一株桑樹根際促生菌的篩選鑒定及促生性能研究

楊統一 ，杜秋霞，劉靜霏 ，翟德麗 ，劉延鵬 ，趙衛國 ，2

（1.江蘇科技大學，江蘇 鎮江 212018；2.中國農業科學院蠶業研究所，江蘇 鎮江 212018）

土壤質量狀況決定了桑樹的產量和品質，當前由于不合理的農藝措施如過量施用化肥，造成土壤酸化及板結，土壤微生態失衡，致使桑樹產出減少、品質下降，這促使人們尋找其他肥料來代替化肥。大量研究發現植物生長促進菌（plant growth-promot?ing bacteria，PGPB）能夠通過代謝活動活化土壤營養物質，促進植物吸收營養、加快生長等［1，2］。而應用富含活性PGPB的微生物肥料有利于修復土壤生態系統的平衡，恢復土壤肥力，引起了人們的廣泛關注。研究表明，PGPB能夠通過直接和間接兩種途徑來促進作物生長［3］，直接作用如分泌植物激素促進生長，分泌有機酸促進難溶磷轉化成有效磷，分泌固氮酶等增加土壤肥力，而間接作用包括誘導作物產生抗性、直接與病原菌拮抗等［4，5］。PGPB 作為微生物菌肥的菌種，可持續性較好，對環境和食品安全，還可以改善土壤結構，提高土壤有機質含量，在生態環境保護、綠色有機食品生產及農業可持續發展中發揮著重要作用［6，7］。

目前菌肥效果研究發現在眾多農作物上具有良好的應用效果，包括小麥、水稻及玉米等［8-10］，而在桑樹中施用微生物菌肥也能提高桑樹枝條生長量及葉片生物量。高繪菊等［11］研究發現桑樹內生拮抗細菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）L144的培養液能明顯提高玉米和桑樹種子的發芽勢、發芽率和胚根長，增加玉米及桑樹幼苗的株高及植株生物量，提高葉綠素等含量。梁灝琳等［12］在研究3種微生物菌劑對桑樹的應用時發現，菌劑能較好地促進桑樹莖干生長、葉片增綠及土壤改良。羅海信［13］研究了菌肥對桑樹生長發育的影響，發現桑園施用生物肥料能夠顯著提高桑葉的產量，并能夠提高桑椹的產量和品質。目前影響PGPB菌肥應用的關鍵問題之一就是優良菌種的篩選與培育，但是開發桑樹生長促進菌優良菌株的研究還較少。本研究從中國農業科學院蠶業研究所鎮江桑樹圃的桑樹根際土壤中篩選并鑒定了一株能夠溶磷和分泌IAA的植物根際促生菌，考察了不同pH、培養時間對菌株促生能力的影響，以期為桑樹專化型微生物菌肥的開發利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

采用抖動法采集江蘇科技大學西校區蠶業研究所桑園根際土壤，混勻，置于4℃冰箱中保存備用。

1.2 培養基的配制

基礎培養基（LB）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，去離子水定容至 1 000 mL，瓊脂 20 g，pH 7.2～7.4；液體培養基不加瓊脂。

PKO培養基（無機磷培養基）：Ca3（PO4）25 g，C12H22O1110 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO40.03 g，FeSO4·7 H2O 0.03 g，酵母菌膏0.5 g，去離子水定容至1 000 mL。pH 7.0～7.2。固體培養基加瓊脂15 g/L。

1.3 促生菌篩選與鑒定

1.3.1 溶磷菌株的篩選 采用平板稀釋分離法［8］，稱量5 g土壤樣品用45 mL滅菌的生理鹽水制備成土壤懸液，經梯度稀釋后成10-2～10-4濃度土壤稀釋液，取0.1 mL均勻涂布于無機磷培養基平板上，置于30℃培養箱中培養3～7 d后，挑取有溶磷圈的菌株，進行純化和多次傳代后，4℃保存備用。

1.3.2 菌株的鑒定

1）形態學觀察與鑒定。掃描電鏡成像（SEM）：收集對數期生長的菌體并用生理鹽水洗滌兩次，用甲醇和乙酸（3∶1）固定2 h。后依次用50%、70%、85%、90%和100%乙醇依次處理20 min，最后將處理好的樣品送學校分析中心進行掃描電子顯微鏡（SEM）成像。

2）菌株形態和生理生化特征鑒定。參照微生物學實驗和伯杰氏鑒定手冊進行菌株的形態和生理生化特性鑒定。

1.3.3 分子生物學鑒定 挑取少許菌株接種于LB液體培養基中，30℃、120 r/min振蕩培養至菌液OD600nm為0.8。取2mL菌液離心后收集菌體。采用煮沸法［14］滴加0.5 mL去離子水于菌體中，渦旋30 s，100℃下水浴5 min，12 000 r/min離心2 min。上清液即為DNA模板，在-20℃下保存。然后用細菌通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行 16S rDNA擴增［15］。擴增條件為：預變性5 min（95 ℃）；進入循環，變性30 s（94 ℃），退火30 s（55℃），延伸90 s（72℃），運行30個循環；最后72℃溫度下延伸10 min，4℃條件下保存。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將檢測合格的PCR產物送至上海Invitrogen公司測序。將測序結果與GenBank數據庫中已有的16S rDNA序列用Blast軟件進行比對，然后用MEGA 6.0軟件構建出菌株的系統進化樹。

2.1.2 抑郁癥組 選取我院同期收治的抑郁癥住院患者作為抑郁癥組。納入標準：符合《中國精神疾病分類與診斷標準第3版（精神障礙分類）》[15]中抑郁癥的診斷標準，漢密爾頓抑郁量表（HAMD）評分≥20分[16]。排除標準：妊娠期或哺乳期婦女；具有器質性精神障礙或者由精神活性物質所致的精神障礙者；嚴重心、肝、腎等實質性臟器損害者；神經系統變性疾病患者；語言聽力功能障礙者。該組共納入抑郁癥患者85例。

1.3.4 篩選菌株促生能力的測定

1）溶磷能力的測定［4］。用接種環挑取少許純化的溶磷菌加入50 mL液體LB培養基，在30℃下120r/min搖床培養至菌液吸光值OD600nm為0.8時，作為種子液，此時菌體濃度約109個/mL。將1 mL種子液接種于50 mL PKO液體培養基中，30℃、120 r/min下，分別培養6、18、30、48、72 h后，取5 mL樣品，4 ℃下10 000 r/min離心15 min。取上清液定容至25 mL后加入顯色劑，每組3個平行，通過鉬銻抗比色法測定菌株的溶磷能力。

液體PKO培養基的pH對有效磷的影響測定：配制pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的液體PKO培養基，分別培養24 h取樣，按照上述方法測定菌株的溶磷能力。

2）產IAA能力的測定。對細菌分泌IAA的能力定量測定時使用分光光度法進行［5］。標準曲線的繪制采用分析純的IAA梯度稀釋制備。將200 μg/mL的 IAA 標準液稀釋為 0、25、50、75、100、125、150、175 μg/mL，采 用 Salkowski顯 色 法 測 定 吸 光 值（OD530nm），然后制作標準曲線。

挑取少許菌體接種于LB液體培養基，在30℃下120 r/min搖床培養至菌液吸光值OD600nm為0.8時作為種子液。將0.5 mL種子液接種于含有100 mg/L L-色氨酸的50 mL LB液體培養基中，30℃、120 r/min搖床培養下，培養至6、18、30、48、72 h時，各取1 mL樣品，然后12 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液加入等體積Salkowski比色液，混勻后避光靜置30 min后測定其OD530nm，以不加L-色氨酸的LB培養基作為空白對照。參照標準曲線計算單位體積菌液IAA的含量。

LB液體培養基pH對IAA分泌量的影響測定：配制pH為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的液體LB培養基，按照上述方法分別計算菌液分泌IAA的量。

1.4 菌株促生效果的盆栽試驗

盆栽試驗的土壤來自中國農業科學院蠶業研究所國家種質鎮江桑樹圃，土壤的pH為7.5，有機質含量2.9 g/kg，全氮含量0.083%，速效氮含量97.4 mg/kg，總磷含量 659 mg/kg，速效磷含量 3.69 mg/kg［16］。土壤可培養微生物指標中，細菌用牛肉膏蛋白胨培養基培養，放線菌用高氏一號培養基培養，真菌用察氏培養基培養［17］。土壤中細菌數量為（8.3±0.52）×105/g干土，真菌數量為（5.7±0.64）×104/g干土，放線菌數量為（2.4±0.4）×105/g干土（注：數據為平均數±標準差）。

挑選飽滿一致的桑樹種子，用50℃溫開水浸泡，水涼后浸泡12 h。催芽后育苗，等長出兩葉一心時移栽定植。選取長勢一致的健康桑樹苗移栽于塑料盆（含200 g風干土壤）中，等桑苗定植一周后，采用灌根法接種促生菌。將篩選出的菌株利用LB液體培養基37℃培養48 h，8 000 r/min離心5 min，去除上清液，無菌水重懸菌體備用。灌根的G2菌液為無菌水重懸至OD600nm為0.8時，此時菌體濃度約109個/mL。處理組為無菌水對照（CK）、稀釋100倍（約含菌體107個/mL）和200倍（約含菌體0.5×107個/mL）的種子液，每處理5次重復，每盆灌根50 mL。

桑樹苗長出四葉一心時，測量試驗組和對照組桑樹的株高、鮮重，然后小心剝離土壤后105℃烘干至恒重，稱量地上部干重和根系干重。

1.5 數據處理

數據的統計分析運用Excel及SPSS 16.0進行。

2 結果與分析

2.1 促生菌株G2的篩選及生理生化鑒定

由圖1a革蘭氏染色結果可知，篩選出的G2菌株是一種革蘭氏陰性菌；由圖1b可知，G2菌是一種桿菌，大小約為0.5 μm×1.5 μm；由圖1c、圖1d可以證實，G2菌具有溶磷及分泌IAA的能力。

圖1 G2菌形態及其他特征

G2菌的生理生化測試結果見表1。由表1可知，G2菌沒有發酵乳糖、葡萄糖及甘露醇的能力；過氧化氫酶陽性，而苯丙氨酸脫氫酶陰性，不能水解淀粉等。

表1 G2菌的生理生化測試結果

2.2 菌株G2的16S rDNA分子鑒定

G2菌的16S rDNA擴增后進行測序，將序列提交GenBank獲得登錄號KT283101。利用Blast進行序列同源性分析，用MEGA 6.0軟件構建菌株的系統發育樹，結果見圖2。由圖2可知，G2菌株與Pseu?domonas stutzeri具有99%以上的相似性，初步鑒定菌株G2為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）。

2.3 pH和時間對菌株溶磷性能的影響

由圖3可知，不同pH顯著影響菌株G2的溶磷性能。隨著pH的升高，G2菌株的溶磷量表現出先升高后降低的趨勢，在pH為7左右時，達到最大值（13.53 mg/L）。

將G2菌株用PKO培養基培養3 d，每隔一定時間取樣測定上清液中有效磷的含量，結果如圖4所示。從圖4可以看出，剛開始菌株可能處于生長適應期，有效磷的含量比較低。隨著培養時間的延長，菌株溶解磷的含量增加。48 h左右時溶解磷含量達到最大值，為17.96 mg/L。

圖2 菌株G2及相關菌株基于16S rDNA的系統發育樹

圖3 pH對菌株溶磷性能的影響

圖4 培養時間對菌株溶磷性能的影響

2.4 pH和時間對菌株分泌IAA性能的影響

由圖5可知，在pH為4和10時，菌株分泌IAA的含量較低。在pH為5、6及7時，菌株IAA分泌量最多，沒有顯著差異；隨著pH超過8，菌體IAA分泌量逐漸減少。綜合表明菌株在pH 5～8時，分泌IAA的能力都較強，但總的來說，G2菌株較適應偏酸性的環境。

從圖6可知，菌株分泌IAA的能力自6 h快速提高，處于快速增長階段，并于48 h達到115.1 mg/L，也就是說48 h之前IAA增加速度較快；48 h后IAA含量還在增加，但增加速度較慢，至72 h時達到121.7 mg/L。這可能是由于后期營養比較匱乏，種內競爭加劇，導致IAA分泌速度減緩。

圖5 pH對菌株分泌IAA能力的影響

圖6 培養時間對菌株分泌IAA能力的影響

2.5 對桑樹苗盆栽的促生效果

由表2可知，該菌株對桑樹苗的根系及莖葉都有促進作用。其中以稀釋100倍處理促生效果最佳，各項指標值均較對照提高30%以上，與對照相比，差異達到顯著水平。

表2 不同處理對桑樹苗生物學特征的影響

3 小結與討論

試驗從土壤中分離得到了一株兼具溶磷和分泌生長素IAA兩種能力的植物根際促生菌G2，經過形態學特征觀察、生理生化特性鑒定、16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為施氏假單胞菌。在pH為7時，G2菌株的溶磷能力最佳，而pH為5～7時G2菌株IAA的分泌量最大。培養時間為48 h時，G2菌株的溶磷能力達到17.96 mg/L；而IAA含量72 h時達到121.7 mg/L。盆栽試驗表明，接種篩選的促生菌G2后，桑樹苗的株高、鮮重、地上部干重及根系干重分別較對照提高31.8%、38.5%、34.6%及31.2%。

當前中國桑產業逐步從東部沿海地區向西部地區轉移，隨著果桑新品種的推出，使桑樹不僅能夠提供桑葉，還能提供營養價值豐富的桑果，為實現農村和農民的增收起到積極作用，有利于農村發展休閑旅游產業。由于長期的不良農業措施，如農藥、化肥的大量施用不僅使土壤質量下降還破壞了農田生態系統的平衡，從而導致植株生長緩慢、發病率升高等現象［17］。PGPB通過定植于根部，能夠改變土壤微環境，活化難以吸收的營養物質，改善營養狀況，還能夠擠占有害病原菌的生態位，促進植物生長。在桑樹生長期間，微生物菌肥不僅能為桑樹的生長提供所需的養分，改善桑葉品質，進而實現蠶桑副產物的優質高產，而且還可提高肥料利用率，降低養蠶成本，提高經濟效益。因此，微生物菌肥可以作為桑園的優質肥源之一。而獲得優良的微生物菌種是開發高效菌肥的前提。

目前，報道的PGPB有眾多種屬，包括芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、微桿菌屬及土壤桿菌屬等［7，18，19］。假單胞菌屬的促生機制包括提高養分的可利用性，分泌促生長的激素，還可以分泌拮抗病原菌的物質來提高植物的抗病性［20，21］。李娜等［22］從石灰性土壤中分離篩選出一株高效溶磷的假單胞菌W05，制成的溶磷菌肥顯著提高了土壤有效磷含量和磷酸酶活性。劉潤進等［23］將AMF和PGPB（熒光假單胞菌）混勻制備成組合菌劑，顯著降低了土壤中甲胺磷殘留量。本研究從江蘇科技大學蠶業研究所的桑樹根際土中篩選得到一株具有解磷及分泌生長素能力的細菌，經過16S rDNA測序比對，鑒定為施氏假單胞菌。進一步研究表明，該菌在pH 5～8時，具有較好的分泌生長素的能力，說明該菌株能夠適應的土壤pH范圍較廣。

目前研究發現PGPB的促生效應在植物的幼苗期具有較好促進作用。小麥幼苗在接種假單胞菌HP1218后，在株高及根長方面比對照增加13.2%及20.4%［9］。邢丹等［24］以桑品種桑特優 2號為研究對象，接種兩種叢枝菌根真菌（摩西斗管囊霉及根內根孢囊霉）都顯著增加了桑樹株高、地徑、葉面積、地上部分和根系干質量。本研究發現，接種稀釋100倍的促生菌G2菌液后，桑樹苗的株高、鮮重、地上部干重及根系干重分別較對照提高31.8%、38.5%、34.6%及31.2%。已有研究表明PGPB從兩個方面起到促生作用：一是能夠產生植物生長激素如IAA、細胞激動素等；另外一個方面可以促進植物對氮、磷等營養元素的吸收。本研究表明G2菌株能分泌IAA及具有較強的溶磷能力。結合G2菌株的促生能力研究，其對桑樹苗的促生作用可能是IAA增加及促進磷吸收這兩個方面的綜合作用結果。本試驗僅考察了該菌對盆栽的桑樹苗促生作用，至于該菌能不能在田間應用時驗證促生效果及促生效果能持續多長時間還需要進一步的研究，為以后制備促生菌劑提供參考。