一株采油枯草芽孢桿菌發酵條件優化

王慧冬，修建龍，黃立信，俞理，馬原棟

(1.中國科學院大學，北京 100049；2.中國科學院滲流流體力學研究所，河北 廊坊 065007； 3.中國石油勘探開發研究院，北京 100083)

油藏經過一次采油和二次采油后，只能收集40%左右[1]。因此3次采油技術備受關注[2]。常見三采方法有：熱力驅、化學驅、混相驅和微生物強化采油[3]，其中微生物采油越來越受到重視。枯草芽孢桿菌是一種微生物驅油中常用的菌種[4]，發酵時可以產生大量脂肽類生物表面活性劑[5-6]，具有獨特的兩親性分子結構，可以在油水兩相界面定向排列，形成分子層，降低表面張力、改變巖石表面的潤濕性、與原油形成乳狀液，有利于提高原油采收率[7-9]，油田現場油藏注氣困難且氣體利用率低，導致好氧菌種生長緩慢，因此內源發酵效果較差，而地面增殖發酵后,將發酵液直接注入油井是一個很好的解決方法[10]，但是發酵營養劑用量大，發酵成本高。本文通過培養基中NH4Cl部分代替NaNO3，既降低了成本，同時可以保證脂肽產量，在微生物驅油工藝中有很好的應用潛力。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

供試菌株BacillussubtilisSL-2，為中科院滲流流體力學研究所三次采油重點實驗室微生物滲流實驗室菌種庫所保存菌種;蔗糖、葡萄糖、糖蜜、甘油、玉米漿干粉、酵母粉、豆粕粉、蛋白胨、NaNO3、NH4Cl、KH2PO4、12H2O·Na2HPO4、7H2O·MgSO4、蘇丹染液均為分析純。

梅特勒 FE28-standard pH測定儀；FTA1000B表面張力測試儀。

1.2 培養基

菌種活化培養基為液體LB(Luria-Bertani培養基)，培養基營養物質比例(質量百分數)：NaCl 1%，蛋白胨1%，酵母粉0.5%。

基礎發酵培養基(g/L)：蔗糖30 g/L，NaNO33 g/L,KH2PO42.5 g/L，12H2O·Na2HPO430 g/L，7H2O·MgSO40.8 g/L。

1.3 菌種活化及種子液制備

將菌種庫冷凍甘油管中菌種接入裝有 150 mL LB 液體種子培養基的 250 mL 三角瓶中，37 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養14 h，進行活化。取上述活化后的菌液，以同樣的方式培養14 h，用作種子液。

1.4 搖瓶發酵

取種子液，以5%(V/V)接種量接入盛有150 mL 發酵培養基的 250 mL三角瓶中，置于搖床中，溫度為37 ℃，轉速為 180 r/min，振蕩培養120 h，發酵完成后取發酵液測試排油圈與表面張力。

1.5 測試方法

脂肽產量用排油圈法[11]進行檢測，其可靠性較高[12]。通過標準脂肽樣品，可得排油圈直徑與產量線性關系，并獲得線性方程：y=(D-1.107)/0.009×n(其中D為排油圈直徑，n為發酵液稀釋倍數)。

表面張力使用表面張力測試儀進行測量。

2 結果與討論

2.1 發酵培養基配方優化

2.1.1 培養基的單因素實驗

2.1.1.1 碳源的優化 選取5種常規碳源,蔗糖、葡萄糖、糖蜜、甘油、玉米漿干粉，用量均為30 g/L。初始培養基(g/L)：蔗糖 30，NaNO33，KH2PO42.5，12H2O·Na2HPO430。在初始pH為7.5的條件下，進行SL-2的發酵，然后取樣測定其排油圈直徑，通過公式計算脂肽產量，最后測定表面張力，結果見圖1、圖2。其中CK為空白對照。

圖1 碳源對脂肽產量的影響Fig.1 Effect of carbon source on lipopeptide yield

圖2 碳源對表面張力的影響Fig.2 Influence of carbon source on surface tension

由圖1可知，以蔗糖為碳源時，脂肽產量最高，達到2.39 g/L，且以糖類為碳源時，72 h后仍會繼續發酵，而甘油和玉米漿干粉為碳源，則在72 h后停止發酵。由圖 2可知,以蔗糖為碳源，發酵液表面張力從初始的67.2 mN/m降至25.1 mN/m，是5種碳源中表面張力降低幅度最大的。

2.1.1.2 氮源的優化 選取5種常規氮源酵母粉、豆粕粉、蛋白胨、硝酸鈉和氯化銨，用量均為3 g/L。初始培養基(g/L)：蔗糖 30，NaNO33，KH2PO42.5，12H2O·Na2HPO430。在初始pH為7.5的條件下，進行SL-2的發酵，然后取樣測定其排油圈直徑，通過公式計算脂肽產量，最后測定表面張力，結果見圖3和圖4。

圖3 氮源對脂肽產量的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on lipopeptide yield

圖4 氮源對表面張力的影響Fig.4 Influence of nitrogen source on surface tension

由圖3可知，以硝酸鈉為氮源時，脂肽產量最高，可達2.6 g/L，氯化銨次之。72 h后，添加硝酸鈉和氯化銨的兩組繼續發酵，對于營養物質的利用率較高，而添加有機氮源的三組停止發酵。由圖4可知，使用硝酸鈉或氯化銨，表面張力降低值最大，且終點表面張力最小。綜合圖3，圖4可知，無機氮源更適合枯草芽孢桿菌的發酵。

在確定使用無機氮源后，為了探索NH4+和 NO3-兩種不同離子形式氮源對表面活性劑產量的影響，固定總氮量為60 mmol/L，其他組分與基礎培養基相同，分別單獨使用硝酸鈉和氯化銨，硝酸鈉+氯化銨(1∶1)中，設置3組對照實驗，結果見圖5、圖6。

圖5 單種氮源與復配氮源對表面張力的影響Fig.5 Effects of single nitrogen source and compound nitrogen source on surface tension

圖6 單種氮源與復配氮源 對脂肽產量的影響Fig.6 Effects of single nitrogen source and compound nitrogen source on lipopeptide yield

圖7 單一氮源與混合氮源 對發酵液pH的影響Fig.7 Influence of single nitrogen source andmixed nitrogen source on pH of fermentation broth

由圖5可知，3種氮源對于表面張力的降低幾乎相同。由圖6可知，酸鈉+氯化銨混合氮源，脂肽產量遠高于以氯化銨為氮源，略高于以硝酸鈉為氮源。從經濟性的角度考慮，氯化銨的價格較便宜，每噸比硝酸鈉低30%左右，整體可以降低成本。從現場采油工藝考慮，由圖7的 pH值可知，由于氯化銨加入較多，會導致發酵液pH降低，在采油工藝中，注入地下后，容易腐蝕破壞地層孔隙結構，導致地層壓力不足，所以發酵液pH接近中性最好。安全性角度，硝酸鈉有一定的危險性，用量越少越好。因此，綜合以上4點考慮，選擇硝酸鈉+氯化銨的混合氮源最理想。

2.1.1.3 緩沖對的優化 由于在枯草芽孢桿菌發酵過程中會產生堿性物質，中性pH的發酵液對地層及周圍環境也不會造成污染與損害。因此，為了使pH穩定在中性附近，需加入緩沖對進行調控，常見緩沖對組合為磷酸酸式鹽，由于鈉離子可以平衡滲透壓，鉀離子可以促進表生物表面活性劑合成后的分泌。因此，選擇KH2PO4和12H2O·Na2HPO4作為緩沖對，調整培養基pH值至中性，使用KH2PO42.5 g，12H2O·Na2HPO430 g。

2.1.2 碳源、氮源、緩沖對用量正交優化 碳源、氮源、緩沖對3個因素在前面進行種類優化后再進行用量的優化，碳源和緩沖對方面，對比二者不同質量濃度對脂肽產量的影響，氮源方面，對比硝酸根型氮源與銨根型氮源不同的比例對脂肽產量的影響，因素與水平見表1，結果見表2。

表1 正交實驗因素水平設計Table 1 Horizontal design of orthogonal experimental factors

表2 發酵培養基優化正交實驗結果Table 2 Orthogonal test results of fermentation medium optimization

表3 正交實驗方差分析Table 3 Analysis of variance in orthogonal experiment

由表2可知，最佳組合為A3B3C2，因此優化后的培養基配方為：蔗糖50 g/L，硝酸鈉∶氯化銨為2∶1，磷酸氫二鈉+磷酸二氫鉀為30 g+2.5 g。脂肽產量可達4.22 g/L 。由表3可知，RB>RC>RA,各因子對脂肽產量影響大小為：氮源比例>緩沖對>蔗糖。其中，氮源比例有顯著影響，碳源和緩沖對在置信度不低于90%的情況下有一定的影響。

2.2 發酵條件

2.2.1 溫度條件 溫度主要通過改變酶反應速率來影響發酵結果。溫度過低，酶活性較低，代謝較慢，產物生產效率也比較低，溫度升高,酶會因為過熱而失活，影響菌種生長發酵，從而影響最終的脂肽產量[13]。因此，選取細菌發酵常用溫度37 ℃，并以3 ℃為間隔，設計34,37,40,43,46,49,52,55 ℃作為搖床溫度進行發酵，控制發酵時間為96 h，測量各個溫度下的脂肽產量,結果見圖8。

由圖8可知，枯草芽孢桿菌在37～45 ℃之間均可良好生長，并產脂肽，其中發酵的最適溫度為37 ℃，而在高于49 ℃時不能進行正常生長發酵。

圖8 溫度對脂肽產量的影響Fig.8 Effect of temperature on lipopeptide yield

2.2.2 裝液量 枯草芽孢桿菌生長繁殖需要氧氣參與，當裝液量過少時，會導致發酵液中溶氧過高，菌體代謝加快，培養基中營養物質消耗快，造成營養失衡，發酵后期菌體因為營養不足而凋亡；而當裝液量超出一定范圍后，溶氧量會顯著降低，菌體有氧呼吸作用受到影響，代謝變慢，從而影響脂肽產量[14]。裝液量對脂肽產量的影響見圖9。

圖9 裝液量對脂肽產量的影響Fig.9 Influence of liquid loading volume on lipopeptide yield

由圖9可知，裝液量低于150 mL，對于脂肽產量影響較小，裝液量超過150 mL時，脂肽產量下降。因此選150 mL最佳。

2.2.3 發酵時間 發酵時間對脂肽產量的影響見圖10。

圖10 脂肽產量隨發酵時間的變化Fig.10 Variation of lipopeptide yield with fermentation time

由圖10可知，在第100 h時脂肽產量達到最大，繼續發酵，產量不再增加。因此，最佳發酵時間可確定為100 h。

3 結論

(1)枯草芽孢桿菌的優化培養基配方為：蔗糖50 g/L，NaNO33.4 g/L，NH4Cl 1.1 g，KH2PO42.5 g/L，12H2O·Na2HPO430 g/L，7H2O·MgSO40.8 g/L。

(2)枯草芽孢桿菌的最佳培養條件：溫度37 ℃，裝液量150 mL，發酵時間100 h，脂肽平均產量可達4.2 g/L。

(3)通過NH4Cl的加入，減少了NaNO3的用量，在采油工業中，使每噸氮源成本降低30%左右。實現了采油枯草芽孢桿菌降低成本、保證產量的發酵。