五指毛桃組織培養(yǎng)快繁體系的研究

陳英之 ，霍秀意 ，歐陽(yáng)蒲月 ，2，甘鳳瓊 ，李良波 ，黃榮韶

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 510520；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200）

五指毛桃（Ficushirtavahl）又稱(chēng)為五指牛奶、粗葉榕、土北芪及五爪龍等，是桑科榕屬植物，具有活絡(luò)舒筋、補(bǔ)肺健脾和行氣利濕等功效，用于肺癆咳嗽、脾虛浮腫、盜汗、食少無(wú)力、月經(jīng)不調(diào)、帶下、水腫、產(chǎn)后無(wú)乳、風(fēng)濕痹痛等癥［1-3］。作為珍貴的藥用植物資源，五指毛桃是多種中成藥的原料，已廣泛應(yīng)用于臨床治療上。此外，五指毛桃還是藥食同源的植物，可以制成一些湯料、保健飲品、速溶粉等保健產(chǎn)品。

近年來(lái)，對(duì)五指毛桃的報(bào)道主要集中在品種的考證、化學(xué)成分分析、藥理活性等方面。組織培養(yǎng)方面，蔣林等［4］以五指毛桃莖節(jié)為外植體進(jìn)行離體再生研究，黃賽等［5］以頂芽為外植體進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)研究。蘇鈺琴［6］以五指毛桃莖尖外植體，進(jìn)行了初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)試驗(yàn)。李林軒等［7］以葉片作為外植體，進(jìn)行不同激素對(duì)比研究。陶瑜等［8］以新鮮五指毛桃種子為試驗(yàn)材料，比較了6-BA、NAA及2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-EBL）對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)率及根發(fā)生率的影響。本試驗(yàn)通過(guò)在培養(yǎng)基中添加不同的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素誘導(dǎo)五指毛桃種子萌發(fā)，以種子萌發(fā)率、不定芽增殖倍數(shù)、生根率、移栽成活率及組培苗的生長(zhǎng)情況為指標(biāo)來(lái)確定適合五指毛桃繁殖的培養(yǎng)基配方和移栽基質(zhì)，建立五指毛桃組織培養(yǎng)快繁體系，為大規(guī)模生產(chǎn)、保護(hù)五指毛桃的種質(zhì)資源、緩解五指毛桃供不應(yīng)求的市場(chǎng)壓力，同時(shí)為五指毛桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支撐；解決五指毛桃資源短缺制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)對(duì)種質(zhì)資源的優(yōu)化和快速利用。

1 材料與方法

1.1 材料

五指毛桃種子采自廣西南寧市邕寧區(qū)那樓鎮(zhèn)廣澤健康產(chǎn)業(yè)種植基地。將無(wú)病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)健壯且成熟的五指毛桃果實(shí)搓?duì)€果肉，取出種子。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 在超凈工作臺(tái)上，先用無(wú)菌水浸洗五指毛桃種子2次，每次浸洗2～3 min，浸洗時(shí)輕輕搖晃，再用75%乙醇浸洗30 s，無(wú)菌水沖洗3～4次，然后用0.1%HgCl2消毒12 min，用無(wú)菌水沖洗4次，置于無(wú)菌濾紙中晾干水分，接入培養(yǎng)基中。

1.2.2 接種 將消毒好的種子接入5種不同的培養(yǎng)基：以MS為培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加不同濃度的椰汁（0%、10%、20%）、不添加椰汁且將MS的量減半、10%的椰汁+6-BA1.5+NAA0.2。培養(yǎng)基中均添加20 g/L蔗糖、6.0 g/L瓊脂，pH調(diào)為5.8～6.0；培養(yǎng)基分裝后，于121℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min。

每瓶培養(yǎng)基接種5粒種子，在培養(yǎng)基上均勻分布，每個(gè)處理設(shè)2次重復(fù)。置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)室條件：溫度25℃，日光燈照明，光照時(shí)間12 h/d，光照度為1 500～2 000 lx。每隔3 d觀察1次，統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率和觀察種苗的長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 選取長(zhǎng)勢(shì)較好的五指毛桃種子萌發(fā)無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌手術(shù)刀將其切成1～2 cm的帶腋芽的莖段，接種到不同的培養(yǎng)基配方中。

以MS為培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、添加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和 NAA（0.3、0.6 mg/L）進(jìn)行雙因素試驗(yàn)，篩選出適合五指毛桃繁殖的培養(yǎng)基配方。每個(gè)處理5瓶，每瓶5個(gè)單芽。接種后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每隔3 d觀察1次，統(tǒng)計(jì)組培瓶?jī)?nèi)五指毛桃的增殖芽數(shù)、觀察苗的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 生根培養(yǎng) 選取生長(zhǎng)良好的繼代苗，剪成帶腋芽的莖段或單芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)以1/2MS為培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、添加0.3 mg/L NAA和不同濃度的IBA（1.0、1.5、2.0 mg/L）。每種處理接4瓶，每瓶5顆苗。接種后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每隔3 d觀察1次，統(tǒng)計(jì)組培瓶?jī)?nèi)五指毛桃的生根率及根條數(shù)，觀察各處理間組培苗的生長(zhǎng)情況。

1.2.5 移栽試驗(yàn) 不同移栽基質(zhì)以及組培苗在前期無(wú)菌條件下的生長(zhǎng)情況影響著其成活率，為篩選出適合組培苗生長(zhǎng)的基質(zhì)，本試驗(yàn)將莖高達(dá)5～6 cm且具有4～5條根的組培苗移栽至6種經(jīng)121℃滅菌30 min不同的基質(zhì)（珍珠巖、蛭石、育苗基質(zhì)、育苗基質(zhì)∶珍珠巖（1∶1）、育苗基質(zhì)∶蛭石（1∶1）、珍珠巖∶育苗基質(zhì)∶蛭石（1∶1∶1）中，每種處理裝10杯，每杯1株苗，比較移栽后苗的成活率和苗的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌苗的培養(yǎng)

不同配方培養(yǎng)基對(duì)五指毛桃無(wú)菌種子萌發(fā)的影響結(jié)果見(jiàn)表1，種子萌發(fā)后的生長(zhǎng)情況如圖1所示。結(jié)合表1和圖1可以看出，種子萌發(fā)率最高的培養(yǎng)基為處理1、處理2、處理3，萌發(fā)率均為70%，苗長(zhǎng)勢(shì)最好的培養(yǎng)基為處理2（即1/2MS）；加入椰汁反而不利于種子萌發(fā)，當(dāng)增加椰汁濃度時(shí)，種子的萌發(fā)率降低；同時(shí)加入椰汁、6-BA和NAA兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，種子的萌發(fā)率最低，只有30%。由此可知，1/2 MS+20 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為五指毛桃種子萌發(fā)最適的培養(yǎng)基。

表1 培養(yǎng)基對(duì)五指毛桃種子萌發(fā)的影響

2.2 繼代培養(yǎng)

不同處理間的增殖倍數(shù)和苗的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2和表3，不同濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素所培養(yǎng)出來(lái)的五指毛桃組培苗的增殖情況如圖2所示。結(jié)合表2和表3及圖2可以看出，不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，五指毛桃的增殖倍數(shù)最高，可達(dá)到3.40；添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的情況下，當(dāng)添加細(xì)胞分裂素6-BA 0.5 mg/L、生長(zhǎng)素NAA 0.3 mg/L時(shí)芽增殖最多，增殖倍數(shù)為3.04；通過(guò)方差分析可知，NAA對(duì)五指毛桃增殖培養(yǎng)的重要性大于6-BA，6-BA不同濃度水平間的差異顯著，NAA不同濃度水平間的差異極顯著，而6-BA和NAA兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的交互作用對(duì)五指毛桃的增殖培養(yǎng)差異不顯著。當(dāng)6-BA的濃度不變，NAA濃度增加時(shí)，增殖倍數(shù)降低，且苗的長(zhǎng)勢(shì)較弱；當(dāng)NAA的濃度不變，6-BA濃度增加時(shí)，增殖倍數(shù)也降低，但是降低的幅度相對(duì)較小，NAA的濃度變化對(duì)苗的增殖和長(zhǎng)勢(shì)影響較顯著。當(dāng)NAA濃度為0.6 mg/L時(shí)，愈傷組織較多，且苗出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。由此可知，MS+20 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為五指毛桃增殖最適的培養(yǎng)基，高濃度的6-BA和NAA不適合五指毛桃的增殖培養(yǎng)。

圖1 五指毛桃種子在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況比較

表2 不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)五指毛桃組培苗增殖的影響

表3 不同培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)方差分析

圖2 不同培養(yǎng)基配方五指毛桃的增殖比較

2.3 生根培養(yǎng)

不同濃度的IBA對(duì)五指毛桃組培苗影響結(jié)果見(jiàn)表4和表5，生根情況如圖3所示。結(jié)合表4、表5和圖3可以看出，不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（即1/2MS）的生根率最高，達(dá)到100%，其組培苗的長(zhǎng)勢(shì)也是最好的。當(dāng)添加IBA和NAA時(shí)，增加IBA的濃度，生根率降低，且苗長(zhǎng)勢(shì)也會(huì)隨IBA濃度的增大而變差。通過(guò)方差分析可知，IBA不同濃度水平對(duì)五指毛桃生根的影響差異顯著，各處理的重復(fù)間無(wú)顯著的差異性。由此可知，1/2MS+20 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為五指毛桃生根最適的培養(yǎng)基，生根率達(dá)100%。

2.4 移栽

取莖高達(dá)5～6 cm且有4～5條根的組培苗（圖4）移栽至不同的基質(zhì)中。五指毛桃組培苗成活率結(jié)果見(jiàn)表6，五指毛桃組培苗移栽第1天和移栽后30 d苗的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖5和圖6。結(jié)合圖5和表6可以看出，五指毛桃成活率最高的移栽基質(zhì)為珍珠巖，高達(dá)90%；成活率最低的基質(zhì)為育苗基質(zhì)；在育苗基質(zhì)∶蛭石（1∶1）的移栽基質(zhì)中，苗的長(zhǎng)勢(shì)最好。綜合苗的質(zhì)量情況，最適合五指毛桃移栽的基質(zhì)為育苗基質(zhì)：蛭石（1∶1）。

表4 不同濃度的IBA對(duì)五指毛桃生根的影響

表5 生根培養(yǎng)基平均生根數(shù)的方差分析

圖3 不同濃度的IBA對(duì)五指毛桃生根的影響

表6 不同移栽基質(zhì)五指毛桃成活率

圖4 移栽前的組培苗

圖5 移栽第1天的組培苗

圖6 移栽后30 d五指毛桃的生長(zhǎng)情況比較

3 討論

3.1 培養(yǎng)基添加物對(duì)五指毛桃種子萌發(fā)的影響

前人在植物組織培養(yǎng)的實(shí)踐過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加一些適宜的天然附加物可以促進(jìn)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，常用的附加物有椰汁、番茄汁、土豆汁和香蕉泥等［9］。天然的椰汁中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，在植物組織培養(yǎng)中得到了廣泛的應(yīng)用。

王楷等［10］研究表明，在培養(yǎng)基中添加10%的椰汁能提高白芨種子的萌發(fā)率，對(duì)原球莖的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用。孫玉芬［11］對(duì)蘭屬雜交種子無(wú)菌播種的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，添加椰汁對(duì)種子萌發(fā)的效果反而較不添加的效果差。

本試驗(yàn)結(jié)果與王楷等［10］的研究結(jié)果不同，與孫玉芬［11］的研究結(jié)果相似。添加椰汁不利于五指毛桃種子的萌發(fā)，分析原因可能是椰汁對(duì)五指毛桃種子萌發(fā)無(wú)促進(jìn)作用，過(guò)高濃度的椰汁抑制種子的萌發(fā)；也可能與椰汁中含有一些激素、氨基酸及酶等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。

3.2 五指毛桃增殖培養(yǎng)組培苗的褐化現(xiàn)象

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，許多組培苗會(huì)產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)，導(dǎo)致褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生，木本植物的褐變現(xiàn)象較嚴(yán)重［12］。褐化現(xiàn)象不僅與植物自身有關(guān)，而且還與外植體的處理、培養(yǎng)條件及植物激素的使用等有關(guān)［13，14］。

蔣林等［4］進(jìn)行探討發(fā)現(xiàn)，影響五指毛桃褐變的因素包括培養(yǎng)環(huán)境的光照與溫度條件、培養(yǎng)基的成分及植物體內(nèi)的酚類(lèi)物質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，五指毛桃組培苗出現(xiàn)褐化現(xiàn)象可能與培養(yǎng)基中NAA的濃度有關(guān)，還可能與不同激素濃度影響著五指毛桃產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)的程度有關(guān)，試驗(yàn)結(jié)果與蔣林等［4］對(duì)五指毛桃組織培養(yǎng)中褐變的原因探討結(jié)果相似。

3.3 IBA和NAA對(duì)五指毛桃生根的影響

IBA能促進(jìn)細(xì)胞分化、根系增多及伸長(zhǎng)［15］，NAA可以促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，兩種激素對(duì)五指毛桃的生根都有顯著影響。在生根培養(yǎng)過(guò)程中，可單獨(dú)使用IBA或NAA，也可兩種激素同時(shí)配合使用，不同激素配比及濃度得到的生根效果不同。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，同時(shí)添加IBA和NAA對(duì)五指毛桃生根的效果較不添加時(shí)的效果差，當(dāng)不添加IBA和NAA時(shí)，五指毛桃組培苗的生根率最高，與李林軒等［7］報(bào)道的誘導(dǎo)五指毛桃生根最適培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA的結(jié)果不同。尹明華等［16］對(duì)黃獨(dú)試管苗進(jìn)行生根研究表明，適當(dāng)濃度的NAA能促進(jìn)生根；付文奇等［17］研究東方百合幼苗的根系生長(zhǎng)，適宜的NAA和IBA配比能提高根系的活力，促進(jìn)生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，IBA和NAA對(duì)五指毛桃的生根未表現(xiàn)出促進(jìn)作用。這可能與本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的激素濃度范圍不適合五指毛桃生根相關(guān)；也可能與五指毛桃自身在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的內(nèi)源激素與所添加的外源激素相互作用有關(guān)。

3.4 不同基質(zhì)對(duì)五指毛桃移栽的影響

移栽試驗(yàn)是檢驗(yàn)組培苗能否適應(yīng)田間環(huán)境的途徑，而移栽成活率的高低又決定著組培苗能否實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，不同移栽基質(zhì)的移栽效果不同。李林軒等［7］研究結(jié)果顯示，泥炭∶珍珠巖（1∶1）是五指毛桃移栽最好的基質(zhì)，本試驗(yàn)結(jié)果與其研究結(jié)果有差異。本試驗(yàn)結(jié)果中，珍珠巖中五指毛桃的成活率最高，可能與珍珠巖的通氣性好、雜菌極少有關(guān)；其苗的長(zhǎng)勢(shì)不佳，可能與珍珠巖中無(wú)養(yǎng)分有關(guān)。

在五指毛桃快速繁殖中以種子為外植體，在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，不添加任何激素，就可以生長(zhǎng)發(fā)育為帶根的可移栽的幼苗，大大縮短了五指毛桃組培苗的培育時(shí)長(zhǎng)，提高了快速繁殖的效率，為五指毛桃快繁體系的建立提供了新途徑。