奶酪中高產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化

黃倩，李潔，鄭曉春，王斌，史學偉

(石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000)

β-半乳糖苷水解酶(EC.3.2.1.23)又稱β-D-半乳糖苷水解酶和乳糖酶，它能催化乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，具有轉(zhuǎn)糖苷作用，是一種無毒無害的工業(yè)酶；在食品、醫(yī)藥、飼料、環(huán)保等眾多領域都有廣泛的應用[1]，可作為食品添加劑以防止?jié)饪s乳制品結晶等。目前，植物和動物來源的乳糖酶生產(chǎn)工藝復雜、商業(yè)成本高；而微生物來源的酶產(chǎn)量高、周期短、生產(chǎn)成本低，廣泛應用的微生物主要是酵母菌和霉菌[2]。但霉菌來源的乳糖酶利用范圍比較窄，而酵母菌生產(chǎn)的β-半乳糖苷酶在牛奶、甜乳清和中性pH乳制品等中一直被廣泛應用。

由于許多兒童和成人體內(nèi)缺乏能夠分解乳糖的乳糖酶，飲用牛乳后常常會引起消化不良，嚴重者會引起腹瀉、嘔吐等不適癥狀，乳糖酶的應用能很好地解決這一問題。因此，如何篩選得到酶學性質(zhì)更為優(yōu)良的菌株尤為重要。微生物中酶的產(chǎn)量主要受發(fā)酵的物理參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基組成碳源和氮源的影響較大。利用響應面(response surface methodology，RSM)試驗設計可以更好地優(yōu)化和確定β-半乳糖苷酶生產(chǎn)過程變量之間的相互作用[3-4]。除篩選影響發(fā)酵乳桿菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的營養(yǎng)因子外，許多作者研究了β-半乳糖苷酶生產(chǎn)中pH、攪拌速度、底物濃度、溫度和發(fā)酵時間等因素的作用[5]。因此，本研究根據(jù)水解酶活的高低從奶酪中篩選出一株高產(chǎn)乳糖酶的菌株，采用響應面分析的方法對該菌株的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，旨在快速高效地增強菌株的產(chǎn)酶能力，為酶學特性的進一步研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

奶酪：采自新疆哈薩克族牧民家，由石河子大學食品學院實驗室保存；5-溴-4-氯-3-吲哚基吡喃半乳糖苷(X-Gal)：購自Takara公司；鄰硝基苯酚(ONP)和鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)：購自上海浩弘化工有限公司；國內(nèi)乳糖、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、NaCl、MnSO4、MgSO4、NaH2PO4、Na2HPO4等：由實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

YPD篩選培養(yǎng)基(g/L)：乳糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，X-Gal 0.002，pH為7.0，固體培養(yǎng)基加瓊脂20。

YPD斜面培養(yǎng)基(g/L)：乳糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，瓊脂20，pH為7.0。

YPD種子液發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：乳糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，CaCl20.1，MnSO40.001，MgSO40.3，KH2PO40.05，pH 7.0。

1.3 儀器與設備

DY000500酶標儀 蘇州藥明康德新藥開發(fā)有限公司；JY92-IIN細胞破碎儀 上海比朗儀器制造有限公司；YXQ-LS-SⅡ滅菌鍋 濟南思卓醫(yī)療器械有限公司；THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學儀器有限公司；TGL-16G離心機 上海安亭科學儀器廠；5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf儀器公司；TC-512 PCR擴增儀 英國Techne公司；PowerPac Universal電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；CX21FS1光學顯微鏡 Olympus公司。

1.4 產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的分離篩選及純化

1.4.1 菌株的篩選和純化[6]

1.4.1.1 富集培養(yǎng)

將奶酪樣品配制成15%懸浮液，將5%懸浮液接種到YPD篩選培養(yǎng)基中，加入適量的玻璃珠。在30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下孵育24 h。

1.4.1.2 篩菌

將獲得的細菌液稀釋至不同的濃度，在10-3～10-5的稀釋度中，將0.05 mL懸浮液涂布于YPD固體培養(yǎng)基，并在30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。

1.4.1.3 純化

挑取單菌落在YPD平板上劃線以分離和純化菌株，并多次劃線純化以得到菌落形態(tài)大小、色澤一致的菌株進行斜面保藏。

1.4.1.4 藍白斑篩選

純化后挑取單菌落接種到含有20 mg/mL X-Gal的固體YPD培養(yǎng)基平板中，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將產(chǎn)生藍斑的菌株進行甘油管保藏。

1.5 高產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的篩選及鑒定

1.5.1 粗酶液的制備

根據(jù)宋園亮等[7]測定乳糖酶的方法，將新鮮的種子液按3%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h后，于4 ℃、8000 r/min下離心10 min，收集上清液即為胞外粗酶液；收集濕菌體，再用50 mmol/L、pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液制成菌體懸浮液，然后利用超聲細胞粉碎儀進行破壁，超聲破碎條件：破碎效率75%，溫度4 ℃，破碎時間5 min，破碎6 s間歇3 s。破碎后的菌懸液經(jīng)4 ℃、8000 r/min冷凍離心后收集上清液，即為胞內(nèi)β-半乳糖苷酶粗酶液，保存在4 ℃冰箱中備用。

1.5.2 酶活測定

將粗酶液置于37 ℃的水浴鍋中溫育10 min后取50 μL于酶標板中，每個樣取3次求平均值。加入經(jīng)37 ℃預熱的20 mmol/L的ONPG 50 μL，并于37 ℃下反應10 min，最后吸取200 μL 0.5 mol/L的Na2CO3終止反應，于420 nm下測吸光度值。挑選出酶活最高的一株做后續(xù)優(yōu)化試驗。

酶活定義：每毫升粗酶液在每分鐘內(nèi)催化底物ONPG生成1 μmol ONP所需的酶量為1個酶活單位(U)，酶活計算公式：

式中：M為在試驗條件下1 μmol/mL ONP的吸光度值；V1為反應混合液總體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；t為反應時間(min)；V2為酶液體積(mL)。

1.5.3 標準曲線的制作

取139.0 mg的ONP放入燒杯中，加入10 mL 95%乙醇溶解，最后采用pH為7.0的PBS緩沖液于1000 mL的容量瓶中定容并顛倒混勻。

分別吸取定容好的溶液 2，4，6，8，10，12，14 mL于100 mL容量瓶中，用1%碳酸氫鈉定容混勻，以PBS緩沖液為空白，于420 nm波長處測吸光度，得到ONP濃度曲線[8]。

1.5.4 26S rDNA PCR鑒定

菌體DNA的提取采用天根真菌DNA 提取試劑盒，根據(jù)試劑盒提供藥品以及說明書步驟進行DNA的提取。

引物：ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)；

ITS2(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。

反應體系(25 μL)：DNA模板2 μL，上、下游引物(25 μmol/L)各0.5 μL，2×Taq DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。

PCR反應條件：預變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，3 min，共循環(huán)30次；最后延伸72 ℃，10 min。結束后，將產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，觀察結果后測序[9]。

將符合標準的26S rDNA擴增產(chǎn)物進行測序。測序結果用NCBI(National Center for Biotechnology Information)Blast進行同源序列比對，根據(jù)結果，用Claustal X1.83軟件對下載的相似性為99%以上菌種的26S rDNA序列和測序菌株的序列進行多序列比對，結果采用Mega 6.0軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining)進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，并對進化樹采用Bootstrap進行1000次置信度分析[10]。

1.6 單因素試驗

1.6.1 溫度

將4 ℃保存的粗酶液分別置于27，37，45，55，65，75，85 ℃下溫育10 min后于420 nm下測吸光度值[11]。每個試驗組設3次重復，以平均值做統(tǒng)計分析。

1.6.2 pH

將粗酶液用pH為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0的PBS緩沖溶液制成懸浮液，破壁離心后測定其酶活。

1.6.3 破壁時間

將PBS制成的懸浮液分別進行破壁，破壁時間為2，5，8，11，14，17，20 min，之后測定其在420 nm波長下的吸光度值。

1.6.4 乳糖濃度

分別在培養(yǎng)基中加入0，5，10，15，20，25，30 g/L的乳糖進行搖床培養(yǎng)，破壁后測定其酶活，每組數(shù)據(jù)取3次平行。

1.6.5 金屬離子

分別在培養(yǎng)基中加入0.01 mol/L的Na+、K+、NH4+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+于30 ℃，200 r/min下?lián)u床培養(yǎng)24 h后測定其酶活，然后將促生長因子的濃度調(diào)為0.001，0.002，0.003 g/L。

1.6.6 接種量

以1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的接種量將種子液接入液體搖瓶培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)后測定其吸光度值。

1.7 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.7.1 Plackett-Burman試驗設計篩選顯著因素

在單因素試驗的基礎上采用Plackett-Burman設計方法，對影響產(chǎn)酶的6個因素進行考察，即乳糖濃度、細胞破碎時間、初始pH值、破壁時間、溫度和金屬離子。每個因素采用高、低2個水平，分別記為1，-1，以乳糖酶相對活性為響應值，設定3個平行試驗，各因素試驗設計見表1。

1.7.2 最陡爬坡試驗

在對Plackett-Burman設計結果分析的基礎上，以效應值的正負為爬坡方向，以效應值的大小確定變化步長，逼近最大響應區(qū)域[12]。其他因素的取值由各因素效應值的正負和大小決定，正效應的因素取高水平值，負效應的因素取低水平值。

1.7.3 響應面(RSM)分析

通過Plackett-Burman試驗及最陡爬坡試驗確定響應面分析的這幾個因素及其中心點[13]，然后采用Box-Behnken中心組合設計三因素三水平的試驗，優(yōu)化該菌株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的條件，并在最佳的產(chǎn)酶條件下進行3次平行試驗，證實響應面的可靠性。

1.7.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design Expert 8進行響應面分析，Plackett-Burman試驗設計因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素水平Table 1 The factors and levels of Plackett-Burman test design

2 結果與分析

2.1 藍白斑篩選

將奶酪樣品稀釋通過涂布挑菌純化后，在篩選純化所得到的菌株中，通過添加X-Gal進行藍白斑篩選得到9株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株，見圖1 。

圖1 藍白斑初篩結果Fig.1 The blue-white preliminary screening results

由圖1可知，具有產(chǎn)乳糖酶的菌株會呈現(xiàn)藍色，產(chǎn)酶的能力不同，呈現(xiàn)的顏色深淺不一樣，其中y-2的藍斑顏色最深，說明其產(chǎn)乳糖酶的能力可能很高，而菌株y-4、y-7、y-8產(chǎn)乳糖酶的能力較低。

2.2 水解酶活測定及菌種鑒定

通過測定9株菌株中產(chǎn)乳糖的能力，得到胞內(nèi)和胞外的水解酶活，見圖2。

圖2 胞內(nèi)和胞外酶活Fig.2 The intracellular and extracellular enzyme activities

由圖2可知，y-8和y-9的胞內(nèi)酶活和胞外酶活相差不大，其他幾株菌的胞內(nèi)酶活都在250 U/mL 以上，且都顯著比胞外酶活高，說明β-半乳糖苷酶主要以胞內(nèi)酶的形式存在于菌株內(nèi)。胞內(nèi)酶活中y-2的酶活最高，達到了382 U/mL其次是y-1，為362 U/mL，y-8和y-9的酶活最低，分別為78，82 U/mL；胞外酶活中y-6的酶活最高，為106 U/mL，y-8的酶活最低，為72 U/mL。

26S rDNA序列擴增的片段長度為750 bp，PCR擴增結果見圖3中A。在GenBank上進行Blast比對，從GenBank中得到序列相近的參比菌株，采用臨近法以Mega 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3中B。

圖3 PCR擴增結果(A)及其系統(tǒng)發(fā)育樹的構建(B)Fig.3 The PCR amplification results (A) and construction of its phylogenetic tree(B)

由圖3中B可知，y-1、y-4、y-5、y-6、y-7與乳酸克魯維酵母的親源性較高，y-2、y-3屬于馬克斯克魯維酵母，y-8、y-9是庫德里阿茲威氏畢赤酵母。

2.3 單因素試驗

根據(jù)水解酶活的高低挑選出菌株y-2做單因素試驗，由圖4可知，通過將粗酶液在不同溫度下溫育后測定相對酶活發(fā)現(xiàn)，37 ℃的相對酶活最高，表明β-半乳糖苷酶的最適溫度為37 ℃，隨著溫度的升高，酶活逐漸下降，這是由于高溫破壞了酶的分子結構，導致酶發(fā)生了變性，所以活性降低[14]。β-半乳糖苷酶的最適pH為7，表明β-半乳糖苷酶是一種中性酶。

圖4 不同溫度和pH下的相對酶活Fig.4 The relative enzyme activities at different temperatures and pH values

由圖5可知，破壁時間為5 min時的酶活最高，但隨著破壁時間的延長，酶活越低，這可能是酶在破壁過程中喪失；與空白對照相比，金屬離子Na+、K+、NH4+是促生長因子，而其他的金屬離子與空白相比反而抑制了菌的生長。

圖5 不同破壁時間和金屬離子下的相對酶活Fig.5 The relative enzyme activities at different wall breaking time and metal ions

由圖6可知，乳糖濃度為10 g/L時的相對酶活最高；接種量較大導致大量菌體繁殖，迅速消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，不利于菌株產(chǎn)酶[15]。由此，可以初步確定菌株產(chǎn)酶的最適接種量為4%。

圖6 不同乳糖濃度和接種量下的相對酶活Fig.6 The relative enzyme activities at different lactose concentration and inoculation amount

由圖7可知，Na+的濃度為0.001 g/L時的相對酶活最高，這是因為金屬離子的濃度增高反而會對菌的生長產(chǎn)生副作用，從而抑制乳糖酶的相對含量。

圖7 Na+的濃度對酶活的影響(A)及ONP標準曲線(B)Fig.7 The effect of Na+ concentration on enzyme activity (A) and the standard curve of ONP(B)

2.4 Plackett-Burman 設計篩選結果

在6個單因素試驗的基礎上，采用 Plackett-Burman設計創(chuàng)建試驗次數(shù)N=12的試驗，對6個因素進行考察。每個因素取高水平和低水平2個水平，以乳糖酶相對活力為響應值，試驗設計及結果見表2。

表2 Plackett-Burman(PB)試驗設計與響應值結果Table 2 Plackett-Burman (PB) test design and response value results

續(xù) 表

由表3可知，Prob>T值(P值) 的大小表明各個考察因素的顯著水平，當Prob>T值<0.05 時表明各因素有顯著影響。6個因素中pH、溫度、乳糖濃度對產(chǎn)酶的影響極顯著，顯著性比較：pH>溫度>乳糖濃度。后續(xù)的試驗中其他3個因素均選取最優(yōu)值進行。

表3 Plackett-Burman試驗設計的各因素水平及顯著性分析Table 3 The analysis of the factors and significance of each factor in Plackett-Burman test design

2.5 最陡爬坡試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，以SPSS軟件對P-B設計方法的試驗數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計分析，結果發(fā)現(xiàn)各因素中影響顯著性的因素是pH、溫度、乳糖濃度。因此，pH、溫度、乳糖濃度對乳糖酶酶活存在著較顯著的影響，確定其為下一步試驗設計的關鍵因素。根據(jù)篩選出3個主要影響因素的效應和大小比例，設定最陡爬坡試驗的變化方向和步長，試驗設計及結果見表4。

表4 最陡爬坡試驗設計及其結果Table 4 The steepest climbing test design and the results

2.6 響應面設計及結果分析

2.6.1 Box-Behnken中心組合試驗設計

響應面設計及回歸模型的建立在Plackett-Burman試驗設計及最陡爬坡試驗的基礎上確定了幾個主要影響因素及響應面試驗的中心點，采用Box-Behnken中心組合設計對pH、溫度、乳糖濃度進行三因素三水平的響應面分析試驗，試驗設計與結果見表5和表6，該響應面試驗共有15個試驗點，其中1～12為分析點，13～15為零點，每個重復3次以評估試驗的誤差。

表5 Box-Behnken試驗設計的因素與水平Table 5 The factors and levels of Box-Behnken test design

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 The Box-Behnken test design and results

2.6.2 響應面設計及回歸模型

運用Design Expert 8軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，以乳糖酶相對酶活(Y)為因變量，pH (X1)、溫度(X2)和乳糖濃度(X3)為自變量建立回歸方程：

Y = 96.17-0.11X1-0.4X2-0.74X3+4.32X1X2+0.79X1X3-1.60X2X3-7.97X12-4.78 X22-2.10 X32。

對該方程進行回歸系數(shù)顯著性檢驗和方差分析，見表7和表8。

表7 回歸系數(shù)顯著性檢驗Table 7 The significance test of the quadratic model's regression coefficients

續(xù) 表

表8 回歸方程的方差分析Table 8 The variance analysis of regression equation

由表7可知，一次項中3個因素對酶活力的影響排序為：溫度>pH>乳糖濃度，且Prob>T表明對Y值的影響顯著；二次項中X1，X2顯著，X3不顯著；交互項中X1X2對酶活力顯著，X1X3、X2X3對酶活力不顯著。說明單因素、各單因素平方對酶活影響較大，各因素間的交互作用影響較小。回歸系數(shù)R2=93.25%>91.62%，表明該模型摸擬不同因素對菌株y-2產(chǎn)β-半乳糖苷酶酶活的影響效果較好，試驗過程設計合理，該模型成立。

由表8可知，失擬項數(shù)值為0.361，遠大于0.05，說明失擬不顯著，該模型穩(wěn)定，可以作為不同因素水平對酶活影響的預測。

2.6.3 響應面分析

利用軟件對數(shù)據(jù)進行擬合，得到響應面及等高線圖，見圖8～圖10。

圖8 溫度與pH對β-半乳糖苷酶相對酶活的等高線圖和響應面立體分析圖Fig.8 The contour and response surface analysis diagrams of interaction effect of temperature and pH on the relative activity of β-galactosidase

圖9 溫度與乳糖濃度對β-半乳糖苷酶相對酶活的等高線圖和響應面立體分析圖Fig.9 The contour and response surface analysis diagrams of interaction effect of temperature and lactose concentration on the relative activity of β-galactosidase

圖10 pH與乳糖濃度對β-半乳糖苷酶相對酶活的等高線圖和響應面立體分析圖Fig.10 The contour and response surface analysis diagrams of interaction effect of pH and lactose concentration on the relative activity of β-galactosidase

由圖8～圖10可直觀地看出各因子對響應值的影響變化趨勢，并且模型確實存在最大值。從等值線圖可以看出存在極值的條件應該在圓心處。等高線的形狀可以反映交互效應的大小，橢圓形表示兩個因素的交互作用顯著，圓形表示兩個因素的交互作用不顯著。pH和溫度、pH和乳糖濃度對酶活的交互作用顯著；溫度和乳糖濃度對酶活的交互作用顯著性不明顯。

3 結論

通過對新疆哈薩克族奶酪中的菌株進行篩選和純化，然后添加顯色劑最終篩選得到9株產(chǎn)乳糖酶的菌株，經(jīng)過水解酶活測定和菌種鑒定，得到一株高產(chǎn)乳糖酶的菌株y-2，鑒定為馬克斯克魯維酵母，根據(jù)溫度、pH、破壁時間、乳糖濃度、金屬離子和接種量這6個單因素試驗設計結果，利用Plackett-Burman試驗設計和最陡爬坡試驗結果發(fā)現(xiàn)顯著性的因素是pH、溫度、乳糖濃度，最后通過響應面分析得出pH和溫度、pH和乳糖濃度對酶活的交互作用顯著；溫度和乳糖濃度對酶活的交互作用顯著性不明顯。