草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌機理研究

唐志凌，趙明明，陳靖潼，高璐瑤，陳文學，李遠頌

(1.海南大學 食品科學與工程學院，海口 570228；2.海南大學 研究生處，海口 570228)

草果(Amomumtsao-ko)為姜科豆蔻屬多年生草本植物，主產于我國的云南、廣西、貴州等地[1]。草果具有特殊辛香味，并能去除腥味，現今多將草果用于烹調肉類食品，是日常生活中必備的調味香料，被人們譽為食品調味中的“五香之一”[2]。研究表明，在草果中檢測出痕量硒，適當補硒有益人體健康，因此經常食用草果對人體有一定的營養保健功效[3]。同時草果也是我國一種傳統的中藥材，可改善瘧疾、咳嗽、積食等癥狀[4]。草果揮發油有較好的抗氧化性，對于清除羥自由基和超氧陰離子自由基有著十分顯著的效果[5-6]。此外，草果提取物還具有抑菌效果，Cui Qi等[7]研究表明草果提取物具有較強的廣譜抗菌活性；謝小梅等[8]通過對草果揮發油的深入研究發現其對產黃青霉、黑曲霉等真菌具有良好的殺菌效果。

由于微生物活動和氧化等作用，肉制品很容易腐敗變質。目前，為了防止肉制品的腐敗變質，保持其新鮮度，常常在其中添加化學防腐劑，但長時間研究表明，有些化學防腐劑具有誘癌性、致畸性、低毒性以及某些潛在的危害[9]。天然防腐劑因安全、高效等優點在食品行業受到廣泛關注。從植物中提取有效成分抑菌防腐已成為研究的熱點，而香辛料是其主要來源之一。食源大腸桿菌(Escherichiacoli)與沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)是食品安全領域中最常見的致病菌[10]，草果多用于肉制品的調味。本研究在對草果抑菌物質提取工藝進行優化并初步探討其抑菌活性的基礎上[11]，進一步探索草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌機理，為草果提取物應用于肉制品的防腐保鮮提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)：海南大學食品科學與工程學院提供；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、丙酮：廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

AR124N型電子天平；SPX-288智能型生化培養箱；XB-HP型中藥粉碎機；SHA-2型水浴全溫振蕩器；GGT7型旋轉蒸發儀；GI54DS型高壓滅菌鍋；SW-CJ-1FD 型無菌超凈工作臺；Christ Alphal型細胞冷凍干燥機；S-3000型掃描式電子顯微鏡；TU1810 型紫外可見分光光度計；CR22N型落地式高速冷凍離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 草果抑菌活性物質的提取

草果的產地和提取方法使得提取物的成分組成產生差異[12]。本實驗參考彭美芳等[13]的提取方法，將草果粉浸泡、超聲后得到草果粗提物，然后采用乙酸乙酯萃取法，得到抑菌效果最佳的草果乙酸乙酯萃取物。

1.3.2 菌種活化

將大腸桿菌、沙門氏菌在培養基中傳代活化后，培養18～24 h，采用麥氏比濁法調整菌液濃度為106～107CFU/mL待用[14]。

1.3.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定

采用肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度。抑制液的配制采用二倍梯度稀釋法[15]，制成終濃度分別為20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125 mg/mL的含藥培養基。將供試菌接種至含藥培養基上，同時設置空白組。倒置培養24 h后，觀察。以完全不長菌的最小稀釋濃度確定為草果萃取物對大腸桿菌、沙門氏菌作用的MIC。參考潘旭遲等[16]的方法，繼續培養24 h后，以完全不長菌的最小稀釋濃度確定為草果萃取物對大腸桿菌、沙門氏菌作用的MBC。

1.3.4 生長曲線的測定

采用紫外分光光度法測定大腸桿菌和沙門氏菌的生長曲線[17]。將供試菌接種至液體培養基中，加入抑菌物質，調至各自最小抑菌濃度，同時設置空白組和陰性對照組。恒溫培養24 h，每2 h取樣，測定樣品在600 nm下的OD值。以時間和OD值為橫、縱坐標繪制對應的生長曲線。

1.3.5 細胞形態的觀察

采用掃描電鏡法觀察兩種細胞微觀形態的變化。在培養至各自對數期的菌懸液中加入終濃度為1×MIC的草果提取物, 并設置空白組和陰性對照組。放置于最適溫度，在180 r/min搖床中培養, 分別取培養至4，8 h的菌懸液, 低溫離心10 min后，各自收集菌體。再依次使用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.2)和乙醇溶液梯度洗脫3次。最后通過細胞凍干機低溫凍干后取樣鍍金, 在電子顯微鏡上放大8000倍觀察細胞微觀形態。

1.3.6 堿性磷酸酶(AKP)的測定

將供試菌分別接種至液體培養基中，加入草果提取物，調至各自最小抑菌濃度，同時設置空白組和陰性對照組。在水浴振蕩器培養8 h，每隔2 h取樣，按照AKP試劑盒的要求測定不同樣品在520 nm波長下的OD值，并計算出對應的AKP活力。

2 結果與分析

2.1 草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC和MBC

由表1可知，草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌均有較好的抑菌效果，且抑菌效果隨草果提取物濃度的上升而增強。當草果提取物濃度為0.625 mg/mL時，大腸桿菌難以生長；當草果提取物濃度為1.25 mg/mL時，沙門氏菌無法生長，表明草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為0.625，1.25 mg/mL，且丙酮對大腸桿菌和沙門氏菌的生長在此次實驗條件下影響較小。另外，草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌的最小殺菌濃度分別為0.625，1.25 mg/mL，與其各自最小抑菌濃度相同。說明草果提取物對細菌的抑制作用較為明顯，且這種抑制作用在短時間內可以保持穩定。

表1 大腸桿菌和沙門氏菌的生長情況Table 1 The growth situations of Escherichia coli and Salmonella typhimurium

2.2 草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌生長的影響

草果提取物分別作用大腸桿菌和沙門氏菌24 h，研究其對細菌生長的影響，結果見圖1和圖2。

圖1 草果提取物對大腸桿菌生長的影響Fig.1 Effects of Amomum tsao-ko extracts on the growth of Escherichia coli

由圖1可知，添加水和丙酮組的細菌生長呈現出明顯的S形曲線，并OD值分別在14 h和24 h時達到1.287和1.118。丙酮組細菌生長較慢于空白組，但對于細菌最終生長結果并無顯著影響，因此可說明在本實驗中丙酮對于大腸桿菌的影響較小。添加終濃度為1×MIC草果提取物的實驗組，在4～16 h內生長較為緩慢，OD值無明顯上升；在16～24 h期間OD值略有上浮，但幅度較小，隨后趨向平穩狀態，最終OD值僅達到0.408，并顯著低于對照組。實驗結果表明，加入終濃度為1×MIC的草果提取物能夠有效抑制大腸桿菌的生長。

由圖2可知，添加水和丙酮組的沙門氏菌生長狀態同大腸桿菌相似，說明在本實驗中丙酮對沙門氏菌的影響較小。相比于大腸桿菌，沙門氏菌添加終濃度為1×MIC草果提取物的實驗組在數值上較高，在6～18 h內生長較為緩慢；在18～24 h期間OD值略有上升，達到0.686。實驗結果說明，終濃度為1×MIC的草果提取物同樣對沙門氏菌的生長有著良好的抑制效果，但對大腸桿菌的抑菌效果更好。

圖2 草果提取物對沙門氏菌生長的影響Fig.2 Effects of Amomum tsao-ko extracts on the growth of Salmonella typhimurium

2.3 草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌細胞形態的影響

水、丙酮和草果提取物分別作用大腸桿菌、沙門氏菌4 h和8 h后，觀察電子顯微鏡下細胞形態的變化，掃描電鏡圖見圖3(大腸桿菌)和圖4(沙門氏菌)。

圖3 大腸桿菌的掃描電鏡圖(8000×)Fig.3 The scanning electron microscopy of Escherichia coli注：A1為空白組(4 h)；A2為空白組(8 h)；B1為丙酮組(4 h)；B2為丙酮組(8 h)；C1為實驗組(4 h)；C2為實驗組(8 h)。

圖4 沙門氏菌的掃描電鏡圖(8000×)Fig.4 The scanning electron microscopy of Salmonella typhimurium注：D1為空白組(4 h)；D2為空白組(8 h)；E1為丙酮組(4 h)；E2為丙酮組(8 h)；F1為實驗組(4 h)；F2為實驗組(8 h)。

由圖3和圖4可知，掃描電鏡下，空白組(A1、A2；D1、D2)的大腸桿菌和沙門氏菌細胞形態完整，菌體飽滿，表面較為光滑，細胞無明顯破損且無內容物外泄現象。丙酮組(B1、B2；E1、E2)的大腸桿菌和沙門氏菌培養4 h后，細菌形態完整，細胞邊界較為清晰；培養8 h后，大腸桿菌出現局部黏連，但多數細胞仍能保持完整形態，無明顯破損，表面光滑；而沙門氏菌經丙酮組處理8 h與處理4 h無顯著差異，細菌形態并未產生異常變化。實驗組(C1、C2)的大腸桿菌在草果提取物處理4 h后，細菌形態與空白組和丙酮組無顯著差異；而在處理8 h后，細菌細胞出現大面積黏連和破損，菌體收縮，表面粗糙，細胞邊界模糊，部分細胞呈現嚴重破裂，造成細胞內容物外泄，而較為黏稠的細胞內容物使得細胞的黏連和重疊現象嚴重。實驗組(F1、F2)的沙門氏菌在經草果提取物處理4 h后，細胞形態變化不明顯，絕大多數細胞仍呈現出完整且光滑的細菌表面；在處理8 h后，沙門氏菌與大腸桿菌表現相似，也出現菌體黏連和斷裂現象，細菌菌體呈現不同程度的扭曲，表面粗糙，細胞邊界不明顯。部分細菌破裂成塊狀，外泄的細胞內容物導致其與其他破裂的細菌黏合在一起，呈現大面積的細菌體堆疊。由大腸桿菌和沙門氏菌所得結果可知，1×MIC的草果提取物在處理大腸桿菌和沙門氏菌8 h后，能夠顯著破壞這兩種細菌細胞的正常形態，導致細胞受到破壞且使得細胞內容物外泄。

2.4 草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌AKP活力的影響

水、丙酮和草果提取物連續作用大腸桿菌8 h，檢測胞外AKP含量，結果見圖5。

圖5 大腸桿菌的胞外AKP含量Fig.5 The extracellular AKP content of Escherichia coli

AKP酶存在于細胞壁與細胞膜之間，正常情況下，當細菌的細胞壁完整未受到損傷時，AKP酶不會泄露到環境中去。因此，檢測細菌生長環境的AKP酶含量可以間接表明細胞壁是否受到損傷[18]。由圖5可知，空白組和丙酮組的胞外AKP酶含量隨著時間的推移增長緩慢。而添加了1×MIC草果提取物的大腸桿菌實驗組，其胞外AKP酶的含量隨時間的增長呈明顯上升趨勢，且在各時間點遠大于對照組的AKP含量。在6～8 h時，胞外AKP含量迅速增加，說明此時細胞壁已經受到了損傷，細胞壁的完整度被破壞。結合大腸桿菌掃描電鏡圖分析，草果提取物對大腸桿菌細胞壁通透性的改變主要從6～8 h開始。可能是大分子物質穿過細胞壁，使得細胞壁形成孔洞，最終演變成塌陷，細菌細胞逐漸萎縮[19]。

水、丙酮和草果提取物連續作用沙門氏菌8 h，檢測胞外AKP含量，結果見圖6。

圖6 沙門氏菌的胞外AKP含量Fig.6 The extracellular AKP content of Salmonella typhimurium

由圖6同樣可以明顯觀察到添加了草果提取物的實驗組在6～8 h內上升幅度最大。但與大腸桿菌整體呈現上升趨勢不同的是，沙門氏菌在實驗的前4 h內，無論是實驗組、空白組還是丙酮組，3組的胞外AKP酶含量基本保持不變。而從4 h開始，添加了草果提取物的實驗組，其胞外AKP酶含量開始顯著升高。說明終濃度為1×MIC的草果提取物對沙門氏菌細胞壁的破壞作用主要發生在4 h之后，且效果顯著。

3 結論與討論

本實驗從細胞層面上進行研究，初步探究了草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌兩種常見致病菌的抑菌機理。結果表明，草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌有較好的抑制作用，其最小抑菌濃度分別為0.625，1.25 mg/mL，且最小殺菌濃度也均為0.625，1.25 mg/mL。草果提取物能夠使大腸桿菌和沙門氏菌的細胞形態遭到破壞，細胞壁的通透性增加，從而抑制細菌的生長繁殖。

草果提取物既可加強肉制品的風味，又有顯著的抑菌效果，在未來開發天然防腐劑等方面具有巨大的潛力。本實驗已初步探索了草果提取物對大腸桿菌和沙門氏菌這兩種食品中常見致病菌的抑菌機理，表明草果提取物在食品加工防腐等方面應用價值較大。當前，對草果提取物抑菌機制的研究尚不充分，未來期望進一步探明草果提取物對不同致病菌的抑菌活性和抑菌機理，并擴大草果提取物在食品貯藏和加工領域的使用范圍。