兩種天然防腐劑對單增李斯特菌抑菌性的研究

張鑫，李迎秋

(齊魯工業大學(山東省科學院) 食品科學與工程學院，濟南 250353)

天然防腐劑和化學防腐劑是兩類食品防腐劑[1]。化學防腐劑能有效地控制食品致病菌的生長繁殖，目前已經廣泛應用于食品工業中，但是化學防腐劑存在的潛在毒性不能忽視，而天然防腐劑具有安全無毒、熱穩定性高等優點[2]。因此，研究和開發天然防腐劑成為近年來的熱點和難點。

大豆球蛋白堿性多肽(GBP)是從豆粕中提取分離得到的具有抑菌性的陽離子多肽[3]。GBP對于牛奶中的腸炎沙門氏菌、單細胞李斯特菌等致病菌有顯著的抑菌效果，可延長牛奶的保質期[4]。Li等研究了GBP對在4 ℃條件下冷藏豬肉的保鮮效果，結果表明0.16%和0.20%的GBP顯著地抑制了細菌的生長繁殖，延長冷藏豬肉的保質期長達6 d[5]。乳酸鏈球菌素(Nisin)是從微生物中提取的一種天然抗菌肽，由34個氨基酸組成。對于李斯特菌等革蘭氏陽性菌有良好的抑菌效果[6]，被人體消化道酶降解成氨基酸，對人體安全無毒。大多研究表明，它能有效抑制引起食品腐敗的大范圍的革蘭氏陽性細菌(尤其是親緣性較近的細菌)[7]，如乳桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、李斯特氏菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等，尤其對產生芽孢的革蘭氏陽性細菌有特效，而對革蘭氏陰性菌作用不大，對酵母菌和霉菌沒有作用[8]。

此外，乳酸鏈球菌素對梭狀芽孢桿菌的抑制作用顯著，可應用于肉制品工業中。Mangalassary等研究了巴氏殺菌低脂火雞臘腸過程中使用乳酸鏈球菌素對單細胞增生李斯特菌失活時間的影響，結果顯示乳酸鏈球菌素有效縮短了目標菌失活所需的時間[9]。目前認為抗菌肽的抑菌機理有兩種：一是抗菌肽通過靜電相互作用與細胞膜結合導致其結構破壞[10]；二是抗菌肽不僅破壞細胞膜，而且能破壞細菌細胞內的核酸和蛋白質大分子物質從而影響細胞生理活動[11]。

李斯特菌能感染肉類、蛋類、海產品、乳制品等絕大多數食品。由于大量的抑菌劑在食品生產過程中廣泛使用，造成李斯特菌的抗性增強，使得在食品生產過程中如何抑制李斯特菌的生長成為一個難題。食品企業科學、合理、適量地添加化學防腐劑并不會對人體產生危害，然而超標、超量、超范圍添加則很容易造成食品安全隱患。而GBP與Nisin兩種天然防腐劑安全性能高，功能價值高，抑菌性好。通過比較GBP與Nisin抗李斯特菌特性，可以更好地選擇更加優良的抗菌劑應用到食品防腐工業中。

1 材料與試劑

1.1 實驗材料

大豆球蛋白堿性亞基(GBP)、乳酸鏈球菌素(Nisin)：購自實驗室；李斯特菌(Listeriamonocytogenes)：從齊魯工業大學菌種保藏中心獲得；其余試劑均為分析純。

1.2 菌種及培養基

李斯特菌ATCC19115：齊魯工業大學菌種保藏中心；腦心浸液肉湯培養基(培養李斯特菌)。

1.3 培養基及溶液的配制

將單增李斯特菌接種于腦心浸液肉湯瓊脂斜面，37 ℃培養24 h，挑取單菌落，接種于已滅菌的腦心浸液肉湯液體培養基中，在37 ℃，150 r/min條件下搖床培養10 h左右，菌懸液濃度達到107CFU/mL，生長達到穩定期，實驗備用。

滅菌生理鹽水：配制一定濃度的生理鹽水滅菌備用。

2 實驗方法

2.1 最小抑菌濃度(MIC)的測定

GBP和Nisin對李斯特菌的抗菌活性可通過稀釋法進行測定[12]。李斯特菌培養至菌液濃度約為107CFU/mL，將不同濃度的GBP和Nisin分別加入到菌懸液中，GBP和Nisin終濃度分別為25，50，100，200，300，350，400，450 μg/mL，以菌懸液作為陽性對照，液體培養作為陰性對照，在37 ℃振蕩培養24 h，通過測定各組樣品在OD600 nm處的吸光度來比較GBP和Nisin的抑菌特性，每組平行做3次。

2.2 李斯特菌細胞內RNA及蛋白類泄露的測定

李斯特菌培養至對數末期，將100 mL菌液平均分裝在4個離心管里，在6000 r/min條件下離心20 min，無菌生理鹽水洗滌2次并放入3 mL的生理鹽水，將不同濃度的GBP和Nisin分散液加入到菌懸液中，GBP終濃度為0，200，400 μg/mL，Nisin終濃度為0，400，800 μg/mL，在恒溫搖床培養箱中37 ℃，150 r/min條件下培養，分別在培養0.5，1，1.5，2，3，4 h后取出3 mL菌液，在6000 r/min條件下離心5 min，保留上清液冷凍保藏。用紫外可見分光光度計分別在260，280 nm處檢測其上清液的吸光度[13]，并繪制相應曲線。

2.3 李斯特菌細胞內還原糖泄露的測定

將李斯特菌培養至菌液濃度約為107CFU/mL，以10 mL菌液量進行分組，在6000 r/min離心20 min收集李斯特菌菌體，用滅菌生理鹽水洗滌細胞2次。并加入到9 mL滅菌生理鹽水后，將不同濃度的GBP和Nisin分散液加入到菌懸液中，GBP終濃度分別為0，200，400 μg/mL，Nisin終濃度分別為0，400，800 μg/mL，分別在培養0.5，1，1.5，2，3，4 h后取出3 mL菌液，在6000 r/min條件下離心5 min，保留上清液冷凍保藏。用還原糖測定儀分別測定樣液中還原糖的含量。

3 結果與討論

3.1 最小抑菌濃度(MIC)的測定

GBP和Nisin對單增李斯特菌的最小抑菌濃度見表1。

表1 GBP和Nisin對單增李斯特菌的最小抑菌濃度測定Table 1 The MIC of GBP and Nisin against Listeria monocytogenes

由表1可知，GBP濃度為100 μg/mL時，無菌生長；在Nisin濃度達到400 μg/mL時，無菌生長，說明GBP和Nisin對李斯特菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為100，400 μg/mL。GBP和Nisin對李斯特菌都具有良好的抑菌效果，但GBP對李斯特菌的抑制效果明顯強于Nisin對李斯特菌的抑制效果。

3.2 李斯特菌細胞內RNA及蛋白類泄露的測定

經兩種抗菌肽處理對李斯特菌RNA泄露的影響見圖1和圖2；經兩種抗菌肽處理對蛋白質泄露的影響見圖3和圖4。

圖1 GBP對李斯特菌RNA泄露的影響Fig.1 The effect of GBP on RNA leakage of Listeria monocytogenes

圖2 Nisin對李斯特菌RNA泄露的影響Fig.2 The effect of Nisin on RNA leakage of Listeria monocytogenes

圖3 GBP對李斯特菌蛋白泄露的影響Fig.3 The effect of GBP on protein leakage of Listeria monocytogenes

圖4 Nisin對李斯特菌蛋白泄露的影響Fig.4 The effect of Nisin on protein leakage of Listeria monocytogenes

李斯特菌細胞內的核糖體是由RNA和蛋白質共價合成，RNA和蛋白質對細胞的生命活動有著不可缺少的重要作用。蛋白質是細胞重要的結構組成成分，而核糖體具有合成蛋白質的功能，所以RNA和蛋白質這兩種物質對李斯特菌細胞的生命活動起著重要的作用。測定RNA和蛋白質成分的最大吸光值分別在OD260 nm處和OD280 nm處，因此，可以通過紫外分光光度計在這兩個波長下測定細胞外是否出現RNA和蛋白質成分[14]。

由圖4可知經不同濃度GBP和Nisin處理的李斯特菌的RNA及蛋白質成分溶出情況。同一時間，OD值分別隨著兩種抗菌肽濃度的升高而增大，表明抗菌肽濃度越高，RNA與蛋白質泄露也在增多；同一濃度下，隨著時間的累積，吸光值也不斷增大，說明RNA與蛋白質不斷從細胞膜內流出。

由圖1～圖4可知，同一時間，在抗菌肽濃度為400 μg/mL時，經Nisin處理的樣液的OD值要高于GBP處理的OD值，樣液的RNA及蛋白質成分流出量更多。由此得出GBP與Nisin兩種抗菌肽使李斯特菌的RNA及蛋白質泄露的膜作用方式不同。初步推斷，GBP作用于細菌的細胞膜上，干擾細胞正常生理活動，從而抑制菌體生長；而Nisin通過破壞李斯特菌的細胞膜結構，使其通透性增大，從而導致RNA及蛋白質成分從膜內流出，造成菌體的死亡，抑制李斯特菌的生長。

3.3 李斯特菌細胞內還原糖泄露的測定

GBP和Nisin對李斯特菌還原糖含量的影響分別見圖5和圖6。

圖5 GBP對李斯特菌還原糖含量的影響Fig.5 The effect of GBP on reducing sugar content of Listeria monocytogenes

圖6 Nisin對李斯特菌還原糖含量的影響Fig.6 The effect of Nisin on reducing sugar content of Listeria monocytogenes

當在OD260 nm和OD280 nm下測定細菌的吸光度時，由于細菌表面物質的自然泄露，無論是否加入抗菌肽，都會導致吸光值變大。可以通過測定李斯特菌細胞內還原糖的泄露量來反映GBP與Nisin對李斯特菌細胞膜的破壞作用。

由圖5和圖6可知，與對照組細菌細胞菌懸液中還原糖相比，經兩種抗菌劑處理的樣本中還原糖含量明顯上升。在3 h之內，隨著GBP與Nisin抗菌肽的濃度增大，還原糖含量也分別迅速上升。在抗菌劑濃度為400 μg/mL時，經Nisin處理的菌懸液測定的還原糖含量(見圖6)要高于經GBP處理的還原糖含量(見圖5)。

4 結論

實驗結果表明，GBP與Nisin兩種抗菌劑都能夠有效抑制李斯特菌的生長，GBP和Nisin抑制李斯特菌生長的最小抑菌濃度分別是100，400 μg/mL，GBP的抑菌效果要強于Nisin。兩種天然抗菌肽都能造成其細胞膜結構的損傷，并損傷胞內蛋白及RNA遺傳物質等成分。此實驗只是對李斯特菌的抑菌機制機理做了初步的研究比較，更深層次的抑制機理的研究有待探索，例如對蛋白質和堿性磷酸酶合成的影響，對細胞膜造成的破壞等。