CMIA與ELISA法檢測慢性HBV感染者HBeAg/抗HBe雙陽性現象的血清學特征和方法學差異

安 哲，李思鵬，屈 夢，薛 麗，董 煒，孟 昊，張 妮，周 源

(西安交通大學醫學院第二附屬醫院檢驗科，西安 710004）

乙型肝炎病毒血清標記物（hepatitis B virus serum markers，HBV-M）在慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B virus infection，CHB)的診斷治療中具有重要臨床價值[1]。HBeAg 血清學轉換是指HBeAg陽性個例的HBeAg 消失，繼而檢出抗HBe[2]。在HBeAg 血清學轉換過程中，部分感染者可以出現HBeAg 和抗HBe 共存現象。本次研究旨在分析HBeAg/抗HBe雙陽性的血清學特征及HBeAg/抗HBe雙陽性的方法學影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年1～12月在西安交通大學第二附屬醫院感染科就診并接受治療、臨床實驗室檢測乙肝病毒血清標記物結果呈HBeAg/抗HBe雙陽性的CHB 病例363例。另收集ELISA法檢測結果呈HBeAg/抗HBe雙陽性樣本87例。

1.2 方法和儀器 血清HBVDNA定量檢測采用熒光定量PCR法，試劑由達安基因診斷有限公司提供。HBV-M 五項采用化學發光免疫分析法（chemiluminecence microparticle immunoassay，CMIA）和酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosoebent assay,ELISA)兩種方法檢測。HBV-M 五項(CMIA)檢測試劑盒采用美國Abbott Laboratories 生產的乙型肝炎病毒血清標志物定量檢測試劑盒（化學發光免疫分析法），檢測儀器采用美國Architect I 2000自動免疫分析儀。HBV-M 五項ELISA法定性檢測試劑購自北京萬泰生物藥業股份有限公司，采用瑞士Tecon 免疫自動分析儀。

1.3 判定標準 CHB的診斷標準依據慢性乙型肝炎防治指南（2019版）[2]。以所有樣本經CMIA法定量檢測HBsAg 且HBsAg ≥0.05 IU/ml 判斷為HBsAg 陽性，以抗HBs ≥10 mIU/ml 判斷為抗HBs 陽性，HBeAg ≥1 S/CO 判斷為HBeAg 陽性，以抗HBe ≤1S/CO 判斷為抗-HBe 陽性。

1.4 統計學分析所有數據錄入SPSS16.0 進行統計學分析。構成比以百分率（%）表示，均值比較采用t檢驗，以P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 363例HBeAg/抗HBe雙陽性樣本的HBV-M分布特征 363例經CMIA法檢測HBeAg/抗HBe雙陽性樣本中，抗HBc 陽性率99.72%（362/363）；HBsAg 陽性率98.62%(358/363)，不同水平HBsAg構成比見圖1。抗HBs 陽性率8.82%（32/363）；不同抗HBs 水平下HBeAg，抗HBe 水平的差異以及抗HBs 分布特征見表1，比較不同組HBeAg和抗HBe，抗HBe 在抗HBs ≥100 IU/ml組和抗HBs ≥10 IU/ml組的差異有統計學意義。

圖1 363例HBeAg/HBe雙陽性CHB的HBsAg分布

表1 363例樣本中不同抗HBs 水平下HBeAg，抗HBe 的比較

HBeAg結果分布區間1.03～101.00 S/CO,均值5.27 S/CO。不同HBeAg 水平構占比分別是：1～9.99 S/CO 占87.88%，10～19.99 S/CO 占9.09%，20～29.99 S/CO 占1.65%，30～49.99 S/CO 占0.55%，≥50 S/CO 占0.83%。HBeAg＜20 IU/ml 占96.97%，結果見圖2。抗HBe 水平分布區間0.04～1.00 S/CO，均值0.61 S/CO。不同抗HBe 水平構占比分別 是：0.81～1.00 S/CO 占31.68%，0.51～0.80 S/CO占34.44%，0.10～0.50 S/CO 占29.75%，＜0.10 S/CO占4.13%，抗HBe＞0.10 IU/ml占95.87%，結果見圖2。

圖2 363例HBeAg/抗HBe雙陽性CHB的HBeAg 和抗HBe 分布趨勢

2.2 274例CMIA法檢測HBeAg/抗HBe雙陽性CHB 病例的HBV-DNA 特征 274例樣本進行了HBV-DNA 檢測。HBV-DNA 結果分布見圖3。不同HBV-DNA水平下HBeAg，抗HBe 水平的差異見表2，HBeAg 和抗HBe 在不同HBV-DNA水平組的差異具有統計學意義。

圖3 274例HBeAg/抗HBe雙陽性CHB的HBV-DNA分布

表2 不同HBV-DNA水平下HBeAg，抗HBe 水平的差異

2.3 HBeAg/抗HBe雙陽性結果的方法學差異ELISA法初檢HBV-M 呈HBeAg/抗HBe雙陽性樣本87例，經ELISA法復檢重復性54.02%（47/87）。47例復檢HBeAg/抗HBe雙陽性樣本采用CMIA法檢測，共檢出4種模式：HBeAg(+)/抗HBe(+)（6.38%），HBeAg(+)/抗HBe(-)（80.85%），HBeAg(-)/抗HBe(+)（8.51%），HBeAg(-)/抗HBe(-)（4.26%）。

CMIA法檢測HBeAg/抗HBe雙陽性樣本49例采用ELISA法復檢，檢出結果分別是：HBeAg(+)/抗HBe(+) 占4.08%，HBeAg(-)/抗HBe(+) 占10.20%，HBeAg(-)/抗HBe(-) 占85.72%。

3 討論

慢性乙型肝炎患者HBeAg 血清學轉換是指HBeAg 陽性個例的HBeAg 消失，繼而檢出抗HBe，并伴隨血清HBV-DNA 下降至＜103 IU/ml，它是HBeAg 陽性CHB 感染過程中一個重要轉折點。發生HBeAg 血清學轉換后，機體免疫耐受逐漸轉變為免疫激活，病毒復制活躍轉為復制降低，肝臟病變活動逐漸穩定和靜息。HBeAg 陽性慢性HBV感染約有80%可發生血清學轉換，部分感染者在HBeAg 血清學轉換過程中可以同時檢出HBeAg 和抗HBe，表現為抗原抗體共存，但是長期以來這一現象在實驗室的檢出又受到方法學的顯著影響。

CHB 病例出現HBeAg/抗HBe雙陽性結果時，①患者HBsAg 水平仍相對較高；②部分病例可能出現HBsAg/抗HBs 雙陽性反應引起，這可能與S基因的突變或表型變異有關；③HBeAg 和抗HBe水平總體偏低，接近臨界值；此類患者更容易發生HBeAg 血清學轉換；④HBV-DNA水平呈現多樣性，陽性較多見。

檢測系統和方法學差異也是當前HBV-M 檢測結果不一致的重要原因。研究發現ELISA法檢出HBeAg(+)/抗HBe(+)樣本中絕大多數為HBeAg 陽性，且HBeAg 呈高水平，HBV 顯現出高復制狀態。分析其原因可能與“帶現象”有關，ELISA法檢測抗HBe 采用競爭法和一步法，當待檢血清中存在高水平HBeAg 時，大量HBeAg 結合酶標記的抗HBe使得酶標記物無法結合微孔內包被的HBeAg，從而造成抗HBe 假陽性。對經CMIA法檢出HBeAg(+)/抗HBe(+)病例49例樣本進行了ELISA法檢測，進一步提示真實的HBeAg(+)/抗HBe(+)樣本經ELISA法檢測后，絕大多數表現為HBeAg(-)/抗HBe(-)，一小部分表現為HBeAg(-)/抗HBe(+)。

提供HBeAg 和抗HBe 準確檢測結果是對臨床實驗室提出的客觀要求，而準確判斷慢性HBV感染者HBeAg 血清學轉換也是治療療效監測和評估的重要依據。有研究證實，不同藥物治療后HBeAg血清學轉化發生的時間也不一致。本研究小組發現部分HBeAg 陽性CHB 感染者經治療后長期維持HBeAg 極低水平（HBeAg ＜10 S/CO）而難以繼續發生血清學轉換，部分慢性HBV感染者的HBeAg 和抗HBe 共存狀態持續存在，將繼續關注慢性HBV感染者的HBeAg 和抗HBe 共存狀態以獲得更加深入的研究成果。