基于激光誘導擊穿光譜技術的納米銀定性定量分析方法開發

陳晨 李永圓 王海霞 于洋 李正

摘要 目的：納米粒子特有的小尺寸效應和表面效應使得納米銀粒子具有廣譜抗菌活性。但納米銀粒子濃度過高可能會對其他細胞或器官等造成毒性或損傷，所以為了更好地發揮抗菌活性，對納米銀粒子進行快速、準確的分析是極為必要的。方法：通過對納米銀粒子吸附方法和紙基芯片的優化和篩選，測定納米銀粒子的激光誘導擊穿光譜圖。通過特征峰位與標準譜圖庫進行比對對納米銀粒子進行定性分析，通過特征光譜強度與納米銀濃度的線性回歸關系建立納米銀粒子分析的定量模型。結果：通過重復3次“浸漬-干燥”工藝，定量濾紙表面吸附的納米銀粒子在328 nm、338 nm、520 nm、546 nm和827 nm處顯示出銀的特征峰。在312.5～5 000 μg/mL濃度范圍內，520 nm波長處納米銀的特征峰強與濃度呈良好線性關系（r=0.998 8）。結論：激光誘導擊穿光譜分析技術可用于納米銀定性定量分析，分析方法準確，靈敏度高，且檢測過程方便便捷，易于實際推廣。

關鍵詞 激光誘導擊穿光譜;納米銀;定量分析;定性分析

Development of Qualitative and Quantitative Analysis Method of Silver Nanoparticles Based on Laser Induced Breakdown Spectroscopy

CHEN Chen1，LI Yongyuan1，WANG Haixia1，2，3，YU Yang1，2，3，LI Zheng1，2，3

（1 College of Pharmaceutical Engineering of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China; 2 State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China; 3 Haihe Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 301617，China）

Abstract Objective：The unique small size effect and surface effect of nanoparticles make silver nanoparticles have broad-spectrum antibacterial activity.However，too high concentration of silver nanoparticles may cause toxicity or damage to other cells or organs.Therefore，in order to better exert antibacterial activity，it is extremely necessary to analyze silver nanoparticles quickly and accurately.Methods：By optimizing and screening the nano-silver particle adsorption method and paper-based chip，the laser-induced breakdown spectra of nano-silver particles were measured.The qualitative analysis of nano-silver particles was carried out by comparing the characteristic peak position with the standard spectral library，and the quantitative model of nano-silver particle analysis was established by the linear regression relationship between the characteristic spectral intensity and the concentration of nano-silver.Results：By repeating the “dipping-drying” process three times，the nano-silver particles adsorbed on the surface of the quantitative filter paper showed characteristic peaks of silver at 328 nm，338 nm，520 nm，546 nm and 827 nm.In the concentration range of 312.5～5 000 μg/mL，the characteristic peak intensity of nano-silver at the wavelength of 520 nm had a good linear relationship with the concentration （r=0.998 8）.Conclusion：The LIBS analysis technology can be used for qualitative and quantitative analysis of nano-silver.The analysis method is accurate and sensitive，and the detection process is convenient and convenient，which can be easily used in practice.

Keywords Laser induced breakdown spectroscopy; Nano-silver particles; Quantitative analysis; Qualitative analysis

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.004

納米銀顆粒具有廣譜抗菌活性，對多種革蘭陽性、革蘭陰性細菌具有抑菌和殺菌作用[1]。據報道，納米銀粒子主要的抑菌機制是基于納米銀表面的陽離子與細菌蛋白中的硫醇基團間的特異性結合能力，在細菌表面黏附積累并穿透細胞膜，導致細胞膜和細胞成分被破壞，從而抑制或阻止細菌生長和細胞分裂，最終導致細菌死亡[2]。這種抑菌活性與納米銀顆粒的大小、形狀和濃度緊密相關，如果濃度過高，會對其他細胞或器官等造成毒性或嚴重損傷[3]。因此，對納米銀粒子建立準確的分析方法對于其更好地發揮抗菌活性是極為必要的。

目前，對銀離子和單質銀的定性和定量分析方法較為成熟，而對納米銀粒子的分析研究比較少。應用于納米銀分析檢測的方法主要有電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）[4]、原子吸收光譜法（AAS）[5]、原子發射光譜法（AES）[6]、分光光度法[7]和電化學分析法[8]等。但上述方法均存在一定的缺陷，如ICP-MS方法測試成本高，普及化應用程度低。AAS和AES方法都需要復雜的前處理工藝，耗時較長。分光光度法受干擾因素較多，且對樣品濃度有一定限制。而電化學分析法穩定性不高，靈敏度也有待于進一步提高。因此，對納米銀的分析檢測方法不僅要求準確度高，而且要便捷、易用，便于實際推廣。

本文采用激光誘導擊穿光譜（Laser Induced Breakdown Spectroscopy，LIBS）[9]技術用于納米銀的定性和定量分析研究。LIBS分析技術基于“蓄能-釋放”的模式，將高能量在很短的時間內釋放出來，并在物體表面激發出瞬態等離子體并向外發射具有特定波長的光，以此來對被測元素進行分析，檢測靈敏度很高。每次檢測時間僅需一秒左右，方便快速且成本低廉，非常實用。所以這種方法在金屬元素的分析檢測方面引起了很多研究工作者的關注，但是在金屬納米材料，尤其是納米溶膠分析應用方面的研究較少。因為這種技術在液體樣品分析時容易受到溶劑影響，影響檢測效果[10]。因此，如何把液體樣品分析轉化為固體樣品分析，是LIBS技術應用于金屬納米溶膠樣品分析的關鍵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 激光誘導擊穿光譜（海洋光學亞洲公司，型號：LIBS-MX2500+）;電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，美國，型號：AB135-S）;臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H1650R）;紫外可見分光光度計（Agilent公司，美國，型號：Cary 8454）;動態光散射納米粒徑儀（布魯克海文儀器公司，美國，型號：NanoBrook Omni 280137）;高分辨率透射電子顯微鏡（Hitachi公司，日本，型號：HT7700）;傅里葉變換紅外光譜儀（Shimadu公司，日本，型號：IRTracer-100）;純水機（北京頗爾過濾器有限公司，型號：Cascada Ⅰ）。

1.1.2 試劑 硝酸銀（天津市北方天醫化學試劑廠，批號：7761-88-8），檸檬酸鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：6132-04-3）。醋酸纖維素膜（NC膜，孔徑：0.22 μm，北京蘭杰柯科技有限公司，批號：21174257）;慢性定性濾紙（=7 cm，灰分≤0.13，杭州特種紙業有限公司，批號：GS/T1914-2007）;慢性定量濾紙（=9 cm，灰分≤0.01，杭州特種紙業有限公司，批號：0428060216）;pH精密試紙（國藥集團化學試劑有限公司，批號：F507LD0225）。實驗用水為純水機制備的去離子水。

1.2 方法

1.2.1 納米銀顆粒的制備 將50 mL硝酸銀溶液（1 mmol/L）高溫加熱至沸騰后，緩慢滴加27 mL檸檬酸鈉溶液（質量濃度為1%），并繼續攪拌直至溶液顏色變為黃綠色。然后將溶液冷卻至室溫，經多次離心分離去掉上清液得到納米銀溶膠，真空干燥后得到納米銀溶膠顆粒，并于4 ℃冰箱中在氮氣氛中密封保存。

1.2.2 納米銀顆粒的表征 使用紫外可見分光光度計對得到的納米銀溶膠進行吸光度測試，運用傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）考察納米銀顆粒的化學結構特征，并運用高分辨率透射電子顯微鏡（TEM）對納米銀溶膠的形貌進行表征，通過動態光散射納米粒徑儀（DLS）測量納米銀粒子的水合粒徑范圍。

1.2.3 檢測芯片篩選及制備 精密稱定納米銀固體顆粒10 mg，加入1 mL去離子水混勻后放入超聲機里分散成均勻溶液后取出得到濃度為10 000 μg/mL的供試品溶液。然后用去離子水逐級稀釋得到濃度為5 000 μg/mL、2 500 μg/mL、1 250 μg/mL、625 μg/mL和312.5 μg/mL的納米銀溶液。選取NC膜、pH精密試紙、定性濾紙和定量濾紙作為4種紙基芯片用于納米銀顆粒吸附。將這4種紙基芯片分別打孔制成直徑為0.8 cm的圓形紙片，將這4種芯片分別浸漬于特定濃度的納米銀溶液中，10 min后取出紅外燈烘干，此為“浸漬-干燥”過程，此過程分別重復1次、2次、3次，得到不同吸附次數的檢測芯片，考察不同紙基芯片的吸附效果及不同吸附過程的影響。

1.2.4 LIBS光譜校正及采集 在LIBS光譜采集前需要用空白芯片進行校正。通過調整MVCMltDvc攝像頭軟件，固定激光與載物臺的垂直距離。再水平調整載物臺坐標，使激光光束垂直且依次照射于檢測芯片的三等分面積內，測試3次，記錄坐標值。檢測芯片依據這3組坐標值進行LIBS光譜采集。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 標準曲線 精密量取5個濃度的納米銀供試品溶液各1 mL，將吸附效果最好的紙基芯片分別浸漬于不同濃度的供試品溶液中，通過“浸漬-干燥”過程后測量紙基芯片中納米銀顆粒的LIBS光譜。以濃度（C，μg/mL）為橫坐標，特征波峰處的峰強值為縱坐標繪制標準曲線，并計算回歸方程。

1.2.5.2 精密度試驗 將一個吸附效果最好的紙基芯片浸漬于625 μg/mL的供試品溶液中，重復3次“浸漬-干燥”過程后，在紙基芯片的不同位點處采集6次LIBS光譜，計算峰強的相對標準偏差（RSD）值。

1.2.5.3 穩定性試驗 將一個吸附效果最好的紙基芯片浸漬于312.5 μg/mL的供試品溶液中，重復3次“浸漬-干燥”過程后，分別隔0、1、2、3 h后進行LIBS光譜測試，并考察結果穩定性。

1.2.5.4 重現性試驗 平行選取六片吸附效果最好的紙基芯片，分布浸漬于6個同等濃度的納米銀溶膠（312.5 μg/mL）中，重復3次“浸漬-干燥”過程后，進行LIBS光譜測試，并考察結果重現性。

1.2.5.5 加樣回收率 在1 mL濃度為1 250 μg/mL納米銀溶液中分別加入1 mL濃度為1 250 μg/mL、625 μg/mL，312.5 μg/mL的溶液，每個濃度重復測定3次并計算濃度實測值，和理論濃度值做對比計算回收率。

2 結果

2.1 納米銀溶液表征 紫外-可見光譜圖可以看出納米銀粒子的吸收峰在417 nm處，與文獻中記錄的特征吸收波長基本一致，說明通過化學反應成功制備納米銀溶液。見圖1。納米銀粒子的TEM檢測結果可以看出納米銀的平均粒徑為60 nm，呈橢球形分布。見圖2。

通過DLS對合成的納米銀顆粒的水合粒徑進行表征，從圖3可以看出合成的納米銀顆粒粒徑分布在35～75 nm之間，分布較寬。此外，采用FTIR技術對制備的納米銀顆粒進行結構表征。見圖4。納米銀在3 433 cm-1處的顯著吸收峰歸屬于O-H伸縮振動，在1 581 cm-1處的吸收峰對應于C=O伸縮振動，而在1 381 cm-1處的吸收峰代表C-H伸縮振動[11]。

2.2 紙基芯片篩選 為了考察NC膜、pH精密試紙、定性濾紙和定量濾紙4種芯片的吸附性能，將混合紫薯紫染料后的納米銀溶膠滴于4種材質的紙基芯片上，3 min后觀察吸附效果。pH試紙片上中心區域顏色較深，邊緣處淺，“咖啡環”明顯，說明擴散不夠均勻。而納米銀顆粒在NC膜上擴散速度很慢，擴散效果也不好。相較于前二者，納米銀顆粒在定性濾紙和定量濾紙上擴散較為均勻，但定性濾紙邊緣處可見一圈淺色帶，不如定量濾紙分布均勻。見圖5。

2.3 納米銀粒子的定性分析 納米銀粒子的LIBS光譜圖，其中*標識的為納米銀粒子的特征峰，分別分布于328 nm、338 nm、520 nm、546 nm、827 nm波長處，這5個特征峰位與標準譜圖庫中銀的特征峰位對應，說明此種方法可以用于納米銀粒子的定性分析。見圖6。

2.4 浸漬工藝優化 為了獲得均勻分布的載有納米銀粒子的檢測芯片，我們分別考察了4種紙基芯片對5個濃度梯度納米銀粒子（5 000 μg/mL、2 500 μg/mL、1 250 μg/mL、625 μg/mL和312.5 μg/mL）的吸附情況，每片芯片重復測定4次，理論上在5個特征吸收峰位處會得到100個測試數值。我們分別統計了4種紙基芯片在不同“浸漬-干燥”工藝次數下的測定結果。當“浸漬-干燥”工藝為1次或2次時，均會出現測量結果數目缺失的情況，說明兩次“浸漬-干燥”工藝不完全，樣品分布不均勻。而當工藝參數調整為3次時，不論哪種紙基芯片都能得到理論測試數值，說明3次“浸漬-干燥”工藝次數是必要且穩定的操作參數。此外，定量濾紙的擴散效果較好，即使經過一次“浸漬-干燥”工藝也能得到全部的測試參數，但是為了得到穩定的測試結果，我們選取三次“浸漬-干燥”工藝作為檢測芯片制備的關鍵工藝參數。見表1。

2.5 納米銀粒子的定量分析

2.5.1 標準曲線考察 在5個濃度梯度的納米銀粒子溶液中，進一步考察4種紙基芯片在5個特征峰位處的線性回歸關系。均經過3次“浸漬-干燥”工藝處理后，不同芯片在各個特征波長處的相關系數（r）值。見表2。據此依然可以看出，定量濾紙作為檢測芯片時，在各個特征波長處獲得的定量關系效果最好。在328 nm、338 nm、520 nm、546 nm和827 nm波長處，定量濾紙芯片上的檢測結果與納米銀溶膠濃度分布的線性關系見圖7（a～e）。

從圖7可以看出，520 nm波長處的線性關系最好。所以選定“浸漬-干燥”工藝重復3次，檢測芯片為定量濾紙，520 nm波長處的吸收峰作為納米銀定量測試標準。520 nm處的LIBS峰強值與納米銀濃度關系的線性回歸方程為y=8.299 1x-1 658.5，r=0.998 8，線性范圍為312.5～5 000 μg/mL。此定量關系線性回歸關系好，波長分布范圍寬，適宜做納米銀粒子的定量測試。

2.5.2 精密度 對在定量濾紙芯片上的6個不同位點處采集的特征峰值進行分析，6個峰值的RSD值為3.47%，表明該測試方法具有良好的分析精密度。

2.5.3 穩定性試驗 對不同時間間隔下待測芯片上的特征峰強進行分析，RSD值為1.6%，說明此測試芯片在3 h內可保持數據穩定性。

2.5.4 重復性試驗 對6片定量濾紙在同等濃度的納米溶膠中獲得的特征峰進行分析，6個峰強的RSD值為2.74%，表明該方法重現性良好。

2.5.5 加樣回收率 3種加標量對應的樣品回收率分別為100.04%、99.62%、100.75%，平均加樣回收率為100.13%，RSD值小于2%，表明本方法準確性高。見表3。

3 討論

為了實現水中納米銀粒子的超靈敏快速檢測，本文提出了一種基于激光誘導擊穿光譜技術的納米銀定性定量分析方法，本方法采用紙基芯片作為測試載體，通過“浸漬-干燥”工藝將液體銀樣品轉化為固體樣品進行測試。通過比較，定量濾紙的測試效果最好。定量濾紙表面吸附的納米銀粒子在328 nm，338 nm，520 nm，546 nm和827 nm處顯示出銀的特征峰。在520 nm處，納米銀的特征峰強度與濃度呈良好線性關系。本研究表明，通過合理的測試芯片選擇及優化樣品前處理工藝，可以通過激光誘導擊穿光譜技術實現納米銀粒子的定性定量分析，分析結果準確，線性范圍寬。且測試時間短，方法便捷度高。未來，這種方法可以推廣到其他金屬的液體樣品測試分析中，為金屬樣品的快速、準確分析提供新的思路和方法。

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（2021-10-25收稿 責任編輯：王明）