輸卵管性不孕患者與生殖道感染不同沙眼衣原體基因型和cHSP60表達水平的相關性初步研究

楊艷華，肖光文，羅曉東

（嘉應學院醫學院，廣東梅州 514031）

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，CT)所致的泌尿生殖道感染是目前臨床最為常見的性傳播性疾病之一，女性感染后往往表現為盆腔炎、宮頸炎、輸卵管阻塞，嚴重的可導致輸卵管性不孕（tubal factor infertility，TFI）。引起泌尿生殖道感染 CT 的主要基因型別為 D～K型，目前對CT 的致病性與基因型是否相關的認識并不統一[1-3]，其致病能力強弱與基因型別是否關聯存在分歧，而尤其對于不同CT基因型導致TFI 是否存在差異，鮮有文獻報道。衣原體熱休克蛋白 60（chlamydial heat shock protein 60,cHSP60）是CT 的一個重要的致病因子，尤其與TFI 關系密切[4-5]。本文通過研究對比TFI患者與其他原因不孕患者不同基因型CT 感染情況及感染者生殖道標本中cHSP60 的水平，探討不同基因型CT 與TFI 的相關性，為進一步探明CT 導致TFI 的機制提供資料。

1 材料與方法

1.1 研究對象 采用前瞻性隊列研究2018年1月～2019年6月梅州城區所在的梅州市人民醫院、梅州市婦幼保健計劃生育服務中心和嘉應學院附屬醫院三家醫院收集的婦科或生殖中心就診和體檢的CT陽性女性不孕患者宮頸分泌物標本和資料。根據不孕原因分成TFI 和其他原因不孕，TFI 的納入標準[6]：①夫婦同居 1年或以上，保持正常的性生活并未采取任何避孕措施，女方仍未能受孕；②男方精液分析各項指標正常、精子穿透試驗為陽性；③女方連續 3個月卵泡 B 超監測發育正常且有成熟卵泡排出；④女方經期第2～3日基礎性激素水平正常； ⑤子宮輸卵管造影術（HSG）顯示子宮腔大小和形態正常，一側或雙側輸卵管管壁顯示不完全或完全阻塞； ⑥免疫性不孕（抗精子抗體等）血清系列檢測正常。其他原因不孕納入標準為符合條件①和②，但HSG 顯示為雙側輸卵管通暢的患者。

1.2 儀器與試劑 ABI 9600 PCR 核酸擴增儀購自美國ABI 公司，Biotek ELx808 酶標儀購自美國伯騰公司，ESCO 生物安全柜購自新加坡ESCO。QIAamp DNA Mini Kit 核酸提取試劑盒購自德國QIAGEN GmbH-Hilden 公司，巢式PCR CT-Omp1基因檢測試劑盒購自中山達安基因公司，cHSP60 ELISA試劑盒購自美國 RB 公司。

1.3 方法

1.3.1 標本的采集：婦科醫師使用陰道窺器先使宮頸暴露，取一個拭子將過多的黏液揩去后，取另一拭子在宮頸管內口1～2 cm 處旋轉一周并停留 20 s，避免碰及陰道壁的情況下將拭子慢慢拔出，置于盛有 1 ml 無菌生理鹽水的凍存管中，反復擠壓拭子1 min 至衣原體全部脫落，棄除擠干的拭子并立即保存標本于-70 ℃。

1.3.2 巢氏PCR 檢測CT 的Ompl 基因型：分離標本上清液并用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取核酸，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。然后按參考文獻[3]的操作步驟采用巢式PCR 擴增CT 外膜蛋白 Omp1 基因的 VD1-VD3 并測序分型。

1.3.3 酶聯免疫吸附 (ELISA) 法檢測標本上清中cHSP60 的表達：經巢氏PCR 檢測CT 陽性的患者標本，將分離的上清，采用 cHSP60 ELISA試劑盒檢測 cHSP60 的表達，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學分析 數據采用 SPSS21.0 軟件進行統計和分析。計數資料采用卡方檢驗進行分析，計量資料若符合正態分布的，以均數 ± 標準差(±s)表示，采用t檢驗進行分析，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的CT 陽性檢出率和陽性檢出者資料比較 收集TFI 患者254例，其中CT 陽性37例，陽性率為14.6%；其他原因不孕患者635例，CT陽性31例，陽性率為4.9%，兩組患者CT 陽性率差異有統計學意義(χ2=24.091，P＜0.001)。

2.2 TFI 與其他原因不孕患者中CT基因型分布情況 見表1。TFI與其他原因不孕患者均檢出了D，E，F，G，H，I，J 和K 基因型，未見其他型別基因型。其中TFI 患者中最常見的基因型為E，F 和J型，3種基因型共計23例，占62.2%（23/37），存在2例兩種基因型混合感染，其中1例為D和F 的混合感染、另1例為E和J型的混合感染;其他原因不孕患者中最常見的基因型為G型和D型，2種基因型共計18例，占58.1%（18/31）。TFI 與其他原因不孕患者基因型分布的比較，差異有統計學意義(χ2=16.958，P=0.031)。對各基因型在TFI 與其他原因不孕患者中所占比率進行比較，其中G型在其他原因不孕患者中所占比率顯著高于其在TFI 患者中的所占比率，差異有統計學意義(χ2=7.732，P=0.007)。

2.3 CT 陽性的TFI 與其他原因不孕患者生殖道中cHSP60表達水平 CT 陽性的TFI患者生殖道中cHSP60表達水平為111.5±15.0 ng/L，顯著高于CT 陽性的其他原因不孕患者的103.5±9.9 ng/L，差異有統計學意義(t=2.754，P=0.008)。

2.4 不同CT基因型TFI 患者cHSP60表達水平的比較 見表2。在TFI 患者中，其中感染E，F 和J基因型患者平均表達水平為116.5±14.9 ng/L，明顯高于感染D和G 基因型患者(101.8±9.8 ng/L)，差異有統計學意義(t=3.984，P＜0.001)。

表1 TFI 與其他原因不孕患者中CT基因型的分布情況[n(%)]

表2 不同CT基因型TFI 患者cHSP60表達水平之間的比較(±s )

表2 不同CT基因型TFI 患者cHSP60表達水平之間的比較(±s )

基因型 n cHSP60 (ng/L) 合計 cHSP60 (ng/L) t值 P值E 8 118.8±18.2 23 116.5±14.9 3.984 ＜0.001 F 8113.1±11.0 J 7 118.5±14.2 D 3 101.2±5.3 6 101.8±9.8 E 3 102.2±12.4

3 討論

CT所致的生殖道感染是目前最常見的性傳播疾病之一，其發病率分別4 倍于淋病和20 倍于梅毒[7]，CT 感染者中女性約占70%，又以15～34歲的性活躍者為主[8]，感染后可導致包括子宮頸炎、輸卵管阻塞、慢性盆腔炎等常見婦科疾病，并且容易引起TFI 的發生。其主要機制為CT 感染后可通過陰道宮頸經輸卵管蔓延到整個盆腔從而引起盆腔急性炎癥發作，嚴重時引起輸卵管腔粘連閉塞及積液，甚至出現系膜組織及腸管、輸卵管與子宮廣泛粘連而導致不孕。

在不同CT基因型引起泌尿生殖道感染的相關研究中，有文獻[9]表明F型引起的宮頸黏液膿細胞顯著低于E型，但由F型引起的子宮內膜疾病發生率更高，還有文獻報道女性出現下腹痛的概率與F型CT 的表達更密切[10]。本研究顯示，在TFI 人群與其他原因不孕人群中CT 的檢出率組間差異有統計學意義，而且兩組人群在不同CT基因型的分布比較差異亦有統計學意義。這表明不僅CT 及其不同基因型的感染可能與TFI 的發生存在某些關聯。近年的分子流行病學研究結果表明[5,7,13]，不同國家和地區，不同的族群CT基因型的分布都是有顯著差異的，全球各國流行的相對優勢基因型主要為E，D和F型。本研究中，梅州地區不孕人群中相對優勢的基因型除了E，F 和J，還包括G，D，H和K型，這和楊斌等[3]研究的廣東三市的基因型分布結果相似。

cHSP60 是熱休克蛋白gro-EL 家族同系物，它與真核生物HSP60 約有50%的同源性，與人HSP60 氨基酸順序的同源性為48%。cHSP60 是CT 的主要致病物質之一，是導致機體免疫損傷的重要抗原，是適應性免疫的主要靶點，可誘導前炎癥因子合成出現宮頸上皮細胞的凋亡[14]。高水平的 cHSP60 可通過信號轉導激活Th1 和Th2 分泌相關炎癥因子誘導了炎性反應，是導致輸卵管纖維化和管腔閉塞的重要原因，這種持續的免疫反應是永久性不可逆的輸卵管損傷的重要原因[15]。因此，cHSP60 和TFI 密切相關，其生殖道中的表達水平對于評價CT 的致病能力有一定的價值。本研究顯示TFI 患者生殖道中cHSP60 的表達水平顯著高于其他原因不孕患者，其中感染E，F 和J 基因型的TFI 患者生殖道中cHSP60 的表達水平明顯高于感染D和G 基因型的TFI 患者，這進一步證實了不同CT基因型與TFI 存在相關性的可能，E，F 和J型可能是相比D和G型能更高表達cHSP60 的基因型，從而更容易引起TFI。

本文只是從不同CT基因型與TFI 的相關性和生殖道cHSP60 的表達水平展開的初步研究，而這些都受患者人群、患者的個體差異和CT 感染的時效性等諸多因素的影響，不同CT基因型間毒力是否存在差異，是否某些型別與TFI 更密切，還需要通過更大樣本量的臨床調查和動物實驗等進行更周密的研究。

綜上所述，TFI 患者CT 感染的主要基因型可能為E，F 和J，而其他原因不孕患者CT 感染的主要基因型可能為D和G型，不同CT基因型感染可能與TFI 有關，E，F 和J型可能是與TFI 最密切的基因型，但要進一步了解CT基因型與TFI 的關系和機制，還需深入研究。