞血酸含量均差異顯著，在光照充足的沃柑果實(shí)中的含量均顯著高于遮陰的果實(shí)。進(jìn)一步利用氣相色譜測定了2個(gè)處理果實(shí)的可溶性糖和有機(jī)酸組分和含量變化。如圖4所示，兩者的可溶性糖含量和有機(jī)酸含量均存在顯著差異。光照充足的沃柑果實(shí)中蔗糖、葡萄糖、果糖及總糖的含量均顯著高于遮陰的果實(shí)；且檸檬酸、蘋果酸及總酸的含量也顯著高于遮陰果實(shí)。結(jié)果表明，光照條件一定程度上影響了沃柑果實(shí)的內(nèi)在品質(zhì)，與遮陰的沃柑果實(shí)相比，光照充足的果實(shí)糖酸積累量明顯增加。

PSY：八氫番茄紅素合成酶基因； PDS：八氫番茄紅素脫氫酶基因； ZDS：ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因； CRTISO：胡蘿卜素異構(gòu)酶基因； LCYE：番茄紅素ε-環(huán)化酶基因； LCYB1：番茄紅素β-環(huán)化酶1基因； LCYB2：番茄紅素β-環(huán)化酶2基因； HYD：β-胡蘿卜素羥化酶基因；ZEP：玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶基因； CCD4b：類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因； NCED2：9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶2基因；NCED3：9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶3基因。PSY:Phytoene synthase gene; PDS: Phytoene desaturase gene; ZDS: ζ-carotene desaturase gene; CRTISO: Carotene isomerase gene; LCYE:Lycopene ε-cyclase gene; LCYB1:Lycopene β-cyclase 1 gene; LCYB2:Lycopene β-cyclase 2 gene; HYD: β-Carotene hydroxylase gene; ZEP: Zeaxanthin epoxidase gene; CCD4b:Carotenoid cleavage dioxygenase 4b gene; NCED2:9-cis-Epoxycarotenoid dioxygenase 2 gene; NCED3:9-cis-Epoxycarotenoid dioxygenase 3 gene.

表2 光照與遮陰下沃柑果實(shí)常規(guī)品質(zhì)比較 Table 2 Comparison of conventional quality of Orah mandarin fruits under light and shaded

圖4 光照與遮陰的沃柑果實(shí)可溶性糖(A)和有機(jī)酸(B)含量差異Fig.4 Differences in the content of soluble sugar (A) and organic acid (B) in Orah mandarin fruits under light and shaded

3 討 論

光照是影響果實(shí)品質(zhì)的重要環(huán)境因素之一，對果實(shí)的外觀品質(zhì)及風(fēng)味具有重要的影響[24]。在生產(chǎn)中，樹體不同部位的果實(shí)由于受到不同程度的光照條件而表現(xiàn)出色澤差異，特別是樹冠內(nèi)膛遮陰的果實(shí)與樹冠外圍光照充足的果實(shí)往往表現(xiàn)出明顯的不同。前人研究發(fā)現(xiàn)樹冠外圍的克里曼丁紅橘 (C.clementinacv. ‘ Clemenules’) 和奈維林娜臍橙 (C.sinensiscv. ‘Navelina’)果實(shí)比樹冠內(nèi)膛遮陰的果實(shí)著色更深，而紅葡萄柚果實(shí)則在遮陰條件下比光照條件下具有更高的番茄紅素含量，色澤更紅[6,10]。本研究發(fā)現(xiàn)沃柑果實(shí)色澤對光照的響應(yīng)與紅葡萄柚相似，樹冠內(nèi)部被遮陰的果實(shí)較光照充足的果實(shí)表現(xiàn)出更深的橙紅色，其主要呈色色素β-檸烏素、紫黃質(zhì)的含量顯著增加。由此推測，光照對柑橘果實(shí)色澤的調(diào)控效應(yīng)因基因型及其主要呈色類胡蘿卜素種類而異。

光照通過調(diào)控類胡蘿卜素代謝途徑基因的表達(dá)水平來影響類胡蘿卜素的積累。番茄果實(shí)中光照誘導(dǎo)了光合組織中類胡蘿卜素合成基因的表達(dá)，促進(jìn)了果實(shí)中類胡蘿卜素的積累[25-26]。而在胡蘿卜根中的研究發(fā)現(xiàn)黑暗處理可誘導(dǎo)其類胡蘿卜素的積累與基因的表達(dá)[27-28]。在克里曼丁紅橘和奈維林娜臍橙成熟過程中，光照提高了果皮中類胡蘿卜素代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)量，類胡蘿卜素總量增加，其中八氫番茄紅素和紫黃質(zhì)含量顯著提高[6]。紅葡萄柚在弱光條件下積累更多的番茄紅素而呈現(xiàn)更深的紅色，但研究發(fā)現(xiàn)其類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)在不同光照條件下無顯著差異，進(jìn)一步推測該現(xiàn)象可能與質(zhì)體分化有關(guān)，認(rèn)為暗處理通過促進(jìn)紅葡萄柚果皮中的葉綠體分化為有色體從而增強(qiáng)了類胡蘿卜素的積累[10]。本研究對2種光照條件下沃柑果皮中的類胡蘿卜素代謝通路相關(guān)基因進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)與光照充足的沃柑果實(shí)相比，遮陰的沃柑果皮中類胡蘿卜素代謝通路相關(guān)基因表達(dá)量均有不同程度的增加，其中合成β-檸烏素的關(guān)鍵基因CCD4b的表達(dá)量增加了11.78倍，與β-檸烏素的高積累結(jié)果相一致。值得一提的是，在克里曼丁紅橘和奈維林娜臍橙的研究中并未觀察到遮陰對果皮中β-檸烏素積累和CCD4b表達(dá)的影響。可見，光照對柑橘果皮類胡蘿卜素代謝的調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，后續(xù)有待針對不同的基因型進(jìn)行深入解析。

光照通過調(diào)控糖酸代謝水平影響果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)。前人研究表明，光照對柑橘的可溶性固形物和總糖含量影響較大，果實(shí)的遮陰處理影響了果實(shí)中糖代謝相關(guān)酶的活性，進(jìn)而影響了果實(shí)中糖的運(yùn)輸、代謝與積累[29]。本研究也發(fā)現(xiàn)光照充足的沃柑果實(shí)中可溶性固形物、蔗糖、果糖、葡萄糖含量均顯著高于遮陰的沃柑果實(shí)。這可能是由于樹冠外圍光照充足，有利于葉片進(jìn)行光合作用，促進(jìn)了碳水化合物的積累和果實(shí)中含糖量的增加。光照對柑橘果實(shí)有機(jī)酸的影響因基因型而異，羅麗娟等[30]研究發(fā)現(xiàn)溫州蜜柑果實(shí)的檸檬酸含量受到溫度、光照、干旱脅迫等多種環(huán)境因素的影響，遮光處理顯著提高了果實(shí)檸檬酸的含量；與之相反，本研究發(fā)現(xiàn)樹冠外圍光照充足的沃柑果實(shí)可滴定酸、檸檬酸、蘋果酸及總酸的含量均顯著高于內(nèi)膛遮陰的果實(shí)。光照對柑橘果實(shí)抗壞血酸的影響與組織部位(果皮/果肉)和基因型有關(guān)，Lado等[2]發(fā)現(xiàn)光照充足條件下4個(gè)柑橘品種果實(shí)果皮的抗壞血酸含量均較遮陰的果實(shí)顯著高積累，但果肉抗壞血酸含量無顯著差異；本研究結(jié)果表明，與遮陰果實(shí)相比，光照條件下沃柑果肉中的抗壞血酸含量顯著增加。抗壞血酸的合成前體是光合作用產(chǎn)生的碳水化合物，遮陰導(dǎo)致光合作用降低，影響了果實(shí)中葡萄糖的積累，這可能是導(dǎo)致光照和遮陰條件下果實(shí)抗壞血酸含量差異的原因。