基于網絡藥理學的淫羊藿增強免疫功能作用機制研究

梁彪 高家治 徐朝輝 王建東 施展

摘要 目的：通過網絡藥理學探討淫羊藿增強免疫功能可能的作用機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索淫羊藿的活性成分和靶點。利用Cytoscape 3.7.1軟件構建“藥物-活性成分-靶點”網絡圖。通過人類基因數據庫（GeneCards）檢索免疫抑制的相關靶點，利用STRING數據庫進行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡分析，利用DAVID平臺進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集通路分析。結果：篩選出淫羊藿21個有效活性成分，179個潛在靶點。GO生物過程共562條，包括信號轉導、炎癥反應、凋亡過程等;KEGG信號通路共120條，主要涉及癌癥途徑、MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路等。結論：淫羊藿的活性成分通過作用于AKT1、TP53、IL6、VEGFA等靶點，參與信號轉導等生物過程，調控癌癥途徑、TNF信號通路等多個途徑發揮增強免疫功能的作用。

關鍵詞 淫羊藿;免疫功能;網絡藥理學;作用機制;成分;靶點;富集分析;信號通路

Study on the Mechanism of Herba Epimedii Enhancing Immune Function Based on Network Pharmacology

LIANG Biao，GAO Jiazhi，XU Zhaohui，WANG Jiandong，SHI Zhan

（Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Herba Epimedii to enhance immune function based on network pharmacology.Methods：The components and targets of Herba Epimedii were obtained by searching for Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform.Cytoscape 3.7.1 was used to build a network among drug，components and targets（drug-component-target network）.Targets for immunosuppression were screened through GeneCards.Protein interaction network analysis was performed by using the STRING database.Gene ontology analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes signal pathway enrichment analysis were performed by using the DAVID platform.Results：A total of 21 active ingredients and 179 potential targets of Herba Epimedii were screened.There were 562 GO biological process，including signal transduction，inflammatory response，apoptotic process，etc.There were 120 KEGG signaling pathways，including Pathways in cancer，MAPK signaling pathway，PI3K-AKT signaling pathway，TNF signaling pathway.Conclusion：The active ingredients of Herba Epimedii play a role in enhancing immune function by acting on AKT1，TP53，IL6，VEGFA and other targets，participating in biological processes such as signal transduction，regulating cancer pathways，TNF signaling pathways and other pathways.

Keywords Herba Epimedii; Immune function; Network pharmacology; Mechanism; Components; Target; Enrichment analysis; Signaling pathway

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.011

淫羊藿又名仙靈脾，是臨床常用補益類中藥，根據《中華人民共和國藥典》記載，淫羊藿具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效，《神農本草經》記載：“味辛寒。主陰痿絕傷，莖中痛，利小便，益氣力，強志……”并將其列為中品。研究表明，淫羊藿可以增強機體的免疫功能，對免疫器官、巨噬細胞、T淋巴細胞等均具有一定的影響[1]。目前關于中藥及復方研究方法往往具有一定的局限性，難以更加全面地闡述其藥效物質基礎和作用機制。本研究運用網絡藥理學的研究方法，探討淫羊藿增強免疫功能的潛在作用靶點及相關通路，以期為臨床應用和進一步的實驗研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 淫羊藿活性成分和靶點的收集

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺[2]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https：//tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）中，檢索淫羊藿的活性成分及活性成分對應的靶點，時間截止至2020年11月20日。設置口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18[3]作為篩選條件獲得淫羊藿的活性成分，通過Uniprot數據庫[4]（https：//www.uniprot.org）將淫羊藿的靶點進行規范。

1.2 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖的構建

將篩選得到的淫羊藿的活性成分和靶點整理成Excel文件，導入CytoScape3.7.1軟件[5]，構建“藥物-活性成分-靶點”網絡圖，通過分析相關參數，對淫羊藿關鍵活性成分進行篩選。

1.3 免疫抑制相關靶點的收集及共同靶點的獲取? 在GeneCards數據庫[6]（https：//www.genecards.org/）中，以“immunosuppression”為檢索詞進行檢索并篩選，得到免疫抑制相關的疾病靶點。在Venny2.1.0在線作圖平臺（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲取淫羊藿與免疫抑制的共同靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖的構建及核心靶點的篩選

將藥物與疾病的共同靶點導入STRING數據庫[7]（https：//string-db.org/），選擇“multiple proteins”“Homo sapiens”，構建PPI網絡圖，并根據Degree值大小篩選核心靶點。

1.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析

DAVID數據庫[8-9]（https：//david.ncifcrf.gov/）能夠對給定基因或蛋白質的生物學意義進行系統分析，將藥物與疾病的交集靶點導入DAVID6.8數據庫，進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，進行GO分析時選擇BP模塊，KEGG分析選擇PATHWAY模塊。

2 結果

2.1 淫羊藿活性成分和靶點的收集

檢索到淫羊藿130個活性成分，經過OB和DL參數初步篩選后共獲得23個活性成分，剔除2個（MOL004394、MOL004425）未查詢到靶點的活性成分，最終獲得21個活性成分。見表1。檢索得到對應的511個靶點蛋白，獲取179個靶點基因。

2.2 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖的構建

將篩選得到的淫羊藿21個活性成分、179個靶點基因，構建“藥物-活性成分-靶點”網絡圖。見圖1。網絡圖中“節點”（Node）代表屬性類型，如化合物、靶點、藥物、疾病等，“邊”（Edge）代表交互關系，連接度（Degree值）越大，代表其重要性越大。網絡圖中共包括201個節點，405條邊。圖中紅色節點代表活性成分，綠色節點代表藥物，藍色節點代表靶點基因。

網絡分析結果可知，槲皮素、木犀草素等6種活性成分能與24個以上靶點連接，可認為這6種活性成分是淫羊藿的主要活性成分。見表2。

2.3 免疫抑制相關靶點的收集及共同靶點的獲取? 在GeneCards數據庫檢索免疫抑制的相關靶點，共檢索到3 627個相關靶點，將篩選出來的179個藥物靶點與3 627個疾病靶點在Venny2.1.0在線作圖平臺取交集得到138個共同靶點。見圖2。

2.4 PPI網絡圖的構建及核心靶點的篩選

將篩選得到的138個共同靶點導入STRING數據庫，置信度設置為>0.4，并剔除游離靶點，獲得PPI網絡圖。見圖3。再將STRING數據庫中獲得的相關數據導入CytoScape3.7.1軟件，進一步調整得到PPI網絡。見圖4。每個節點（Node）代表1個靶點，邊（Edge）代表靶點之間存在相互作用關系。根據Degree值的大小設置節點大小;Combined score值越大，邊線顏色越粗且越深。研究結果顯示，PPI網絡圖中共有137個節點，2 573條邊，平均度值為37.5，大于平均度值的靶點有57個。見表3。Degree值排名前10位的靶點為AKT1、TP53、IL6、VEGFA、JUN、TNF、CASP3、MAPK1、MYC、EGFR，可認為這些靶點是淫羊藿增強免疫功能的潛在核心靶點。

2.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析

GO富集分析共有562條結果，KEGG富集分析有120條信號通路。圖5展示顯著程度前20的GO生物功能富集結果。橫軸代表該通路基因占所有基因的比率（Ratio），縱軸代表GO生物過程信息條目。氣泡顏色由紅到綠代表P值由小變大，P值越大代表顯著性越強。氣泡越大代表該通路的基因個數（Count值）越多。由圖5可知，涉及的主要GO生物過程有RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控（Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase Ⅱ Promoter）、信號轉導（Signal Transduction）、轉錄正調控，DNA模板（Positive Regulation of Transcription，DNA-templated）、凋亡過程的負調控（Negative Regulation of Apoptotic Process）、轉錄，DNA模板（Transcription，DNA-templated）、炎癥反應（Inflammatory Response）、對藥物的反應（Response to Drug）、基因表達的正調控（Positive Regulation of Gene Expression）、積極調控細胞增殖（Positive Regulation of Cell Proliferation）、凋亡過程（Apoptotic Process）等，表明淫羊藿可通過參與多個生物過程，從而發揮增強免疫功能的作用。KEGG通路富集分析結果見圖6，主要包括癌癥途徑（Pathways in Cancer）、TNF信號通路（TNF Signaling Pathway）、PI3K-AKT信號通路（PI3K-AKT Signaling Pathway）、MAPK信號通路（MAPK Signaling Pathway）、Proteoglycans in cancer、HTLV-I infection、Influenza A、MicroRNAs in cancer等。

2.6 “基因-通路”網絡圖的構建

根據KEGG分析結果，將較顯著的信號通路與對應的靶點基因構建“基因-通路”網絡圖。見圖7。該網絡圖中共有20條信號通路，95個靶點基因，471條相互作用關系。Degree值>10的靶點有AKT1、RELA、MAPK1、IKBKB、CHUK、RAF1、MAPK8、TNF、NFKBIA、IL6、TP53等，這些靶點可能是淫羊藿增強免疫功能的關鍵靶點基因。

3 討論

免疫功能主要是由機體的免疫系統發揮作用，構成免疫系統的重要組成部分主要由免疫器官（骨髓、脾臟、胸腺等）、免疫細胞（淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等）、免疫活性物質（抗體、免疫球蛋白、腫瘤壞死因子等）組成，免疫系統是防御病原體入侵最有效的系統，它能夠識別和清除外來病原微生物，并識別和清除體內突變的衰老細胞、死亡細胞及其他有害成分，以維持機體內環境穩定。相關研究表明，某些含多糖類、黃酮類、生物堿類等成分的中藥對免疫系統具有雙向調節作用，其主要藥理作用之一是促進淋巴細胞、單核巨噬細胞、造血干細胞的生理功能，從而增強機體細胞免疫及體液免疫功能[10-12]。中醫學認為補益類中藥能夠增強人體的抵抗力，現代研究證實淫羊藿的有效活性成分對機體主要的免疫器官胸腺和脾臟具有重要的調節作用，通過巨噬細胞、NK細胞等免疫細胞影響特異性和非特異性免疫，通過IL-2、IL-3、IL-6、TNF-α等細胞因子發揮免疫調節作用，此外，淫羊藿對內分泌系統、生殖系統、心腦血管系統等都具有較強的生物學作用[13-14]。

通過網絡藥理學的研究方法，在TCMSP中共篩選出淫羊藿21種活性成分，在Uniprot數據庫中獲取179個相關的靶點基因，并構建了“藥物-活性成分-靶點”網絡圖。結果表明，淫羊藿的有效活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、C-高赤霉素，1，6-二氫-3，15，16-三甲氧基-，（3β）-、脫水角蛋白、8-（3-甲基丁-2-烯基）-2-苯基色酮等。相關研究表明這些成分都具有抗炎、抗腫瘤、增強免疫功能等作用[15-18]。在GeneCards數據庫中檢索到3 627個免疫抑制相關靶點，通過與藥物靶點取交集得到138個潛在靶點。對PPI網絡圖進一步分析可知，靶點與靶點之間的相互關系共有2 573種，AKT1、TP53、IL-6、VEGFA、JUN、TNF、CASP3、MAPK1、MYC、EGFR等是淫羊藿增強免疫功能的主要作用靶點。AKT1是稱為AKT激酶的3種緊密相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一，它調節許多過程，包括代謝、增殖、血管生成等[19-20]。腫瘤壞死因子（TNF）是一種調節細胞因子，在免疫系統中對蛋白質的信號傳遞起著至關重要的作用，可參與多種生理活動，組織免疫細胞之間進行信息交流[21]。IL-6是由間質細胞、造血細胞、上皮細胞等多種細胞產生的具有多效性的細胞因子，通過刺激抗體的產生和效應T細胞的發育進而對獲得性免疫應答起到重要的作用[22-23]。

GO富集分析結果表明，淫羊藿可參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、信號轉導、DNA轉錄正調控、凋亡過程的負調控、炎癥反應、基因表達的正調控、細胞增殖正調控、凋亡過程等多個生物過程，從而發揮增強免疫功能的作用。KEGG富集分析結果顯示，淫羊藿增強免疫功能涉及的主要通路有癌癥途徑、PI3K/AKT信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路等。PI3K屬于磷脂激酶家族，機體內多種因子均能激活PI3K，調控細胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種信號轉導[24]。研究表明淫羊藿的活性成分淫羊藿苷可通過影響PI3K/AKT信號通路激活抑制A549細胞成活和轉移，增強對凋亡的抑制作用[25]。因此，淫羊藿的有效活性成分可通過參與多個生物過程，調控多個信號通路，進而發揮增強免疫功能的作用。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學方法探究淫羊藿增強免疫功能的潛在作用機制，總結出淫羊藿增強免疫功能可能的主要靶點及信號通路，也體現了中藥多成分、多靶點、多通路的特點，為淫羊藿的臨床應用和進一步的實驗研究提供了一定的理論依據。

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（2020-12-15收稿 責任編輯：馬雪玲，徐穎）