膀胱癌來源外泌體攜帶程序性死亡配體1 和共刺激分子B7-H4 的表達及初步鑒定

劉維輝 何清柳 穆 鑫 陳國鋒 陳俊毅 李毅寧

（福建醫科大學附屬第二醫院，福建 泉州 362000）

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，約95%為尿路上皮癌，手術治療后易復發和進展[1-2]。程序性死亡受體1（Programmed cell death 1，PD-1）/程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PDL1）免疫檢查點抑制劑僅對部分PD-L1 陽性表達的晚期膀胱尿路上皮癌患者有效。最新研究顯示對于一些PD-L1 抗體治療效果不佳的腫瘤，通過抑制腫瘤細胞外泌體PD-L1 的分泌并同時進行PDL1 抗體治療，能夠實現良好的抗腫瘤免疫療效[3]。共刺激分子B7-H4 是PD-L1（又名B7-H1）同家族成員，通過抑制T 細胞功能參與腫瘤免疫過程，前期研究結果顯示兩者與膀胱尿路上皮癌發生發展和復發密切相關[4]。為進一步探究PD-L1 和B7-H4與膀胱癌惡性生物學行為的關系，本研究提取并鑒定兩種膀胱癌細胞來源的外泌體，并檢測外泌體攜帶PD-L1（exosomal PD-L1，exo-PD-L1）和B7-H4（exosomal B7-H4，exo-B7-H4）的表達，為后續研究exo-PD-L1 和exo-B7-H4 對膀胱癌復發和進展的作用機制作準備。

1 資料與方法

1.1 細胞的培養及PD-L1 和B7-H4 蛋白的檢測：用10%胎牛血清的RPMI1640 細胞培養基培養細胞，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養及傳代。細胞免疫組化染色檢測目標蛋白的表達：細胞爬片貼壁成功后，4%多聚甲醛固定，0.5%TxitonX-100處理，山羊血清封閉，再分別加入B4-H4 和PD-L1單克隆抗體（1：200 稀釋），分別加入酶標二抗PBS沖洗后加DAB 混合液，蘇木素淡染30 秒，酒精逐級脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡觀察。

1.2 超速離心法提取膀胱癌BIU-87 和T24 細胞和膀胱正常上皮SV-HUC-1 細胞上清外泌體：收集細胞培養48h 后上清。上清液800×g，4℃離心10min。將上清液移至新的離心管中，2000×g，4℃再次離心10min，以去除較大的囊泡。取上清液至新的離心管，超速轉子，4℃，10，0000×g 離心1.5h。去除上清，用1mL 預冷PBS 重懸，超速轉子，再次4℃，10，0000×g 離心17min。去除上清后50μl 的PBS 重懸，每個樣品至少吹吸200 次。提取后的外泌體立即檢測或者凍存-80℃保存。

1.3 透射電子顯微鏡（Transmission?electron microscope，TEM）觀察膀胱癌細胞外泌體：將通過超速離心分離得到的外泌體取出5μL，重懸于30μL 的PBS 中。吸取樣品10μL 滴加于銅網上沉淀1min，濾紙吸去浮液。醋酸雙氧鈾（磷鎢酸）10μL 滴加于銅網上沉淀1min，濾紙吸去浮液。常溫干燥數分鐘。80kv 進行電鏡檢測成像。獲得透射電鏡（FEI Tecnai Spirit TEM T12）成像結果。

1.4 BCA 法測定膀胱癌細胞外泌體蛋白濃度：稀釋BSA 標準品，配置BCA 工作液然后進行定量檢測。

1.5 WB 檢測外泌體標志蛋白及PD-L1、B7-H4 的表達：根據待檢測樣品蛋白大小配制濃度為12 %的SDS PAGE 電泳膠。將蛋白樣品用移液器加入到電泳膠上的孔內。蓋上槽蓋，打開電源，跑膠。取出電泳膠，裁剪出相應大小的PVDF 膜。按照海綿-濾紙-電泳膠-膜-濾紙-海綿的順序制作轉膜“三明治”。300mA 轉膜。取出PVDF 膜，一抗封閉（anti-TSG101 1：1000；anti-PD-L1 1：500；anti-B7-H4 1：500；anti-CD9 1：1000；anti-CD63 1：1000）。加二抗室溫孵育1 h 左右。PVDF 膜上加ECL A/B 液混合液。將膜放在成像儀（GE LAS4000mini）中曝光，保存圖片。

1.6 RT-PCR 檢測SV-HUC-1 細胞中PD-L1 和B7-H4 的mRNA 的表達，WB 檢測SV-HUC-1 細胞外泌體PD-L1 和B7-H4 蛋白表達：①選擇生長良好的SV-HUC-1 細胞，按Trizol 法提取細胞總RNA，RT-PCR 試劑盒進行逆轉錄反應。根據人PD-L1 序列設計引物，正義序列5′-ACGCATTTACTGTCACGGTTCC-3′，反義序列3′-GACTTCGGCCTTGGGGTAGC-5′。根據人B7-H4 序列設計引物，正義序列5′TTAGGCTTGGTCCATGAGTTCA-3′，反義序列3′-TCTGTGAGTTGCACGTTTTTCAG-5′。以人β-actin 作內參。反應條件：50℃2min，95℃10min，然后95℃15 s，60℃1 min，共40 個循環。②WB 操作步驟參照1.1.5。

2 結果

2.1 PD-L1 和B7-H4 在膀胱癌BIU-87 和T24 細胞中的表達：膀胱癌BIU-87 和T24 細胞均有PDL1 和B7-H4 蛋白的表達，主要為胞漿表達，呈棕褐色，詳見圖1。膀胱正常上皮SV-HUC-1 細胞上無表達。

圖1 膀胱癌細胞PD-L1 和B7-H4 蛋白的表達

2.2 膀胱癌細胞上清外泌體蛋白檢測結果：BIU-87 和T24 細胞上清外泌體蛋白測出的OD560 值分別為0.34 和0.42，帶入公式得出提取出的外泌體總蛋白濃度分別為1.88 μg/μL 和1.84 μg/μL，總體積都為90μL（外泌體重懸體積取45μL+裂解液體積45μL，約90μL），得出提取的蛋白總質量分別為169 μg 和166 μg，詳見圖2。

圖2 BCA 法標準曲線

2.3 膀胱癌細胞外泌體形態及大小：TEM 觀察下見BIU-87 和T24 細胞外泌體直徑為30~150nm 的膜性囊泡，呈典型的“杯盤”形態，詳見圖3。

圖3 電鏡下膀胱癌細胞外泌體形態及大小

2.4 膀胱癌BIU-87 和T24 細胞外泌體標志蛋白及PD-L1、B7-H4 的表達鑒定：WB 檢測到BIU-87和T24 細胞上清外泌體的標志蛋白CD63 和CD9。同時，PD-L1 和B7-H4 均表達在exo-BIU-87 和exo-T24 中，詳見圖4。

圖4 BIU-87 和T24 細胞上清外泌體標志蛋白和PD-L1、B7-H4 的表達

2.5 exosome 與SV-HUC-1 細胞共培養后PD-L1和B7-H4 蛋白的表達：膀胱癌細胞外泌體與SVHUC-1 細胞共培養48h 后，RT-PCR 檢測SVHUC-1 細胞無PD-L1 和B7-H4 的mRNA 表達，WB 檢測PD-L1 和B7-H4 蛋白表達陽性，詳見圖5。

圖5 exosome 與SV-HUC-1 細胞共培養后PD-L1 和B7-H4 蛋白的表達

3 討論

外泌體是由細胞內多囊泡體（Multivesicularbody，MVB）與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質中的膜性囊泡。直徑為30～150nm，可由多種不同類型細胞分泌，多種體液及培養的腫瘤細胞上清液中亦檢測到衍生的外泌體存在，其攜帶并轉運蛋白質、脂類、DNA、miRNA 和非編碼RNA 等多種信號分子，廣泛參與細胞間通訊、血管生成、腫瘤免疫和機體代謝改變等生物學過程[5]，被認為是細胞間信號傳遞的第三種途徑[6]。

膀胱癌患者血液、尿液及腫瘤細胞上清液的外泌體中已檢測出包括蛋白質、miRNA 和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在內的多種遺傳信息存在差異性表達。外泌體中的內皮細胞糖蛋白能促進膀胱癌細胞遷移和內皮細胞的血管生成。多種膀胱癌衍生外泌體的miRNA 具有膀胱癌診斷標志物的潛力[7]。膀胱尿路上皮癌相關的lncRNA可促進膀胱癌細胞遷移和侵襲[8-9]。目前膀胱癌細胞來源的exo-PD-L1 和exo-B7-H4 的表達及對膀胱癌惡性生物學行為的作用研究鮮有報道。

PD-L1 和B7-H4 均是T 細胞活性抑制劑，是一類調節免疫應答的B7 家族共刺激分子，腫瘤細胞可以通過兩者介導的逃逸機制來逃避免疫監視和殺傷，已有報道PD-L1 和B7-H4 在膀胱癌、子宮內膜癌和腎細胞癌組織中存在共表達，參與了腫瘤的惡性生物學行為。PD-L1/PD-1 免疫檢查點抑制劑在膀胱尿路上皮癌、腎癌和肺癌等惡性腫瘤中的療效已得到確認，然而只有10%~30%的患者對PD-L1/PD-1 抗體治療有顯著療效。最新研究發現，PD-L1 也存在于惡性腫瘤外泌體中，并且其水平與腫瘤進展密切相關。exo-PD-L1 能夠促進PD-L1抗體治療的耐受性，對于PD-L1 抗體治療無效的前列腺惡性腫瘤，PD-L1 及其外泌體都促進癌細胞生長。在結直腸癌模型中，PD-L1 抗體與抑制exo-PD-L1 分泌可共同實現腫瘤抑制效果。通過抑制exo-PD-L1 分泌可增強T 細胞對乳腺癌細胞的殺傷，發揮強大的抗癌作用。轉移性黑色素瘤患者外周循環中exo-PD-L1 不僅抑制CD8+T 細胞的功能促進腫瘤生長，且患者體內exo-PD-L1 水平與抗PD-1 治療反應敏感性相關，能預測抗PD-1 治療結果。因此，exo-PD-L1 被認為是一種新的免疫治療靶點，可能解決目前PD-L1 抗體治療存在的耐受性問題。

基于腫瘤exo-PD-L1 能影響PD-L1/PD-1 免疫檢查點抑制劑臨床治療耐受性的最新研究結果，為進一步闡明PD-L1 和B7-H4 對膀胱尿路上皮癌復發和進展的作用機制，本研究培養膀胱癌BIU-87 和T24 細胞，細胞免疫組化染色確定PD-L1 和B7-H4 蛋白表達于兩種膀胱癌細胞，多步驟超速離心法成功提取兩種膀胱癌細胞上清液的外泌體，首先TEM 下觀察外泌體的大小和形態，并通過檢測外泌體標志蛋白CD63 和CD9 予以鑒定，最后證實兩種膀胱癌細胞上清液外泌體均攜帶PD-L1 和B7-H4。將膀胱癌細胞外泌體與膀胱正常上皮SVHUC-1 細胞共培養后，發現膀胱腫瘤微環境中的外泌體能將PD-L1 和B7-H4 傳遞給正常膀胱上皮細胞，且這種傳遞不是通過mRNA 來呈現，而是直接以蛋白表達的形式，相一致，說明膀胱腫瘤微環境中外泌體直接在翻譯層面傳遞PD-L1 和B7-H4。本研究結合前期研究結果顯示不僅膀胱癌組織存在PD-L1 和B7-H4 異常表達，兩者與膀胱癌復發進展密切相關；而且膀胱癌BIU-87 和T24 細胞亦表達PD-L1 和B7-H4，上清液中外泌體攜帶PD-L1 和B7-H4 蛋白，且后兩者能通過外泌體在膀胱腫瘤微環境中傳遞。后續我們將建立動物模型來研究exo-PD-L1 和exo-B7-H4 與膀胱癌惡性生物學行為的關系以及對免疫檢查點抑制劑耐受性的影響，為尋找新的膀胱癌免疫治療靶點作準備。