固定化醋酸菌發酵載體對芒果醋品質影響

胡秦佳寶，王建芳，熊文霸，杜林，馬博

(百色學院 農業與食品工程學院，廣西 百色 533000)

芒果(MangiferaindicaL.)屬于呼吸躍變型果實，易腐且對低溫敏感，不易貯存。因此，開展芒果深層次加工，是芒果產業適應市場需求、提高經濟效益的重要任務。芒果風味獨特，營養豐富，富含大量果糖、蔗糖、葡萄糖、多酚、有機酸等物質[1]，非常適宜作為果醋釀造原料。果醋一般是以水果及水果下腳料為原料，以酵母菌、醋酸菌為菌種發酵得到的一種營養豐富、風味優良的酸性調味品及功能性飲料[2]。果醋中含有大量芳香酯類、維生素及氨基酸成分，不僅風味柔和怡人且具有調節腸道菌群、抗氧化、保護心腦血管等多種功效[3]。果醋的釀造工藝目前多采用游離細胞液態深層發酵法，發酵時間長達4～5周，且原料中多酚等物質在氧氣作用下會轉化成醌類物質，導致醋酸發酵過程中果醋色澤劣變，喪失原果風味，品質顯著降低。

固定化細胞技術是將微生物細胞高度密集地固定在所選載體上，使微生物能夠在適宜的條件下大量快速增殖并保持代謝和催化活性的生物技術[4]。固定化模擬了微生物在自然環境中生長時發生的封閉效應和聚集效應，有利于細胞的分隔[5]。將固定化技術應用于芒果醋發酵，提高了發酵效率，提升了產品品質，對于提升芒果產業附加值有重要的意義。

本試驗采用吸附固定化技術，選用甘蔗渣、玉米芯、刨花、花生殼及聚氨酯作為吸附固定化材料，并與海藻酸鈉包埋固定化進行對比，從理化和感官兩方面研究不同載體固定化作用下對芒果醋品質的影響。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

芒果(臺農一號)：市售；甘蔗渣、玉米芯、刨花、花生殼：市售并自行加工；L-抗壞血酸(食品級)、檸檬酸(食品級)：河南萬邦實業有限公司；酵母：安琪葡萄酒果酒專用酵母，安琪酵母股份有限公司；醋酸菌(巴氏醋桿菌巴氏亞種Acetobacterpasteurianussubsp.pasteurianus)：中國輕工業微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；LRH-250A生化培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司；LB50T糖度計 廣州銘睿電子科技有限公司；25×16型血球計數板 上海榮鵬信息科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

選用成熟度高、無病蟲害、無機械損傷的小臺農芒果。將芒果清洗后瀝干并去皮、去核，切小塊放入打漿機中破碎，在破碎時加入總體積0.1%的L-抗壞血酸。芒果漿平均總可溶性固形物(total soluble solid，TSS)含量為4.4%，pH為4.1，加入果漿總體積0.03%的果膠酶，蔗糖溶液將總可溶性固形物含量調至16%，檸檬酸調節果漿酸度至pH 3.8，75 ℃殺菌10 min[6]。

1.3.2 酒精發酵

稱取待發酵液總體積0.03%的安琪酵母菌加入5%白砂糖溶液中，37 ℃恒溫水浴活化30 min。用血球計數板計數并調整接種量為106CFU/mL。取3 L芒果漿于玻璃發酵罐中，接入10 mL活化酵母菌液于25 ℃恒溫培養箱中用紗布封口發酵培養，期間適當攪拌，至發酵液有酒精味產生，以帶單向閥的硅膠塞取代紗布繼續發酵；每24 h取樣測定酒精度和可溶性固形物含量。當酒精度或TSS基本保持穩定時，視作發酵完成；用120目篩過濾發酵液[7]。調整初始酒精度為7.5%(V/V)。

1.3.3 醋酸菌活化及制備菌懸液

將凍干醋酸菌粉連續3代活化培養后接入醋酸菌液體培養基中，以130～150 r/min的轉速，在30 ℃培養72 h后取20 mL菌液，以5000 r/min離心15 min，取沉淀并沖洗，于濕菌體中加入無菌生理鹽水，配制為含一定醋酸菌濃度的醋酸菌懸浮液并備用。

1.3.4 醋酸發酵

1.3.4.1 包埋固定化醋酸發酵

將醋酸菌懸液加入4%(W/V)的海藻酸鈉溶液，充分混勻。將其滴入4% CaCl2溶液中，20 ℃水浴1 h。傾去上清液，沖洗菌懸液并再次加入CaCl2溶液，于4 ℃靜置平衡12 h[8]。取30 mL醋酸菌懸液移入芒果酒中，于30 ℃，220 r/min搖床培養，發酵7 d(168 h)，每24 h完成一個批次的發酵，取出部分醋酸發酵液，重新加入芒果酒進行第二批次的醋酸發酵，共進行5個批次。

1.3.4.2 吸附固定化

甘蔗渣：將甘蔗剝皮，切小塊，通過壓榨水煮后，用70%的酒精浸泡(固液比1∶3，W/V)8 h，烘干并磨成顆粒狀。高壓滅菌并冷卻后裝PE袋待用[9]。

玉米芯、刨花、花生殼：洗凈、烘干并磨成顆粒狀。高壓滅菌并冷卻后裝PE袋待用[10]。

取載體材料(甘蔗渣、玉米芯、刨花、花生殼、聚氨酯)5 g，裝入100 mL去底座、底部打孔的塑料量筒的約1/3處，量筒下部裹紗布卡在500 mL錐形瓶瓶口作為發酵裝置，用滅菌水浸濕載體至其最大持水量，直到水開始從載體材料中滲出，以除去載體顏色。取30 mL醋酸菌懸液加入載體，在4 ℃下吸附培養12 h。將芒果酒勻速滴入到載體材料中，用6層紗布封口，溫度保持在(28±2) ℃。每24 h完成一個批次的發酵，取出部分醋酸發酵液，重新加入芒果酒進行第二批次的醋酸發酵，共進行5個批次。以游離分批發酵作為對照組。

1.3.5 理化指標測定方法

1.3.5.1 酒精度

參考GB/T 394.2-2008《酒精通用分析方法》。

1.3.5.2 總酸含量

參考GB/T 5009.41-2003《食醋衛生標準的分析方法》。

1.3.5.3 醋酸轉化率[11]

1.3.5.4 總酚含量

采用福林-酚法[12]。取0.5 mL樣品，加入1 mL質量比為10%的福林-酚顯色劑，放置6 min，加入2 mL質量比為7.5%的Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至 10 mL，于75 ℃避光放置10 min，并于765 nm波長下測定其吸光度。樣品總酚含量以每100 mL樣品中沒食子酸的當量(mg GAE/100 mL) 表示。

1.3.5.5 抗氧化能力

采用DPPH法[13]。

1.3.5.6 有機酸含量

采用HPLC法[14]。

1.3.5.7 感官評價

由10名感官評分員組成的感官評定小組對果醋按照表1的評分標準進行評價。

表1 固定化醋酸菌芒果番茄復合果醋感官評價表Table 1 The sensory evaluation of mango and tomato compound fruit vinegar with immobilized Acetobacter

2 結果與分析

2.1 不同載體固定化發酵芒果醋總酸含量及醋酸轉化率變化結果

海藻酸鈉包埋醋酸菌和甘蔗渣、玉米芯、刨花、花生殼及聚氨酯作為吸附醋酸菌載體進行固定化醋酸發酵，并與普通游離醋酸發酵相對照。發酵周期為168 h，每24 h取樣檢測發酵液的總酸含量變化并計算醋酸轉化率，見圖1。

圖1 不同載體固定化發酵芒果醋總酸含量變化Fig.1 The changes in total acid content of mango vinegar by immobilized fermentation with different carriers

由圖1可知，發酵液總酸含量隨著發酵時間的增加而增加。前24 h產酸速率較慢，可能原因是發酵早期，醋酸菌需要一段時間適應并產生所需的揮發性酸度[15]。24～120 h以內產酸速率較快，發酵周期的后48 h產酸速率降低，主要原因可能是醋酸發酵后期發酵液的酸度累計到較高濃度，醋酸菌加速衰老，發酵產酸受到抑制。由于醋酸菌在缺乏營養物質時會分解部分醋酸[16]，可觀察到發酵周期后24 h，玉米芯吸附和海藻酸鈉包埋固定化發酵液酸度略有下降。由圖1可知，不同的吸附及包埋固定化材料產酸速率差異顯著，前120 h產酸速率為：甘蔗渣>聚氨酯>刨花>海藻酸鈉>玉米芯>對照。發酵液中的最高總酸含量依次為：聚氨酯(4.9 g/dL)>甘蔗渣(4.83 g/dL)>刨花(4.56 g/dL)>玉米芯(4.51 g/dL)>海藻酸鈉(4.27 g/dL)>對照(3.35 g/dL)。發酵結束時，發酵液中總酸含量依次為：聚氨酯>甘蔗渣>刨花>玉米芯>海藻酸鈉>對照。綜上，吸附法固定醋酸菌發酵與包埋固定化和游離發酵相比，產酸速度更快，產酸量更大。以聚氨酯作為吸附固定化材料，與天然吸附固定化材料相比，發酵產酸量更大。研究表明，吸附固定化減少了O2擴散及生產擴大后封裝基體的缺陷。聚氨酯多孔率超過97%，孔徑較大，載體表面完全暴露于發酵液體中，增加了與醋酸菌體的接觸面積，吸附均勻，發酵效率高。而甘蔗渣作為制糖副產物，由半纖維素和木質素構成，內腔式多孔特性，醋酸菌附于多孔結構內部，利于溶氧和營養物質的傳遞。因此，從產酸效果和經濟因素考慮，聚氨酯和甘蔗渣是芒果醋固定化發酵較合適的載體。

圖2 不同載體固定化發酵芒果醋醋酸轉化率變化Fig.2 The changes in acetic acid conversion rate of of mango vinegar by immobilized fermentation with different carriers

由圖2可知，醋酸發酵前期，醋酸轉化率較低，處于對數期的醋酸菌數量有限，轉化乙醇能力較低；醋酸發酵第24～120 h，醋酸轉化率逐漸增加，第144 h之后發酵液中溶解氧含量使得大多數醋酸菌處于生長期，耗去發酵液中大量養分，同時發酵過程發酵液中酒精不斷蒸發，酒精度降低，因此醋酸轉化率下降。而不同固定化載體對醋酸轉化率影響較大。由圖2可知，聚氨酯和甘蔗渣作為載體的芒果醋醋酸轉化率在醋酸發酵第168 h分別達到92%和90%，高于對照組和其他固定化載體發酵芒果醋。

2.2 不同載體固定化發酵芒果醋有機酸含量變化結果

芒果中參與風味變化的有機酸主要包括乙酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、草酸、琥珀酸及酒石酸。在一個發酵周期結束時，測定不同載體固定化醋酸發酵液的主要呈味有機酸濃度，由表2可知，從芒果汁到芒果醋的釀造過程中，有機酸的含量發生了顯著變化。芒果特征性有機酸——草酸在芒果汁至芒果酒的發酵過程中減少，而在醋酸發酵過程中又增加。乳酸作為酒精發酵的產物[17]，在酒精發酵過程中含量顯著增加。但由于醋酸菌的代謝作用和發酵液的沉淀作用，使蘋果酸、檸檬酸、酒石酸的含量在芒果汁至芒果酒至芒果醋發酵過程中均呈總體下降趨勢。琥珀酸在酒精發酵過程中產生，在醋酸發酵過程中含量逐漸增加。琥珀酸與乳酸共同作用除使得果醋具有鮮爽的酸味和香氣外，還使得產品具有獨特的質地并有助于抑制腐敗微生物的生長。以甘蔗渣和聚氨酯作為固定化材料的芒果醋乳酸和琥珀酸含量相對較高。

表2 不同載體固定化發酵芒果醋有機酸含量變化 Table 2 The changes in organic acid content of mango vinegar by immobilized fermentation with different carriers

2.3 不同載體固定化發酵芒果醋感官評價變化結果

由表3可知，以不同材料作為醋酸菌固定化的載體進行醋酸發酵到達醋酸發酵終點時，所得的芒果醋風味和狀態有所不同，其中以甘蔗渣作為載體的芒果醋感官評價總得分最高，以刨花為載體的芒果醋感官評價總得分最低，且以甘蔗渣為載體材料所得的復合果醋與游離醋酸菌所得的復合果醋在色澤、氣味、滋味、形態上最為相似。

表3 不同固定化載體發酵芒果醋感官評價結果Table 3 The changes in sensory evaluation results of mango vinegar by immobilized fermentation with different carriers

海藻酸鈉包埋固定化法發酵芒果醋酸味較協調，因包埋法對細胞的固定效果好，細胞不易脫落[18]，故果醋澄清度好，基本無沉淀物，但果醋香氣不濃。以刨花、花生殼為載體材料固定化發酵所得的復合果醋均有苦澀味和材料本身的異味，而甘蔗渣和玉米芯本身具有果香和殘余糖分，作為載體材料發酵芒果醋酸味協調，氣味清香。但由于吸附法對細胞的吸附力較弱，因而細胞容易脫落，因此都有少量沉淀物。再結合甘蔗渣和玉米芯的感官評分，甘蔗渣感官評分78.53分>玉米芯感官評分75.58分，故甘蔗渣作為載體材料固定化發酵所得的復合果醋更符合大眾口味。

2.4 不同載體固定化發酵芒果醋總酚及抗氧化能力變化結果

不同固定化材料進行一個周期醋酸發酵所得芒果醋中總酚含量及抗氧化能力見圖3。

圖3 不同固定化載體發酵芒果醋總酚及抗氧化能力變化Fig.3 The changes in total phenols and antioxidant capacity of mango vinegar by immobilized fermentation with different carriers

由圖3可知，采用醋酸菌固定化發酵方式可顯著保留芒果醋中的酚類物質及抗氧化能力。在發酵過程中，酚類物質含量受到溫度、O2及發酵液中其他物質成分的影響。醋酸發酵前期，有機酸含量較低，部分酚類物質在多酚氧化酶及O2的作用下生成醌類物質，造成酚類物質的損失及加深發酵液的色度[19]。包埋法固定化的微生物細胞的生理狀態受到多孔介質造成的擴散限制作用以及高密度的生物量影響，其平均攝氧量小于游離細胞[20]，故海藻酸鈉包埋法制得芒果醋總酚含量為(1.64±0.08) mg GAE/mL，對DPPH自由基的清除能力相當于(8.67±0.34) μmol Trolox/L，高于游離(對照)醋酸菌發酵及吸附固定化醋酸菌發酵制得的芒果醋。

DPPH自由基清除法是評價酚類物質抗氧化活性的體外實驗法，本試驗中DPPH自由基清除能力試驗結果與總酚含量趨勢基本一致：海藻酸鈉(8.67±0.34)μmol Trolox/L>聚氨酯(8.1±0.34)μmol Trolox/L>甘蔗渣(7.93±0.21) μmol Trolox/L>玉米芯(7.78±0.30) μmol Trolox/L>刨花(6.8±0.25) μmol Trolox/L>花生殼(6.67±0.31) μmol Trolox/L>游離(對照)(4.33±0.26) μmol Trolox/L。經分析，刨花、玉米芯及甘蔗渣的總酚含量無顯著性差異。聚氨酯材料孔隙度超過97%，載體表面完全暴露，醋酸菌在其上的粘附分布高度均勻，較好地減緩了酚類物質的氧化過程。

2.5 分批次連續發酵不同載體固定化總酸含量變化結果

為比較不同載體固定化醋酸發酵穩定性，在5個發酵周期的發酵終點取發酵液測定總酸含量，由圖4可知，不同固定化載體5個批次發酵液酸度上升規律基本一致，均在第3個周期結束時產酸量達到最大值。可能是由于被固定化的醋酸菌在第3批發酵中菌數達到最大值，后兩個批次發酵時固定化細胞的死亡率持續增加使得產酸量下降。

圖4 分批次連續發酵不同固定化載體發酵芒果醋總酸含量變化Fig.4 The changes in total acid content of mango vinegar by batch continuous immobilized fermentation with different carriers

游離醋酸發酵在第2個批次達到最大產酸值，聚氨酯、刨花和花生殼作為載體材料，每個批次發酵各自差異較小，穩定性較好；以甘蔗渣、玉米芯及海藻酸鈉作為載體材料，在后兩個批次發酵產酸量下降較多，醋酸發酵試驗后期，甘蔗渣和玉米芯質地變軟粘稠，無法保持醋酸菌固定化結構。同時，菌體在載體材料縫隙內產生菌膜，從而增加氧氣消耗，醋酸菌逐漸失活，產酸能力迅速下降。海藻酸鈉包埋的醋酸菌攝氧率小于吸附固定化細胞[21]，在后面批次的發酵中醋酸菌的死亡率較高，使得產酸率下降。

3 結論

與包埋法和游離醋酸發酵相比，吸附法固定醋酸菌醋酸發酵產酸速度更快，產酸量更大。以聚氨酯作為吸附固定化材料，與天然吸附固定化材料相比，發酵產酸量更大。從產酸效果和經濟因素考慮，聚氨酯和甘蔗渣是芒果醋固定化發酵較合適的載體。聚氨酯和甘蔗渣作為載體的芒果醋醋酸轉化率在醋酸發酵第7天分別達到92%和90%，高于對照組和其他固定化載體發酵的芒果醋。以甘蔗渣和聚氨酯作為固定化材料的芒果醋乳酸和琥珀酸含量相對較高。以甘蔗渣作為載體的芒果醋感官評價總得分最高，以刨花為載體的芒果醋感官評價總得分最低。海藻酸鈉包埋法制得芒果醋總酚含量為(1.64±0.08) mg GAE/mL，對DPPH自由基的清除能力相當于(8.67±0.34) μmol Trolox/L，高于游離(對照)醋酸菌發酵及吸附固定化醋酸菌發酵制得的芒果醋。刨花、玉米芯及甘蔗渣的總酚含量無顯著性差異。不同固定化載體5個批次發酵液酸度上升規律基本一致，均在第3個周期結束時產酸量達到最大值。聚氨酯、刨花和花生殼作為載體材料，每個批次發酵各自差異較小，穩定性較好；海藻酸鈉包埋的醋酸菌攝氧率小于吸附固定化細胞，在后面批次的發酵中醋酸菌的死亡率較高，使得產酸率下降。本研究結果可為芒果醋釀造工藝提供理論參考依據，促進芒果產業附加值的提升。