奧司他韋對寒冷刺激致鼻黏膜免疫屏障功能低下模型小鼠的保護作用*

晏雪梅，楊居崩，聶發龍，廖 陳，李秀芳

（云南中醫藥大學，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染（URTI）為常見呼吸系統疾病，包括流行性感冒（簡稱流感）、普通感冒、病毒性咽炎等，URTI向下呼吸道遷延而出現的多種并發癥是導致URTI患者致殘或致死的重要原因。2018年，KWONG等[1]指出，急性心肌梗死與急性URTI尤其是流感之間關系密切，患者在確認感染流感后的前7 d，急性心肌梗死發作的概率可增加6倍。一項針對感染甲型流感（H7N9）幸存病例出院后2年的隨訪調查顯示，50%的幸存者在感染治愈后的1年內仍存在嚴重的通氣功能障礙[2]。由于80%以上的URTI由病毒感染引起，故接種疫苗和使用抗病毒藥物是臨床對因治療最有效的手段。目前，臨床常用的URTI抗病毒藥物包括神經氨酸酶抑制劑、脫氧核糖核酸（RNA）聚合酶抑制劑和M2蛋白離子通道抑制劑。神經氨酸酶抑制劑由于耐藥率相對較低，作用特異性較強，可阻礙病毒顆粒的釋放，高效抗病毒。奧司他韋是神經氨酸酶抑制劑，可競爭性結合流感病毒表面的神經氨酸酶活性，干擾病毒從宿主細胞釋放，阻礙病毒擴散，對甲型和乙型流感病毒具有較好的抑制作用。UYEKI[3]研究發現，奧司他韋可降低疾病的嚴重程度和死亡率。H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等均可由呼吸道進入機體，引發疾病，覆蓋于呼吸道的黏膜系統成為機體防御病毒、細菌等病原微生物經口鼻入侵的第一道防線。研究證實，呼吸道黏膜屏障結構破壞或功能低下與URTI密切相關[4]，提高呼吸道黏膜屏障的防御能力是防治URTI的重要途徑。本研究中探討了奧司他韋對寒冷刺激所致小鼠鼻黏膜免疫屏障功能低下（MNMBD）的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥、儀器與動物

試藥：磷酸奧司他韋顆粒（宜昌東陽光長江藥業股份有限公司，批號為0581903053）；Mouse IgA Antibody（美國 Novus Biologicals公司，批號為 A30）；β -Actin Polyclonal antibody（批號為 00078629），GAPDH Rabbit Polyclonal antibody（批號為00044915），均購自美國 Proteintech 公司；干擾素λ受體 1（IFNLR1）Antibody（英國biorbyt公司，批號為 CB17514）；白細胞介素10Rβ（IL-10Rβ）Antibody（美國 Santa Cruz公司，批號為 D1015）；干擾素調節因子 9（IRF9）Antibody（美國 Cell Signaling 公司，批 號 為 288455）；Anti-IL-28A Antibody（批號為GR24656-5），Anti-黏病毒抗性蛋白 1（Mx-1）Antibody（批號為GR3190794-16），均購自美國Abcam公司。

儀器：Infinite M200 PRO型酶標儀（瑞士Tecan公司）；XS125A型分析天平（瑞士普利賽斯公司，精度為十萬分之一）；HITACHI CF16RXⅡ型臺式低速離心機（日本Hitachi Koki公司）；PowerPac U 型電泳儀、Mini-Proto型濕轉儀，均購自美國伯樂公司；Bio Spectrum型UVP凝膠成像分析系統（美國Spectrum公司）。

動物：SPF級昆明種小鼠38只，雄性，體質量18～20 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK（川）2015-030，合格證號為 51203500009727。飼養條件為光照12 h、黑暗12 h，溫度18～22℃，相對濕度40%～60%。

1.2 方法

復制寒冷刺激致小鼠MNMBD模型[5-6]。

將小鼠隨機分為正常組（12只）、模型組（12只）、奧司他韋組（14只）。正常組和模型組灌胃蒸餾水，奧司他韋組小鼠提前灌胃奧司他韋，臨用時按臨床成人等效量的2倍量（40 mg/kg）進行配制，每10 g體質量0.2 mL灌胃給藥，1次/日，連續給藥3次。正常組不予任何刺激；模型組和奧司他韋組小鼠均于末次給藥30 min后置-20℃環境中1 h，再置25℃環境中30 min，循環刺激2次，造模后正常給予水和食物。于造模結束后24 h，過量麻醉，處死小鼠，摘取鼻黏膜，使用免疫印跡（Western Blot）法檢測鼻黏膜組織中免疫球蛋白 A（IgA）、干擾素 λ（IFN-λ）、IFNLR1、IL-10Rβ、IRF9 和Mx-1蛋白表達水平。

模型組小鼠鼻黏膜組織中，IgA和IFN-λ蛋白表達水平與正常組相比，明顯下降，若差異有統計學意義則判斷為造模成功。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 對IgA蛋白表達的影響

結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中IgA蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，奧司他韋組小鼠鼻黏膜中IgA蛋白表達水平顯著升高（P ＜0.01）。詳見圖 1 A。

2.2 對IFN-λ蛋白表達的影響[7]

結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中IFN-λ蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，奧司他韋組小鼠鼻黏膜組織中IFN-λ蛋白表達水平升高（P＜0.05）。詳見圖1 B。

2.3 對IFNLR1和IL-10Rβ蛋白表達的影響

結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中IFNLR1和IL-10Rβ蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，奧司他韋組小鼠鼻黏膜組織中IFNLR1蛋白表達水平呈升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），IL-10Rβ蛋白表達水平明顯高于模型組（P＜0.01）。詳見圖1 C和圖1 D。

2.4 對IRF9蛋白表達的影響

結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中IRF9蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，奧司他韋組小鼠鼻黏膜組織中IRF9蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖1 E。

2.5 對Mx-1蛋白表達的影響

結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中Mx-1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，奧司他韋組小鼠鼻黏膜組織中Mx-1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。詳見圖1 F。

3 討論

上呼吸道與外界直接相通，覆蓋于除鼻前庭外鼻腔結構的鼻黏膜，始終暴露于病原菌、共生菌和環境化學物質等各種物質中，由鼻黏膜激發的免疫效應對于防御病原體經鼻進入機體至關重要。研究表明，鼻黏膜屏障結構遭到破壞或功能低下可為病原微生物的入侵和定植創造條件，是上呼吸道感染發生的重要原因之一[8-9]。分泌型免疫球蛋白A（sIgA）是黏膜免疫系統的主要效應分子，在機體第一線屏障中起重要作用，可防止病原體進入黏膜上皮，保護黏膜表面免受病原體和致病菌的侵害[10-11]。本研究結果顯示，MNMBD模型小鼠鼻黏膜組織中IgA蛋白表達明顯下降，給予奧司他韋后可顯著促進小鼠鼻黏膜組織中的IgA蛋白表達，提示其可提高小鼠鼻黏膜免疫屏障功能。

注：與正常組比較，**P＜0.01，*P ＜0.05；與模型組比較，##P ＜0.01，#P ＜0.05。A.Ig A B.IFN-λ C.IFNLR1 D.IL-10Rβ E.IRF9 F.Mx-1圖1 奧司他韋對MNMBD模型小鼠鼻黏膜組織中免疫屏障功能的影響Note：Compared with those in the normal group，**P ＜ 0.01，*P ＜ 0.05；compared with those in the model group，##P ＜ 0.01，#P ＜ 0.05.A.IgA B.IFN-λ C.IFNLR1 D.IL-10Rβ E.IRF9 F.Mx-1Fig.1 Effect of Oseltamivir on the immune barrier function in the nasal mucosa tissues of MNMBD model mice

IFN-λ是近15年才發現的特異性產生于黏膜組織的免疫效應分子，在抗病毒和免疫調節方面發揮重要作用，具有參與維持上呼吸道黏膜免疫屏障功能的重要作用，可通過誘導抗病毒蛋白的表達防止病毒侵襲，維持黏膜屏障功能的完整性。有研究顯示，寒冷刺激可使IFN-β誘導的抗病毒反應下降[12]。本研究結果顯示，反復的寒冷刺激可降低小鼠鼻黏膜IFN-λ蛋白表達。IFN-λ的受體為IFNLR1和IL-10Rβ的異源二聚體，IFN-λ與其受體結合，啟動Janus激酶-信號轉導及轉錄激活因子（JAK-STAT）信號級聯反應，JAK-STAT信號轉導通路是將細胞因子刺激信號經細胞膜進入細胞核內部的重要途徑，IFN刺激基因的激活在細胞內建立抗病毒狀態，促使抗病毒蛋白因子如2′，5′-寡聚腺苷酸合成酶（OAS）、核糖核酸依賴性蛋白酶（PKR）和Mx-1的釋放，抑制病毒復制，發揮抗病毒作用[13]。可見，IFN-λ并非直接抑制或殺死病毒，而是通過啟動相關抗病毒基因的表達，促使多種抗病毒蛋白的產生，從而發揮抗病毒作用[14-15]。Mx-1是關鍵的抗病毒效應因子[16-19]，Mx-1蛋白是IFN-λ關鍵的抗病毒效應蛋白[20-21]，是控制多種病毒的天然免疫系統的高度有效的抗病毒限制因子，可阻止病毒在細胞內的傳播及復制。本研究結果顯示，寒冷刺激后，小鼠組織中IgA，IFN-λ，IFNLR1，IL-10Rβ，IRF9，Mx-1 蛋白表達水平均下降。可見，寒冷刺激造成了小鼠鼻黏膜免疫屏障下降，這或許是受涼后易發生URTI的原因之一。給予奧司他韋干預后，可明顯提高小鼠鼻黏膜 IgA，IFN-λ，IFNLR1，IL-10Rβ，IRF9，Mx-1 蛋白表達水平。可見，奧司他韋可提高寒冷刺激所致小鼠鼻黏膜免疫屏障的功能，作用機制與激活了小鼠鼻黏膜組織中IFN-λ相關信號通路有關。