SARS-CoV-2的核酸檢測實驗室質量控制分析

王迪

【摘要】目的：核酸檢測結果是臨床確診SARS-CoV-2感染的重要依據，實驗室檢測結果的準確性和及時性尤為重要。方法：通過國家發布的一系列診療依據、實驗室準則、生物安全法等相關內容，結合本實驗室核酸檢測的經驗及本人培訓學習的知識體系，從整個實驗室流程分析實驗室檢測存在的關鍵問題，質量控制的關鍵，從而降低實驗室核酸檢測存在的漏檢、假陰性的情況。結果：多方面的因素影響SARS-CoV-2的核酸檢測的質量，但是樣本采集、運輸、人員是注意的影響因素。結論：綜合因素影響核酸檢測的質量，從人員培訓、樣本采集、室間質控多方面加強實驗室管理，降低實驗室漏檢、假陰性的結果。

【關鍵詞】新冠病毒;核酸檢測;質量控制;人員培訓

2019新型冠狀病毒（2019-nCoV/SARS-CoV-2，以下簡稱新冠病毒）屬于冠狀病毒科，β冠狀病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒。SARS-CoV-2對紫外線和熱敏感，在56℃加熱30分鐘即可失活，對乙醚、75%乙醇、氯、過氧乙酸和氯仿等脂溶性消毒劑敏感，但氯己定不能有效滅活病毒。核酸檢測作為病毒感染的直接證據在疾病的診斷、治療和防控中起到關鍵作用。國家衛健委15日發布《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》，其中明確，新型冠狀病毒核酸檢測陽性為確診的首要標準。

實驗室工作的質量保證應覆蓋整個SARA-Cov-2核酸檢測流程，結果的準確性依賴于分析前、分子中和分析后階段的質量控制，對于SARA-Cov-2核酸檢測來說，分析前過程尤為重要，如果沒有有效的采集到標本或運輸和保存不當使得標本質量降低，后續核酸檢測的質量就無從談起。

1.分析前質量控制

1.1樣本的采集

1.1.1采集標本的種類

根據《新冠病毒樣本采集和檢測技術指南》，每個病例必須采集急性期呼吸道標本，重癥病例優先采集下呼吸道標本;根據臨床需要，采集便標本、全血標本、血清標本和尿標本。物品和環境標本根據檢測需求采集，不同類型標本核酸檢測陽性率和病毒載量不同。臨床實際中約2/3的患者表現為干咳、無痰，因此目前最常用的標本仍為鼻咽拭子。

1.1.2鼻咽拭子的采集

在選擇恰當的采樣時機和標本類型的同時，必須采集到含有病毒的細胞，這是正確檢出RNA的前提。不恰當的標本采集是導致核酸檢測假陰性的一個非常重要的因素，如果沒有采集到合格的標本，即使后續過程中檢測試劑合格、實驗操作規范和質量管理嚴格，也不可能得到準確可靠的結果。

鼻咽拭子采集的部位不不準確、力度和深度不夠、停留時間不夠等都是影響后續檢測結果準確性的重要因素。咽拭子采集需要在兩側咽扁桃體來回擦拭至少3次，由于個人敏感度不同，容易引起強烈的生理反應導致咳嗽噴嚏，產生氣溶膠對采樣人員產生危險，采樣者心理素質不強導致采樣不到位，核酸標本質量差，容易產生假陰性結果。

因此要求采樣人員接受技術規范與操作規程、生物安全防護知識和實際操作技能培訓，熟練掌握鼻咽拭子、口咽拭子等的規范采集方法，并且考核合格后才能進行標本的采集，后期仍需多次復訓，強調規范采樣。

1.2樣本的保存與運輸

由于SARA-Cov-2屬于RNA病毒，核酸容易發生自降解和生物酶介導的降解，高溫、反復凍融或標本保存不當都會造成核酸降解，影響標本質量，因此對標本的保存和運輸提出了更高的要求?！缎鹿诓《緲颖静杉蜋z測技術指南》中指出，可在24小時內檢測的標本可4℃保存，24小時內無法檢測的標本應-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則-20℃暫存）。如需運輸，標本采集后室溫（25℃）放置不宜超過4小時。如需長途運輸建議采用干冰等制冷方式進行保藏。標本運送期間應當避免反復凍融。

1.3實驗室設備與試劑的選擇

核酸提取是檢測結果精密度的保證，提取使用的標本量和檢測過程應按照試劑說明書進行，因為這些因素都可能對核酸的提取成功與否產生影響。在提取儀器使用過程中應嚴格按照要求進行設備的清潔與維護，并做好記錄，確保檢測結果的準確性。

市場上試劑品牌眾多，試劑盒的質量和性能參數設置難免會有瑕疵，不同的試劑盒檢測靶標、靈敏度、特異性與穩定性都存在差異，不能排除個別樣本基因組變異等原因導致的假陰性的可能，因此在結果判定時需要謹慎，采取兩種以上的不同試劑盒進行判定。

1.4 人員培訓

符合核酸檢測規定資質（PCR上崗證）的實驗室工作人員經過生物安全培訓考試合格方能上崗。定期針對新型冠狀病毒開展專項培訓和考核。實驗人員在檢測過程中，嚴格按照標準操作規程執行，強化生物安全意識，規范操作，注意實驗過程中的操作細節，提高數據分析能力。

2.分析中質量控制

2.1 試劑準備

根據試劑配制使用說明書嚴格配置，從冰箱冷凍取出的試劑要常溫融化，一定要混勻離心，如果試劑融化沒有混勻，這時候配置的試劑狀態是不均一的，會影響后期擴增，影響結果。

2.2 核酸提取與擴增

核酸提取是檢測結果的精密度的保證。現核酸提取使用最多的方法為磁珠分離法，提取使用的標本量和檢測的過程嚴格按照說明書進行。為避免造成批次間和批次內的污染，核酸提取過程中采用3個陰性對照隨機放置在樣本中共同參與提取，此過程用來監控可能發生的環境污染。另外實驗室要采用帶有濾芯的槍頭，加樣的順序依次為樣本、陰性對照、陽性對照，防止污染。

目前核酸擴增使用最廣泛和技術成熟度最高的方法為實時熒光RT-PCR。參照試劑說明書設置核酸擴增的實驗程序，多人檢查保證時間、溫度、循環次數等設置正確。為盡量避免光學混勻現象，PCR預混液與核酸提取物一定要混勻，上機時的反應體系不要有大的氣泡，氣泡形成折射，干擾熒光的采集，可以采用適當的離心機混勻去除氣泡，最后在上機前，一定要檢查密封是否完整，防止擴增時液體的蒸發，導致實驗失敗，又造成實驗室核酸污染。擴增完成后反應體系不可打開，直接至于垃圾袋中封口，不可高壓，按一般醫療廢棄物移出實驗室處理。

2.3 室間質量評價

室內質量控制和室間質量控制是檢測質量保證的重要部分。每批次檢測至少一份弱陽性質控品（第三方質控品）、3份陰性質控品（生理鹽水）、3份環境質控品（開蓋過夜生理鹽水），質控品隨機放在標本中，參與從提取到擴增的全過程（采集和技術指南）。弱陽性質控定為陽性，3份陰性質控品全部測定為陰性，視為在控，反之則為失控，應立即停止實驗分析原因，在分析和確定失敗原因后，必須使用儲存或信采集的樣本進行重新檢測。

3分析后質量控制

3.1結果的判定

SARA-Cov-2核酸檢測數據分析是獲得核酸檢測結果的重要環節。新型冠狀病毒肺炎防控方案 （第八版）核酸檢測方法主要針對新冠病毒基因組中開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。

無Ct值、無S形擴增曲線判陰性。Ct值小于等于檢出限，且有S形擴增曲線，判陽性。Ct值位于灰區，建議重復實驗，若重做Ct值仍處于灰區，但出現明顯的S形擴增曲線，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。

3.2實驗室維護

防止污染是貫徹PCR實驗室的準則定律。每次實驗結束要采取有效措施保證樣本的安全，用75%的酒精擦拭提取儀臺面、操作臺面、垃圾桶等，開啟移動紫外燈、屋頂紫外燈、生物安全柜紫外燈照射有效時間，所有垃圾采用雙層垃圾袋避免液體泄露，最后進行高壓滅菌處理。

4.總結

影響SARA-Cov-2核酸檢出率的因素涉及各個環節，實驗室的質量保證覆蓋到整個檢測流程，做好每一個環節的質量把控，規范實驗室操作，嚴格的室內質量控制，積極參加室間質評，避免實驗室產生假陰性的結果。同時，采樣人員應與實驗室密切配合，加強對標本的采集、保存、運輸等方面的質量把控，規避風險。

參考文獻：

[1]國家衛生健康委和中醫藥局 《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版修訂版）

[2]國家衛生健康委和中醫藥局 《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版修訂版）》

[3]國家衛生健康委和中醫藥局 《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版修訂版）》

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[5]張瑞， 李金明. 如何減少新型冠狀病毒核酸檢測的"假陰性". 中華醫學雜志， 2020， 100（00）：E008-E008.

[6][7][8]新冠病毒樣本采集和檢測技術指南