SARS-CoV-2的核酸檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制分析

王迪

【摘要】目的：核酸檢測結(jié)果是臨床確診SARS-CoV-2感染的重要依據(jù)，實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和及時性尤為重要。方法：通過國家發(fā)布的一系列診療依據(jù)、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)則、生物安全法等相關(guān)內(nèi)容，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室核酸檢測的經(jīng)驗(yàn)及本人培訓(xùn)學(xué)習(xí)的知識體系，從整個實(shí)驗(yàn)室流程分析實(shí)驗(yàn)室檢測存在的關(guān)鍵問題，質(zhì)量控制的關(guān)鍵，從而降低實(shí)驗(yàn)室核酸檢測存在的漏檢、假陰性的情況。結(jié)果：多方面的因素影響SARS-CoV-2的核酸檢測的質(zhì)量，但是樣本采集、運(yùn)輸、人員是注意的影響因素。結(jié)論：綜合因素影響核酸檢測的質(zhì)量，從人員培訓(xùn)、樣本采集、室間質(zhì)控多方面加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室管理，降低實(shí)驗(yàn)室漏檢、假陰性的結(jié)果。

【關(guān)鍵詞】新冠病毒;核酸檢測;質(zhì)量控制;人員培訓(xùn)

2019新型冠狀病毒（2019-nCoV/SARS-CoV-2，以下簡稱新冠病毒）屬于冠狀病毒科，β冠狀病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒。SARS-CoV-2對紫外線和熱敏感，在56℃加熱30分鐘即可失活，對乙醚、75%乙醇、氯、過氧乙酸和氯仿等脂溶性消毒劑敏感，但氯己定不能有效滅活病毒。核酸檢測作為病毒感染的直接證據(jù)在疾病的診斷、治療和防控中起到關(guān)鍵作用。國家衛(wèi)健委15日發(fā)布《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》，其中明確，新型冠狀病毒核酸檢測陽性為確診的首要標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)室工作的質(zhì)量保證應(yīng)覆蓋整個SARA-Cov-2核酸檢測流程，結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于分析前、分子中和分析后階段的質(zhì)量控制，對于SARA-Cov-2核酸檢測來說，分析前過程尤為重要，如果沒有有效的采集到標(biāo)本或運(yùn)輸和保存不當(dāng)使得標(biāo)本質(zhì)量降低，后續(xù)核酸檢測的質(zhì)量就無從談起。

1.分析前質(zhì)量控制

1.1樣本的采集

1.1.1采集標(biāo)本的種類

根據(jù)《新冠病毒樣本采集和檢測技術(shù)指南》，每個病例必須采集急性期呼吸道標(biāo)本，重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本;根據(jù)臨床需要，采集便標(biāo)本、全血標(biāo)本、血清標(biāo)本和尿標(biāo)本。物品和環(huán)境標(biāo)本根據(jù)檢測需求采集，不同類型標(biāo)本核酸檢測陽性率和病毒載量不同。臨床實(shí)際中約2/3的患者表現(xiàn)為干咳、無痰，因此目前最常用的標(biāo)本仍為鼻咽拭子。

1.1.2鼻咽拭子的采集

在選擇恰當(dāng)?shù)牟蓸訒r機(jī)和標(biāo)本類型的同時，必須采集到含有病毒的細(xì)胞，這是正確檢出RNA的前提。不恰當(dāng)?shù)臉?biāo)本采集是導(dǎo)致核酸檢測假陰性的一個非常重要的因素，如果沒有采集到合格的標(biāo)本，即使后續(xù)過程中檢測試劑合格、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范和質(zhì)量管理嚴(yán)格，也不可能得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。

鼻咽拭子采集的部位不不準(zhǔn)確、力度和深度不夠、停留時間不夠等都是影響后續(xù)檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。咽拭子采集需要在兩側(cè)咽扁桃體來回擦拭至少3次，由于個人敏感度不同，容易引起強(qiáng)烈的生理反應(yīng)導(dǎo)致咳嗽噴嚏，產(chǎn)生氣溶膠對采樣人員產(chǎn)生危險，采樣者心理素質(zhì)不強(qiáng)導(dǎo)致采樣不到位，核酸標(biāo)本質(zhì)量差，容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

因此要求采樣人員接受技術(shù)規(guī)范與操作規(guī)程、生物安全防護(hù)知識和實(shí)際操作技能培訓(xùn)，熟練掌握鼻咽拭子、口咽拭子等的規(guī)范采集方法，并且考核合格后才能進(jìn)行標(biāo)本的采集，后期仍需多次復(fù)訓(xùn)，強(qiáng)調(diào)規(guī)范采樣。

1.2樣本的保存與運(yùn)輸

由于SARA-Cov-2屬于RNA病毒，核酸容易發(fā)生自降解和生物酶介導(dǎo)的降解，高溫、反復(fù)凍融或標(biāo)本保存不當(dāng)都會造成核酸降解，影響標(biāo)本質(zhì)量，因此對標(biāo)本的保存和運(yùn)輸提出了更高的要求。《新冠病毒樣本采集和檢測技術(shù)指南》中指出，可在24小時內(nèi)檢測的標(biāo)本可4℃保存，24小時內(nèi)無法檢測的標(biāo)本應(yīng)-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則-20℃暫存）。如需運(yùn)輸，標(biāo)本采集后室溫（25℃）放置不宜超過4小時。如需長途運(yùn)輸建議采用干冰等制冷方式進(jìn)行保藏。標(biāo)本運(yùn)送期間應(yīng)當(dāng)避免反復(fù)凍融。

1.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備與試劑的選擇

核酸提取是檢測結(jié)果精密度的保證，提取使用的標(biāo)本量和檢測過程應(yīng)按照試劑說明書進(jìn)行，因?yàn)檫@些因素都可能對核酸的提取成功與否產(chǎn)生影響。在提取儀器使用過程中應(yīng)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行設(shè)備的清潔與維護(hù)，并做好記錄，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

市場上試劑品牌眾多，試劑盒的質(zhì)量和性能參數(shù)設(shè)置難免會有瑕疵，不同的試劑盒檢測靶標(biāo)、靈敏度、特異性與穩(wěn)定性都存在差異，不能排除個別樣本基因組變異等原因?qū)е碌募訇幮缘目赡埽虼嗽诮Y(jié)果判定時需要謹(jǐn)慎，采取兩種以上的不同試劑盒進(jìn)行判定。

1.4 人員培訓(xùn)

符合核酸檢測規(guī)定資質(zhì)（PCR上崗證）的實(shí)驗(yàn)室工作人員經(jīng)過生物安全培訓(xùn)考試合格方能上崗。定期針對新型冠狀病毒開展專項(xiàng)培訓(xùn)和考核。實(shí)驗(yàn)人員在檢測過程中，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程執(zhí)行，強(qiáng)化生物安全意識，規(guī)范操作，注意實(shí)驗(yàn)過程中的操作細(xì)節(jié)，提高數(shù)據(jù)分析能力。

2.分析中質(zhì)量控制

2.1 試劑準(zhǔn)備

根據(jù)試劑配制使用說明書嚴(yán)格配置，從冰箱冷凍取出的試劑要常溫融化，一定要混勻離心，如果試劑融化沒有混勻，這時候配置的試劑狀態(tài)是不均一的，會影響后期擴(kuò)增，影響結(jié)果。

2.2 核酸提取與擴(kuò)增

核酸提取是檢測結(jié)果的精密度的保證。現(xiàn)核酸提取使用最多的方法為磁珠分離法，提取使用的標(biāo)本量和檢測的過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。為避免造成批次間和批次內(nèi)的污染，核酸提取過程中采用3個陰性對照隨機(jī)放置在樣本中共同參與提取，此過程用來監(jiān)控可能發(fā)生的環(huán)境污染。另外實(shí)驗(yàn)室要采用帶有濾芯的槍頭，加樣的順序依次為樣本、陰性對照、陽性對照，防止污染。

目前核酸擴(kuò)增使用最廣泛和技術(shù)成熟度最高的方法為實(shí)時熒光RT-PCR。參照試劑說明書設(shè)置核酸擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)程序，多人檢查保證時間、溫度、循環(huán)次數(shù)等設(shè)置正確。為盡量避免光學(xué)混勻現(xiàn)象，PCR預(yù)混液與核酸提取物一定要混勻，上機(jī)時的反應(yīng)體系不要有大的氣泡，氣泡形成折射，干擾熒光的采集，可以采用適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)混勻去除氣泡，最后在上機(jī)前，一定要檢查密封是否完整，防止擴(kuò)增時液體的蒸發(fā)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，又造成實(shí)驗(yàn)室核酸污染。擴(kuò)增完成后反應(yīng)體系不可打開，直接至于垃圾袋中封口，不可高壓，按一般醫(yī)療廢棄物移出實(shí)驗(yàn)室處理。

2.3 室間質(zhì)量評價

室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量控制是檢測質(zhì)量保證的重要部分。每批次檢測至少一份弱陽性質(zhì)控品（第三方質(zhì)控品）、3份陰性質(zhì)控品（生理鹽水）、3份環(huán)境質(zhì)控品（開蓋過夜生理鹽水），質(zhì)控品隨機(jī)放在標(biāo)本中，參與從提取到擴(kuò)增的全過程（采集和技術(shù)指南）。弱陽性質(zhì)控定為陽性，3份陰性質(zhì)控品全部測定為陰性，視為在控，反之則為失控，應(yīng)立即停止實(shí)驗(yàn)分析原因，在分析和確定失敗原因后，必須使用儲存或信采集的樣本進(jìn)行重新檢測。

3分析后質(zhì)量控制

3.1結(jié)果的判定

SARA-Cov-2核酸檢測數(shù)據(jù)分析是獲得核酸檢測結(jié)果的重要環(huán)節(jié)。新型冠狀病毒肺炎防控方案 （第八版）核酸檢測方法主要針對新冠病毒基因組中開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。

無Ct值、無S形擴(kuò)增曲線判陰性。Ct值小于等于檢出限，且有S形擴(kuò)增曲線，判陽性。Ct值位于灰區(qū)，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若重做Ct值仍處于灰區(qū)，但出現(xiàn)明顯的S形擴(kuò)增曲線，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。

3.2實(shí)驗(yàn)室維護(hù)

防止污染是貫徹PCR實(shí)驗(yàn)室的準(zhǔn)則定律。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束要采取有效措施保證樣本的安全，用75%的酒精擦拭提取儀臺面、操作臺面、垃圾桶等，開啟移動紫外燈、屋頂紫外燈、生物安全柜紫外燈照射有效時間，所有垃圾采用雙層垃圾袋避免液體泄露，最后進(jìn)行高壓滅菌處理。

4.總結(jié)

影響SARA-Cov-2核酸檢出率的因素涉及各個環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量保證覆蓋到整個檢測流程，做好每一個環(huán)節(jié)的質(zhì)量把控，規(guī)范實(shí)驗(yàn)室操作，嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)量控制，積極參加室間質(zhì)評，避免實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。同時，采樣人員應(yīng)與實(shí)驗(yàn)室密切配合，加強(qiáng)對標(biāo)本的采集、保存、運(yùn)輸?shù)确矫娴馁|(zhì)量把控，規(guī)避風(fēng)險。

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