正交設(shè)計(jì)優(yōu)化膽膏中膽汁酸的提取工藝

紀(jì) 敏 ，林柏良 ，鄧生菊 ，彭健波 ，杜 瑋 ，于美玲，王冬英 ，何家康 ，2

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.廣西獸藥制劑工程技術(shù)研究中心，南寧 530003；3.廣西北斗星動(dòng)物保健品有限公司，南寧 530003）

動(dòng)物膽膏是一味使用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥材，具有良好的清肝明目、通便解毒、止咳平喘等功效，毒副作用較小，資源豐富且價(jià)格低廉［1-3］。國(guó)內(nèi)許多人用中成藥、獸用中成藥以膽膏與其他中藥配制動(dòng)物膽膏，對(duì)風(fēng)熱感冒、肺熱咳嗽、熱痢、糞便燥結(jié)等各種熱性病有較好的療效［4-6］。大量研究表明，動(dòng)物膽膏的主要化學(xué)成分為膽汁酸類，包括水溶性結(jié)合型膽酸和脂溶性游離型膽酸［7］。膽汁酸主要包括膽酸、鵝去氧膽酸以及豬去氧膽酸等，這幾種膽汁酸都具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景，主要存在于畜、禽膽膏中，一般都以天然提取方式得到［8，9］。傳統(tǒng)上中國(guó)曾采用乙醇提取法，但此法提取過(guò)程較單一，需要多次重復(fù)水解、提取、結(jié)晶等處理步驟，而且需要使用大量的易燃易爆有機(jī)溶劑，且乙醇回收率低，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)效益不高。還有采用酸沉淀法［10］和鹽析法［11］提取粗膽汁酸，也存在提取工藝繁瑣、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等工藝缺陷。為了綜合開(kāi)發(fā)利用動(dòng)物膽膏，廉價(jià)高效地得到這幾種膽汁酸，使其更好地發(fā)揮藥用價(jià)值和功效，本研究以豬膽膏為試驗(yàn)原料，經(jīng)單因素篩選后選取1∶1鹽酸用量、NaOH用量和純化時(shí)間為考察因素，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化膽膏中膽汁酸的提取工藝，以期建立工藝簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境無(wú)污染、高含量、高收率的生產(chǎn)工藝，最終符合工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

豬膽膏（批號(hào)為20171002），購(gòu)自泰安廣鑫生物科技有限公司；豬去氧膽酸對(duì)照品（批號(hào)為100087-201610）、鵝去氧膽酸對(duì)照品（批號(hào)為 110806-201606），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙酸均為色譜純，乙酸乙酯、鹽酸均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀（LC-20A）、自動(dòng)進(jìn)樣器（SIL-20A），均購(gòu)自日本島津制作所；電子分析天平（BP211D），購(gòu)自德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；超聲波儀（B3200S-T），購(gòu)自必能信超聲上海有限公司；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Alltech ELSD 3300），購(gòu)自美國(guó)格雷斯奧泰公司；Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），購(gòu)自北京金歐亞科技發(fā)展有限公司；雷磁酸度計(jì)，購(gòu)自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸堿純化提取法工藝流程 以10 g膽膏為原料，將膽膏敲碎，加入適量去離子水加熱攪拌使之完全溶解，冷卻，加入適量1∶1鹽酸，攪拌均勻，靜置純化一定時(shí)間，過(guò)濾取沉淀，加入適量去離子水，加入適量固體氫氧化鈉，溶解完全后，板框4層濾紙過(guò)濾，即得膽膏純化液。

1.3.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝 經(jīng)單因素篩選后，選擇1∶1鹽酸用量、NaOH用量、純化時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素分3個(gè)水平，因素水平如表1所示。精密稱取9份膽膏，每份10 g，根據(jù)L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別進(jìn)行純化提取、過(guò)濾，加去離子水定容至100mL，測(cè)定膽膏純化液中鵝去氧膽酸和豬去氧膽酸的含量。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.3 膽膏的含量測(cè)定

1）色譜條件。Waters Symmetry C18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為0.1%冰乙酸∶乙腈=50∶50；流速為1 mL/min；檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；進(jìn)樣量為對(duì)照品溶液 5、10 μL，供試品溶液 10 μL；理論板數(shù)按豬去氧膽酸峰計(jì)算應(yīng)不低于7 000。

2）對(duì)照品溶液的制備。取豬去氧膽酸對(duì)照品和鵝去氧膽酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸0.625 mg的溶液，備用。

3）供試品溶液的制備。精密量取本品續(xù)濾液10 mL，置于50 mL錐形瓶中，加NaOH溶液10 mL，用牛皮紙將瓶口密封，置于立式滅菌鍋中，120℃，103 kPa，加熱 4 h，冷卻至室溫，用 HCl調(diào)節(jié) pH至6～7，移至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.4 膽汁酸含量測(cè)定方法學(xué)考察

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍試驗(yàn) 分別精密量取豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液 2、3、4、5、10 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即可。按“1.3.3”色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，以豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸對(duì)照品濃度（mg/mL）的對(duì)數(shù)x為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)y為縱坐標(biāo)，分別繪制豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液各 10 μL，按“1.3.3”色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各峰面積，計(jì)算方法的精密度。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取樣品6份，按“1.3.3”方法制得供試品溶液，并進(jìn)行高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取樣品，按“1.3.3”方法制得供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 后，進(jìn)行含量檢測(cè)，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。

1.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的膽膏純化液10 mL，置于100 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度線，精密量取5 mL，每份加入豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液各2.5 mL，平行6份，混勻后按“1.3.3”方法制得供試品溶液，并進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的回收率。

1.5 乙醇純化工藝流程

將膽膏敲碎，精密稱取膽膏10 g，加入適量去離子水溶解并加熱煮沸后制得膽膏水溶液，冷卻后加入5倍95%乙醇，攪拌過(guò)夜，過(guò)濾，收集濾液。回收乙醇后制得濃膽膏液，再加入5倍95%乙醇，攪拌過(guò)夜，過(guò)濾，收集濾液，回收乙醇后制得膽膏純化液。加去離子水定容至100 mL。測(cè)定膽膏純化液中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量。

1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

取同一批次膽膏提取物，精密稱取6份，每份10 g，分別按乙醇純化工藝和酸堿純化工藝最佳條件純化，純化液按同樣方法處理，分別測(cè)得總膽酸含量。采用SPSS 21.0軟件，以t檢驗(yàn)比較2種提取工藝測(cè)量結(jié)果間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸堿純化工藝正交試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)分別測(cè)得9次試驗(yàn)樣品中鵝去氧膽酸和豬去氧膽酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 酸堿純化工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，由極差R分析可知，影響最佳提取工藝的因素順序?yàn)锽＞A＞C，即NaOH用量＞1∶1鹽酸用量＞純化時(shí)間，初步確定最佳提取工藝組合為A1B2C3。由表3方差分析可知，1∶1鹽酸用量（A）與 NaOH 用量（B）對(duì)總膽酸含量測(cè)定有顯著的影響（P＜0.05），純化時(shí)間（C）與總膽酸含量測(cè)定無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。綜合直觀分析與方差分析的結(jié)果，同時(shí)考慮省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、節(jié)能，最后確定最佳工藝組合為A1B2C3，即10 g膽膏加入適量水溶化，加入 1∶1鹽酸 4 mL沉淀，純化時(shí)間 12 h，然后加入適量去離子水，加入氫氧化鈉0.2 g，溶解過(guò)濾即可。

表3 方差分析結(jié)果

2.2 豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測(cè)定

分別精密吸取豬去氧膽酸對(duì)照品溶液、鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液、供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。鵝去氧膽酸對(duì)照品、豬去氧膽酸對(duì)照品、供試品、陰性樣品對(duì)照高效液相色譜見(jiàn)圖1。

將圖1A、圖1B和圖1C比較可知，鵝去氧膽酸對(duì)照品的保留時(shí)間為13.506 min，豬去氧膽酸對(duì)照品的保留時(shí)間為7.213 min，供試品中鵝去氧膽酸的保留時(shí)間為13.614 min，豬去氧膽酸的保留時(shí)間為7.190 min。由圖1可見(jiàn)，供試品中的鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸與鵝去氧膽酸對(duì)照品、豬去氧膽酸對(duì)照品的保留時(shí)間、高度和面積基本一致，且HPLC色譜圖峰形良好，無(wú)雜質(zhì)干擾測(cè)定，具有較高的特異性，表明分析條件可行。

2.3 豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸含量測(cè)定方法考察結(jié)果

以對(duì)照品濃度的對(duì)數(shù)x為橫坐標(biāo)、峰面積的對(duì)數(shù)y為縱坐標(biāo)得豬去氧膽酸與鵝去氧膽酸的回歸方 程 ，分 別為y=1.689 2x+5.570 2，R2=0.999 7；y=1.663 2x+5.502 9，R2=0.999 8。豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸在0.125～0.625 mg/mL線性關(guān)系良好；精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為豬去氧膽酸 0.56%、0.68%、0.71%，鵝去氧膽酸0.70%、0.85%、0.66%；豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的加樣回收率分別為99.51%和100.17%，RSD分別為0.75%和0.65%，表明本方法可行。

圖1 高效液相色譜

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

按乙醇純化和酸堿純化最佳工藝條件A1B2C3純化得到膽膏純化液中總膽酸含量的測(cè)定結(jié)果（表4）。采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果2種提取純化工藝所得膽膏純化液中總膽酸含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明2種提取工藝的提取效果相似。

表4 不同工藝提取純化總膽酸含量測(cè)定結(jié)果（x±s，n=3）

3 小結(jié)與討論

隨著人類對(duì)天然甾體類化合物的深入研究，從膽膏中提取分離膽汁酸的工藝研究是膽膏研究的熱點(diǎn)之一［12］。目前，國(guó)內(nèi)外主要以豬膽汁（膏）為原料提取鵝去氧膽酸或豬去氧膽酸等膽汁酸類［13］。主要通過(guò)鈣鹽沉淀法、鋇鹽沉淀法［14］、結(jié)晶提取法和離子交換樹脂法［15］等提取鵝去氧膽酸，然而這幾種方法產(chǎn)品回收率低，純度也不高。對(duì)于豬去氧膽酸的提取，主要采用乙酸乙酯分離法［16］，也有采用甲醇-水重結(jié)晶法［17］、乙醇-水重結(jié)晶法、丙酮重結(jié)晶法［18］或?qū)游鲋▽?duì)乙酸乙酯提取物進(jìn)行純化，但這些提取方法不僅需要消耗大量的有機(jī)溶劑，安全性能差，而且生產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)品回收率低，不能規(guī)模化生產(chǎn)。

本研究通過(guò)酸堿純化工藝提取純化豬膽膏中的膽汁酸，最佳提取工藝為A1B2C3，即在1∶1鹽酸用量4 mL、NaOH用量0.2 g的條件下純化時(shí)間12 h，所得膽膏純化液中總膽酸的含量為5.49 mg/mL；而乙醇純化工藝提取純化的膽膏純化液中總膽酸的含量為5.50 mg/mL。對(duì)比這2種提取純化方法，發(fā)現(xiàn)膽膏純化液中總膽酸的含量無(wú)顯著差異，且按《中國(guó)人民共和國(guó)獸藥典》2015年版注射液有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下檢查純化液中的蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂等項(xiàng)目，均符合要求［19］。在制備過(guò)程中，受熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致膽膏的某些有效成分損失［20］，酸堿純化工藝的作用機(jī)理是利用結(jié)合型總膽酸在酸性環(huán)境下不溶于水的性質(zhì)，采用酸化代替乙醇提取，減少加熱次數(shù)，提高膽膏中膽汁酸的提取率［21］。何姣等［22］將豬膽汁乙醇浸提和層析柱分離純化后，再使用有機(jī)溶劑洗脫、烘干得到豬膽汁結(jié)合型總膽酸，但提取工藝手續(xù)繁雜，大量使用多種有機(jī)溶劑，結(jié)合型總膽酸的回收率低，成本高。膽膏純化后所得的結(jié)合型總膽酸溶液不必經(jīng)過(guò)濃縮和干燥，可直接用于注射液的配制，同時(shí)溶液中含有的牛磺酸具備良好的清熱解毒作用，常用作制備人工牛黃，經(jīng)堿皂化水解后就會(huì)損失此種藥理價(jià)值［23］。相比之下，本研究建立的酸堿純化工藝操作簡(jiǎn)單，純化時(shí)間明顯縮短，并且不使用易燃易爆有機(jī)溶劑。由此可見(jiàn)，酸堿純化工藝在實(shí)用性以及經(jīng)濟(jì)性上均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的乙醇純化工藝，不僅符合綠色生產(chǎn)的工業(yè)化要求，而且還能提高生產(chǎn)效率和生產(chǎn)效益，故推薦選擇酸堿純化工藝作為膽膏中膽汁酸的提取純化方法。