發根農桿菌介導的杜梨毛狀根遺傳轉化方法

郝紫微，戴雨沁，張紹鈴，王 鵬

（南京農業大學梨工程技術研究中心，南京 210095）

杜梨（Pyrus betulaefolia）是常用的梨栽培用砧木，具有高度雜合的基因型，遺傳背景復雜，并且童期長，因此導致杜梨砧木育種周期極長［1］。植物基因工程是實現快速精準育種的有效方法，而遺傳轉化則是其中最關鍵的環節之一。農桿菌介導的植物轉化是目前應用最廣泛的方法［2］，農桿菌分為根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌農桿菌中含穿梭質粒-Ti質粒，該質粒含有可以整合到植物基因組上的T-DNA區段［3］。目前借助根癌農桿菌已成功實現水稻［4］、玉米［5］、大豆［6］、蘋果［7］、柑橘［8］等重要作物的遺傳轉化。發根農桿菌在感染植物后，能誘導植物產生大量高度分支的毛狀根。發根農桿菌中的Ri質粒經過改造修飾后，其T-DNA片段區可以將目標基因插入宿主植物的基因組中，產生轉基因毛狀根［9］。發根農桿菌侵染植物所產生的毛狀根具有生長速度快、分化程度高、生理生化和遺傳性穩定、操作控制簡單等特點［10］。目前通過發根農桿菌轉化在煙草、苜蓿、豌豆、咖啡等植物中獲得了提高抗性相關的轉基因植株，如抗病、抗蟲、耐受重金屬等［10］。此外，近年來在茶樹［11，12］、龍眼［13］、枳［14］、山定子［15］和棗樹［16］等果樹中也有較多關于發根農桿菌遺傳改良和抗病性的研究。梨遺傳轉化體系起步較其他物種較晚，目前還缺乏高效快速的遺傳轉化方法，嚴重限制了梨基因功能研究和梨精準分子育種應用［17，18］。本研究以杜梨為研究材料，利用發根農桿菌開發了一種簡單、快速、高效的杜梨毛狀根轉化方法，為梨樹基因功能研究和遺傳改良提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

杜梨種子經4℃沙藏層積35 d后，播種于盆內，生長環境為光照16 h/黑暗8 h，溫度25±1℃，生長至6～8片真葉，株高約7 cm時，用于侵染。

發根農桿菌菌株K599儲存在含有50%甘油的LB液體培養基（蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L）中，于-80℃凍存。植物表達質粒載體為pROK2，包含卡那霉素抗性基因篩選標記。

1.2 方法

1.2.1 克隆mCherry基因 克隆mCherry熒光蛋白基因（正向引物：5′-acgggggactctagaggatcc ATGGTG AGCAAGGGCGAGG-3′，反 向 引 物 ：5′-gggaaattcg agctcggtacc TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′）并通過同源重組構建到pROK2，mCherry基因編碼區長度為711 bp。采用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒，50 μL 總反應體積中，包括 5×Phusion GC Buffer 10 μL，10×d NTP Max 1 μL，10μmol/L 正 向 引物 2.5 μL，10 μmol/L 反 向 引物 2.5 μL，模 板 DNA 1 μL，ddH2O 32.5 μL，Phusion DNA Polymerase 0.5 μL。PCR反應程序為預變性：98 ℃30 s，循環反應（30個循環）98℃ 10 s→65℃ 30 s→72℃ 45 s，終延伸72℃ 10 min。

1.2.2 產物鑒定及載體構建 將PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取約700 bp的目的條帶，用膠回收試劑盒回收目標片段。將pROK2空載于37℃下用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切3 h，酶切后膠回收，利用重組酶將基因和酶切好的質粒于37℃下反應30 min，將重組完畢的產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，選取陽性克隆小量提取質粒進行Sanger測序驗證，將測序正確的質粒進行農桿菌轉化（運用凍融法制備發根農桿菌感受態），得到含有目的基因的發根農桿菌。

1.2.3 K599發根農桿菌感受態的制備與轉化 使用凍融法制備農桿菌感受態并進行轉化，方法參照姚丹［19］并作修改。

1）首先將農桿菌菌株K599于LB固體培養基（含50 μg/mL利福平）的平板上劃線，28℃恒溫倒置培養36～48 h。

2）挑取單菌落2～5 mL到LB液體培養基（含50μg/mL利福平），之后按1%接種率接種于100 mL LB液體（含50 μg/mL利福平）培養基中，28℃、220 r/min振蕩培養至OD600=0.8。

3）將菌液分裝于50 mL無菌離心管中，冰浴10 min，于4℃、5 000 r/min離心10 min，棄上清。

4）在超凈工作臺中加入2～5 mL預冷的10%甘油，吸打混勻后至等體積冰預冷的10%甘油，4℃、5 000 r/min離心10 min后棄上清。

5）重復4）步驟1次，然后加入200 μL過濾除菌的山梨醇（100 mg/mL）重懸。

6）將感受態細胞分裝為50 μL/管，液氮速凍后于-80℃保存待用。

7）取500 ng質粒加入50 μL融化的農桿菌感受態中，冰上放置30 min；液氮速凍1 min后立即37℃水浴1 min；冰上放置3 min后加入500 μL無抗生素LB液體培養基，28℃、220 r/min恒溫搖床中培養4 h，然后5 000 r/min離心5 min，棄去部分培養基，留100 μL重懸菌體后涂于含有50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的LB平板上放于30℃培養箱中培養36～48 h，篩選陽性克隆，并進行PCR鑒定，將鑒定出來的陽性菌液提取質粒再次進行大腸桿菌轉化，并選擇測序結果正確的陽性克隆菌液，在其中加入50%甘油，于-80℃保存。

1.2.4 注射侵染杜梨實生苗 方法參照Meng等［9］并稍作修改：挑取含有pROK2-35S：mCherry的發根農桿菌菌株K599的單克隆在5 mL LB液體培養基（含50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素）中，28℃振蕩（180 r/min）培養3～4 h，取1 mL農桿菌加到含25 mL LB培養基（含50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素）的錐形瓶中28℃過夜培養，OD600值達到0.3～0.4后，將培養物在室溫下以8 000 r/min離心10 min，然后重懸于MES緩沖液（10 mmol/L MES-KOH，pH 5.2，10 mmol/L MgCl2和 100 μmol/L 乙酰丁香酮），60 r/min室溫緩慢振蕩孵育3 h。將0.1 mL農桿菌懸浮液用1 mL注射器注入梨苗距根部1.5 cm位置，然后用脫脂棉沾取少量菌液包裹傷口移入土中。注射后20 d可見愈傷組織在莖的注射部位生長，注射后45 d可見毛狀根生長良好。

1.2.5 RNA提取及PCR檢測 收集毛狀根提取總RNA，進行反轉錄后，以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增目的片段是長度為711 bp的mCherry全長編碼區，驗證載體片段是否插入梨基因組。

1.2.6 注射煙草葉片驗證pROK2-35S：mCherry克隆是否可以正常表達 采用農桿菌注射法將pROK2-35S：mCherry載體轉入煙草表皮細胞中，用去掉針頭的注射器將侵染液注入煙草葉片的背面，之后于25℃培養3 d。葉片剪取1 cm2大小制成臨時裝片，使用Zeiss LSM800激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片在561 nm激發光下檢測mCherry表達情況。

1.2.7 體視顯微鏡觀察杜梨毛狀根中mCherry的熒光 體視熒光顯微鏡可以在不損傷植物的情況下觀察根部熒光。注射后待毛狀根長出，即可運用Leica M205FA體視熒光顯微鏡觀察mCherry的熒光信號，與未注射的陰性對照杜梨苗進行比較。

2 結果與分析

2.1 使用侵染煙草葉片瞬時表達目的基因的方法檢測表達載體的效率

為了驗證pROK2-35S：mCherry表達載體的效率，利用侵染煙草葉片瞬時表達的方法進行驗證。如圖1所示，注射攜帶pROK2-35S：mCherry農桿菌的煙草葉片中有紅色熒光產生，說明mCherry可以正常表達。

2.2 杜梨毛狀根的發生

取生長40 d，6～8片葉片的杜梨實生苗（圖2a），在距根部約1.5 cm的位置（圖2b）注射含pROK2-35S：mCherry質粒的農桿菌K599，菌液濃度為OD600值0.3～0.4。共注射40株梨苗，18～32 d后愈傷組織出現，產生毛狀根植株為34株，毛狀根產生率為85%，注射后約45 d再生毛狀根生長良好（圖2c）。轉基因毛狀根長勢良好且鑒定為陽性植株有6株，陽性率達到17.6%。

2.3 毛狀根RT-PCR鑒定

因發根農桿菌侵染后植株自然生長在土壤中，未經過滅菌處理，通過DNA檢測轉基因材料的假陽性比例過高，因此本試驗提取毛狀根總RNA進行陽性植株檢測。選取生長良好的杜梨實生苗轉化植株的毛狀根，提取毛狀根總RNA并反轉錄。以未侵染的根作為陰性對照，pROK2-35S：mCherry質粒為陽性對照，擴增檢測mCherry基因，用1%瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳檢測。結果如圖3所示，34個產生毛狀根的植株中，有6個植株及陽性對照質粒均擴增出了大小與mCherry基因完全一致的條帶，而陰性對照植株（CK）則沒有擴增出相應的條帶。

圖1 煙草葉片中瞬時表達檢測pROK2-35S：mCherry載體的表達效率

圖2 杜梨苗注射部位和毛狀根發生

圖3 RT-PCR檢測梨轉基因毛狀根中mCherry的表達

2.4 體視熒光顯微鏡觀察杜梨毛狀根mCherry熒光

為進一步確定mCherry在杜梨毛狀根中的表達，用體視熒光顯微鏡對梨根部進行觀察，結果可以在根中直接觀察到mCherry的紅色熒光，而在未轉化陰性對照杜梨根中則無熒光信號（圖4）。

圖4 轉化的梨毛狀根中可以觀察到mCherry的熒光信號

3 小結與討論

本研究探索了杜梨毛狀根遺傳轉化技術，建立了一種通過發根農桿菌直接侵染杜梨產生不定根的方法。侵染時期為生長40 d，6～8片葉片的梨實生苗，注射20 d后，可見不定根在莖的注射部位生長，注射后45 d可見毛狀根生長良好，使用該方法可在45 d獲得長勢良好的轉基因杜梨毛狀根且植株陽性率可達17.6%。結果表明，發根農桿菌侵染誘導毛狀根發生是一種不依賴組織培養的高效轉化技術，也為杜梨基因功能研究提供了新的工具。

目前，果樹轉基因大多依賴根癌農桿菌轉化，通過根癌農桿菌轉化已成功在多種果樹上運用，包括蘋果［20］、山 定 子［21］、葡 萄［22］、草 莓［23］、荔枝［24］、香蕉［25］、柑桔［26］、棗［16］、桃［27］等。梨的轉基因研究也普遍采用此方法，以白梨系統的蘋果梨［28］和鴨梨［29］，砂梨系統的雪青［30］，西洋梨康弗倫斯、帕西和杜康［31，32］以及野生種的杜梨［33］獲得了轉基因植株。根癌農桿菌介導的遺傳轉化方法依賴于組織培養技術，所受影響因素較多，包括農桿菌濃度、適合的侵染時間、共培養時間、成熟的組織培養技術以及穩定高效的再生體系等［33］，這些因素都導致遺傳轉化再生頻率普遍偏低、周期相對較長，轉化效率低等問題［34，35］。

發根農桿菌己成功在多種植物上進行轉基因研究，尤其在藥用植物上應用廣泛［36-39］。在果樹遺傳轉化研究中，目前只在柑橘［14］和棗樹［16］上有發根農桿菌通過外植體侵染的研究報道。本研究初步建立了直接侵染杜梨實生苗獲得轉基因植株的一個簡單而高效的毛狀根轉化系統，能在相對短的時間內穩定轉化根。利用該轉化方法可以在梨上面開展基因功能驗證、次生代謝物及植物根系發育的研究，對于其他常見果樹如蘋果、葡萄等的毛狀根遺傳轉化體系建立有一定的參考意義。