熊果酸預處理對急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用*

謝劍琳，呂君楠，胡潔，楊曉龍

邯鄲市中心醫院，河北邯鄲056000

急性心肌梗死是指冠狀動脈狹窄所致持續性缺血缺氧而引發心肌缺血性壞死，繼而出現心衰、惡性心律失常甚至猝死，是臨床上較為常見的急危重癥，發病率逐年上升且呈現年輕化趨勢，嚴重威脅人類的生命健康［1-3］。其中心肌梗死急性期并發心功能急劇減退是導致心源性猝死的主要原因［4］。氧化應激損傷［5-6］和炎癥級聯反應［7-8］在急性心肌梗死病理變化過程中發揮著重要作用。熊果酸是一種存在于天然植物中的五環三萜類化合物，具有抗氧化、抗炎等生物學活性［9-11］。本研究將制備急性心肌缺血再灌注（I／R）大鼠模型并于造模前7 d給予熊果酸進行預處理，探討熊果酸預處理對急性心肌I／R損傷的保護作用及可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物健康清潔級SD大鼠120只，雌雄各半，8周齡，體質量（250±20）g，購自河北省實驗動物中心［動物生產許可證號：SCXK（冀）2018-004］。飼養于邯鄲康業制藥有限公司［動物使用許可證號：SCXK（冀）2019-003］，飼養條件：溫度25℃，相對濕度（60±5）%，光照黑暗各12 h交替，自由飲水進食。本實驗經邯鄲市中心醫院倫理委員會審核批準［倫理號：HDZXLL（K）字2020-012］。

1.2 藥物與試劑熊果酸購自美國Sigma公司（純度≥98.5%，批號：89797）；鹽酸維拉帕米注射液上海禾豐制藥有限公司（批號：181016）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：201901016）；過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：201811009）；丙二醛（monochrome display adapter，MDA）試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：201903012）；硝基藍四氮唑（NBT）（上海前進試劑廠，批號：191127）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：190124）；細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：181203）；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：181130）；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：181215）。

1.3 儀器DW-2000型動物呼吸機（上海嘉鵬技術有限公司）；RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司）；DU700型紫外-可見分光光度計（美國Beckman Coulter公司）；SpectraMax M3型多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司）；BL-A420型動物心電圖機（上海精密科學儀器有限公司）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統（北京麥克奧迪儀器儀表有限公司）。

2 方法

2.1 模型制備與給藥將120只大鼠進行編號后按照隨機數字表法進行分組。設假手術組，I／R組，熊果酸低、中、高劑量（20 mg·kg-1、40 mg·kg-1、80 mg·kg-1）組和維拉帕米（2.5 mg·kg-1）組，每組20只。藥物溶液配制：精確稱量熊果酸后加入適量生理鹽水溶液，配制濃度為40 g·L-1的熊果酸溶液，然后依次加入0.9%氯化鈉溶液稀釋指標濃度為20 g·L-1、10 g·L-1的熊果酸溶液，同樣方法配制濃度為1.25 g·L-1的維拉帕米溶液。各組大鼠均于造模手術前7 d開始給藥（2 mL·kg-1）預處理，假手術組和I／R組同步給予等體積（2 mL·kg-1）0.9%氯化鈉溶液。參照張衛強等［12］報道的方法復制急性心肌I／R大鼠模型：采用冠狀動脈左前降支下2 cm處結扎30 min的方法，造模過程實施心電圖監測。以結扎后、再灌注前左心室壁呈灰白色、心電圖ST段抬高為急性心肌I／R大鼠模型成功標志。假手術組行手術通路但不結扎冠狀動脈左前降支。再灌注24 h后取材并行各指標檢測。其中I／R組大鼠死亡2只，熊果酸低、中劑量組各死亡1只，其他組大鼠未出現死亡現象。

2.2 指標檢測

2.2.1 監測心電圖ST段變化觀察并記錄再灌注24 h時各組大鼠心電圖ST段高度。

2.2.2 心功能指標測定麻醉后取仰臥位固定，通過小動物超聲實時影像系統，取左室乳頭肌水平短軸切面檢測心功能指標：舒張／收縮末期左室內徑（LVIDd、LVIDs）、短軸縮短率（fraction shortening，FS）、射血分數（ejection fraction，EF）、每搏輸出量（stroke volume，SV），連續測量5個心動周期取平均值。

2.2.3 心肌組織病理學檢查和損傷評分各組分別隨機取6只大鼠，深度麻醉后開胸取心臟，4%多聚甲醛溶液固定72 h后行石蠟包埋、切片（2μm厚），經二甲苯透明、梯度酒精脫蠟后行HE染色，中性樹膠封片后通過光學顯微鏡觀察心肌組織病理學變化。損傷評分［13］：無損傷，計0分；部分間質水腫和局灶性心肌細胞壞死，計1分；大面積心肌細胞腫脹和壞死，計2分；血管濃縮和心肌纖維萎縮性壞死，計3分；彌漫性血管濃縮、出血和心肌壞死，計4分。每只大鼠觀察5個視野，取平均值。

2.2.4 心臟梗死體積百分比測定各組分別隨機取6只大鼠，深度麻醉后開胸取心臟，0.9%氯化鈉溶液沖洗并擦拭干凈后進行切片（厚約2 mm），然后置恒溫37℃濃度2%的NBT溶液避光孵育30 min，每5 min翻動切片一次以使之均勻著色（灰白色為心肌梗死區），拍照后應用圖像分析系統進行圖像分析。

腦梗死體積百分比（%）＝［（梗死面積×切片厚度）／（切片面積×切片厚度）］×100%

2.2.5 心肌生化指標測定I／R組取剩余的6只大鼠，熊果酸低、中劑量組取剩余的7只大鼠，其余組取剩余的8只大鼠，麻醉后取心臟組織，于冰上剪碎后置離心管并加入9倍量RIPA蛋白裂解液，冰水浴中研磨勻漿，低溫高速（4℃，12 000 rpm，離心半徑13.5 cm）離心15 min后取上清液。嚴格遵照試劑盒說明步驟處理后，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，生化分析法測定CAT活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，ELISA測定IL-1β、ICAM-1、IL-6、TNF-α水平。

2.3 統計學處理結果以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較通過SPSS 15.0軟件行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準取α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 心電圖ST段監測結果與假手術組比較，I／R組大鼠心電圖ST段明顯抬高（P＜0.01）；與I／R組比較，熊果酸中、高劑量和維拉帕米進行預處理組明顯抑制急性心肌I／R大鼠心電圖ST段抬高（P＜0.05；P＜0.01）；與維拉帕米預處理組比較，熊果酸高劑量預處理組ST段高度變化不大，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠心電圖監測結果

3.2 心功能指標測定結果與假手術組比較，I／R組大鼠LVIDd、LVIDs顯著升高，FS、EF、SV顯著降低（P＜0.05；P＜0.01）；與I／R組比較，熊果酸中、高劑量和維拉帕米進行預處理能夠明顯抑制急性心肌I／R大鼠LVIDd、LVIDs的升高和FS、EF、SV的降低（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高劑量預處理組LVIDs顯著低于維拉帕米預處理組（P＜0.05），其他指標兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心功能指標測定結果（±s）

表1 各組大鼠心功能指標測定結果（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與I／R組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與維拉帕米組比較，＃P＜0.05；1 mmHg＝0.133 kPa

組別n LVIDd（P／mmHg）LVIDs（P／mmHg）FS／%EF／%SV（v／μL）82 187.62±25.65 I／R組18 7.32±0.35*6.22±0.49**16.51±3.08**30.49±6.47**80.47±18.25**熊果酸低劑量組19 7.20±0.41 5.98±0.53 18.20±3.19 33.59±7.03 87.08±21.39熊果酸中劑量組19 7.08±0.35 5.35±0.38△23.63±4.51△39.30±8.42△97.68±18.23△熊果酸高劑量組20 6.84±0.29△4.97±0.41△△＃29.27±6.04△△45.13±8.64△△122.56±23.18△△維拉帕米組20 6.76±0.30△5.43±0.40△26.52±5.79△△42.75±7.80△△116.34±21.95假手術組20 6.71±0.39 3.79±0.35 42.97±7.43 73.16±10.△△

3.3 心肌組織病理學檢查和損傷評分結果假手術組大鼠心肌組織細胞未見病理性形態和結構改變；I／R組大鼠呈現心肌纖維條理不清、斷裂和排列紊亂，心肌細胞腫脹、界限不清，炎性細胞浸潤等病理性改變；熊果酸或維拉帕米預處理組能夠明顯抑制急性心肌I／R大鼠心肌組織細胞病變，其中熊果酸高劑量預處理組效果更為顯著。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理學檢查結果（HE，×200）

3.4 心肌組織損傷評分和心臟梗死體積百分比結果損傷評分結果顯示：與假手術組比較，I／R組大鼠心肌組織損傷評分顯著升高（P＜0.01）；與I／R組比較，熊果酸中、高劑量和維拉帕米組可明顯降低損傷評分（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高劑量組損傷評分顯著低于維拉帕米預處理組（P＜0.05）。心臟梗死體積百分比結果顯示：與假手術組比較，I／R組大鼠心臟梗死體積百分比顯著升高（P＜0.01）；熊果酸中、高劑量和維拉帕米組明顯降低急性心肌I／R大鼠梗死體積百分比（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高劑量組對心臟梗死的抑制作用顯著優于維拉帕米組（P＜0.05）。見表2，圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織梗死狀況（NBT染色）

表2 各組大鼠心肌損傷評分和梗死體積百分比測定結果（±s）

表2 各組大鼠心肌損傷評分和梗死體積百分比測定結果（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與I／R組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與維拉帕米組比較，＃P＜0.05

／%假手術組組別n 心肌組織損傷評分／分 梗死體積百分比6 0.00±0.00 0.00±0.00 I／R組6 7.35±1.97**46.95±8.51**熊果酸低劑量組6 6.85±2.42 42.18±9.43熊果酸中劑量組6 5.63±1.25△33.52±5.37△△熊果酸高劑量組6 3.54±0.60△△＃29.26±5.03△△＃維拉帕米組6 4.62±0.72△△35.94±6.27△△

3.5 心肌組織氧化應激指標測定結果與假手術組比較，I／R組大鼠心肌組織SOD、CAT活性顯著降低且MDA含量顯著升高（P＜0.01）；熊果酸中、高劑量和維拉帕米組可明顯升高急性心肌I／R大鼠心肌SOD、CAT活性且降低MDA含量（P＜0.05；P＜0.01）；熊果酸高劑量組可升高SOD活性和降低MDA含量的作用顯著優于維拉帕米組（P＜0.05；P＜0.01），兩組間CAT活性差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織氧化應激指標測定結果（±s）

表3 各組大鼠心肌組織氧化應激指標測定結果（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與I／R組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與維拉帕米組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別n SOD／U·mg-1 Pro CAT／U·mg-1 Pro MDA／nmol·mg-1 Pro假手術組8 67.04±8.13 4.75±0.56 3.48±0.51 I／R組6 45.81±6.64**2.98±0.74**9.26±1.43**熊果酸低劑量組 7 49.75±7.17 3.11±0.62 7.90±1.15△熊果酸中劑量組 7 54.96±6.82△3.85±0.65△6.43±1.07△△熊果酸高劑量組 8 63.14±7.73△△＃ 3.83±0.70△4.82±0.84△△＃＃維拉帕米組8 50.28±6.94 3.36±0.52 7.07±1.12△

3.6 心肌組織炎癥因子含量測定結果與假手術組比較，I／R組大鼠心肌組織IL-1β、ICAM-1、IL-6、TNF-α水平顯著升高（P＜0.01）；與I／R組比較，熊果酸中、高劑量組可明顯降低I／R大鼠心肌組織IL-1β、ICAM-1、IL-6、TNF-α水平（P＜0.05；P ＜0.01），維拉帕米組能夠明顯降低ICAM-1水平（P＜0.05）；熊果酸高劑量組降低對TNF-α、IL-1β、IL-6水平作用顯著優于維拉帕米組（P＜0.05；P＜0.01），兩組間ICAM-1含量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠心肌組織炎癥因子含量測定結果（±s）

表4 各組大鼠心肌組織炎癥因子含量測定結果（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與I／R組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與維拉帕米組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別n IL-1β（ρ／μg·L-1）ICAM-1（ρ／μg·L-1）IL-6（ρ／μg·L-1） TNF-α（ρ／μg·L-1 9.08 I／R組6 203.17±19.40**718.62±93.53**74.81±7.42**188.36±19.75**熊果酸低劑量組7 190.48±22.29 681.82±103.76 69.78±7.93 177.47±25.53熊果酸中劑量組7 164.61±20.31△547.05±82.36△△60.49±5.23△147.24±18.56△熊果酸高劑量組8 113.52±18.49△△＃＃495.61±64.79△△49.15±4.60△△＃＃134.58±13.51△△維拉帕米組8 189.28±20.87 568.14±95.27△假手術組8 32.04±4.75 355.13±41.07 25.06±3.38 66.94±69.43±7.29 167.32±21.68）＃

4 討論

急性心肌梗死是目前發病率很高且仍呈上升趨勢的缺血性心血管疾病，致殘、致死率極高［14-15］。通過藥物溶栓或介入取栓等方法及時實現梗死相關動脈再通，恢復血流灌注、挽救瀕死心肌細胞、減小梗死面積，是目前臨床上救治急性心肌梗死的首選方案，但I／R損傷并發癥的存在卻嚴重影響著該部分患者的預后，是臨床亟待解決的難題。

給藥預處理是臨床上預防組織器官I／R損傷的常用方案。熊果（又名熊葡萄）是杜鵑花科熊果屬的一種可藥用植物，熊果酸是其主要活性成分，是一種具有多種生物學活性的五環三萜類化合物［16］。本課題組既往研究發現，熊果酸能夠通過調節血脂、改善血流動力學指標、抑制主動脈病變等而對動脈粥樣硬化大鼠起到保護作用［17-18］。王金艷等［19］研究發現，熊果酸具有抑制動脈粥樣硬化大鼠氧化應激和炎癥反應的作用，但對嚴重動脈粥樣硬化導致急性心肌缺血并發癥后是否具有保護作用尚未見文獻報道。本研究采用冠狀動脈左前降支下2 cm處結扎30 min的方法制備急性心肌I／R大鼠模型，并于術前7 d給予熊果酸進行預處理，以維拉帕米為陽性對照藥物，維拉帕米能夠通過抑制Ca2＋內流而減輕I／R損傷［20-21］，是臨床上治療心肌I／R損傷的常用藥物。本研究結果顯示，經熊果酸預處理能夠有效抑制急性心肌I／R大鼠心電圖ST段抬高、抑制心臟梗死體積增大、抑制心肌組織細胞形態結構病理性改變和損傷評分的升高，提示熊果酸預處理對急性心肌I／R損傷具有保護作用。

超聲檢測LVIDd、LVIDs以及FS、EF、SV指標能夠及時、準確反映心臟組織功能狀態。本研究結果顯示，經熊果酸預處理能夠有效抑制急性心肌I／R大鼠LVIDd、LVIDs升高和FS、EF、SV降低，提示熊果酸預處理具有抑制急性心肌I／R大鼠心肌損傷、保護其心功能的作用。

心肌I／R損傷病理機制非常復雜，張毅等［22］和王明娟等［23］研究發現氧化應激在I／R病理過程中發揮著重要作用。活性氧自由基（ROS）大量生成以及抗氧化酶過度消耗是導致氧化應激損傷的根本原因，ROS攻擊不飽和脂肪酸而破壞細胞膜并損傷核酸、引發DNA斷裂，MDA為脂質過氧化終產物，其含量與ROS數量成正相關，所以MDA也是評價氧化應激損傷的敏感指標［24-25］。熊果酸具有良好的抗氧化活性。本研究發現，經熊果酸預處理能夠有效抑制急性心肌I／R大鼠心肌組織抗氧化酶（SOD、CAT）活力降低和MDA水平升高，提示熊果酸預處理具有抑制急性心肌I／R大鼠心肌組織氧化應激損傷的作用。

急性心肌I／R后因缺血缺氧而引發心肌組織釋放粘附分子、激肽等炎性介質而導致炎癥反應，誘導炎性細胞趨化并聚集于心肌組織梗死區，釋放TNF-α、IL-6、ICAM-1等多種炎癥因子，并進一步促進炎癥反應，最終形成炎癥級聯反應［26-27］。心肌組織含有能夠分泌TNF-α的巨噬細胞，而TNF-α在炎癥反應的起始及整個過程均發揮著重要作用，并可誘導C反應蛋白合成，是引發炎癥反應的重要因子［28-29］。IL-1β參與免疫細胞聚集，為炎癥細胞因子生成創造條件［30］。本實驗研究發現，經熊果酸預處理能夠有效降低急性心肌I／R大鼠心肌組織TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-6水平，提示熊果酸預處理具有抑制急性心肌I／R大鼠心肌組織炎癥級聯反應的作用。

綜上所述，熊果酸預處理對急性心肌I／R損傷大鼠心功能和心肌組織損傷具有保護作用，其機制可能與抑制氧化應激損傷和炎癥級聯反應有關。