CLDN10在乳腺癌中低表達并預測乳腺癌患者的低生存率

陳屹沖，馮浩杰，梅學鵬，王晶晶，周瀛，樊海寧

(青海大學附屬醫院肝膽胰外科，青海 西寧810000)

0 引言

乳腺癌是全球女性所患最多的癌癥之一，根據世界癌癥研究基金會的報告，每年約200萬例新增病例[1]。其是女性所患癌癥死亡的主要原因，死亡率為11.6%，近年來略有上升0.3%[2]，而在我國的乳腺癌患者中，約有70%的病理分型為浸潤性導管癌，其余類型的乳腺癌占比不超過5%[3]。

緊密連接是細胞三種特殊連接的一種，其不僅可以阻止細胞旁液的滲漏，還在保持細胞完整性上起關鍵作用[4]。據相關文獻報道，腫瘤的侵襲和轉移和緊密連接有著很密切的關系[5-6]。CLDN是一種跨膜蛋白，其在緊密連接中起關鍵作用，由27個成員組成，在細胞的極性、粘附和腺體分化中有著重要地位[7]。CLDN10是CLDN家族中的一員，是一種內皮細胞特異性的緊密連接成分。

微陣列技術是一種可以同時確定數千個基因表達的準確而全面的技術，在各個領域中已經有了廣泛的應用，例如在癌癥中等[8]。在此我們為了闡明癌組織中常見或不同癌組織間的基因表達變化，我們分析了從GEO下載的乳腺癌患者樣本，對CLDN10進行了表達、相關性及生存分析，發現CLDN10是一種潛在的乳腺癌治療靶點。

1 材料和方法

1.1 數據采集

TCGA乳腺癌數據是從癌癥基因組學生物門戶網站(http://www.cbioportal.org/)下載的。TCGA數據集主要包括臨床特征、體細胞突變、生存狀態、DNA甲基化和mRNA表達等信息。我們還從GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得了獨立的微陣列數據集(GSE9014和GSE3971)，這兩個數據集主要包括了乳腺癌中mRNA表達信息。用Illumina HiSeq平臺檢測GEO數據集的基因表達，并轉化為log2量表。

除此之外，我們還使用了Kaplan-Meier Plotter數據庫(http://kmplot.com)，該數據庫在許多癌癥中，例如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、肺癌等可以分析相關基因的生存率。

1.2 統計與分析

使用t檢驗分析正常組織和乳腺癌組織中CLDN10的表達；采用Pearson相關分析比較CLDN10與MYC或PTPRO之間的線性關系；用Kaplan-Meier分析估計兩組的生存曲線，并用對數秩檢驗(Mantel-Cox)進行比較。所有統計圖表均由GraphPad Prism(8.3.0版)完成。R軟件用來將TCGA數據分為兩組。所有P值均為雙側。P值小于0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 CLDN10mRNA在乳腺癌患者中低表達

本研究中，為了比較乳腺癌樣本中CLDN10的表達，從GEO下載了乳腺癌的原始文件GSE9014 Series Matrix.txt。如圖1A所示，我們可以看出乳腺癌中CLDN10mRNA的表達顯著高于正常乳腺癌。作為驗證，我們還下載了GEO數據庫中與GSE9014獨立的GSE3971數據，結果發現乳腺癌組織中CLDN10明顯升高，這與GSE9014的結果一致(圖1B)。

2.2 乳腺癌患者中CLDN10與原癌基因MYC的表達呈負相關，與抑癌基因FH的表達呈正相關

圖1 CLDN10在乳腺癌中的表達情況

圖2 GEO數據庫中GSE9014數據中MYC在乳腺癌中的表達情況(P≤0.05)

圖4 CLDN10和MYC的相關性分析(P≤0.05)

圖5 CLDN10和MYC的相關性分析(P≤0.05)

圖6 乳腺癌中CLDN10的表達和生存時間的關系。A圖來自于Kaplan-Meier Plotter(P≤0.05)；B圖的數據來自于TCGA(P≤0.05)。

為了說明CLDN10在乳腺癌進展中的作用，我們使用GEO數據庫對CLDN10和MYC/FH進行了相關性分析。作為一種原癌基因，MYC已經被證實與乳腺癌患者的生存率有關。與MYC相反，FH是一種乳腺癌中的抑癌基因。如圖2和3所示，與正常組織相比，乳腺癌中MYC的mRNA表達顯著增加，而FH的mRNA表達明顯降低。另外，我們分別分析了CLDN10與MYC和FH的相關性。如圖4圖5所示，CLDN10的表達與FH的表達呈正相關。另外，我們還發現CLDN3與MYC的表達呈負相關。

2.3 CLDN10低表達提示乳腺癌患者預后較差

為探討CLDN10表達是否與患者預后相關，采用Kaplan-Meier生存分析方法評估高表達CLDN10和低表達CLDN10的乳腺癌患者的生存率。圖6A表明，與高表達組相比，表達相對較低的CLDN10 mRNA水平預示著乳腺癌患者有較差的預后。為了進一步驗證上述結論，我們下載了TCGA乳腺癌數據集，我們使用了R軟件利用MaxStat方法，根據CLDN10的表達將乳腺癌患者分為CLDN10高表達組和CLDN10低表達組。結果如圖6B示，與低表達組相比，表達相對較高的CLDN10mRNA水平預示著乳腺癌患者有較好的預后。

3 討論

近年來，高通量技術的引入使得能夠在一次實驗中同時分析數千個基因，這可以作為一種很有前途的工具來篩選用于癌癥診斷和預后的有用的遺傳和表觀遺傳生物標記物[9]。微陣列不僅使研究人員能夠對基因表達進行大規模的定量評估，還定義了多種細胞類型和狀態的轉錄組[10]。國家生物技術信息中心(NCBI)的基因表達總覽(GEO)已經成為領先的完全公開的基因表達數據存儲庫。

圖7 CLDN10(A)、MYC(B)、FH(C)在乳腺癌中的變異比例

因此，我們首先利用GEO數據庫中GSE9014數據集來研究CLDN10在乳腺癌中的表達水平，結果顯示在乳腺癌組織中，CLDN10顯著低表達。同時，為了驗證這一結果，我們分析來了GSE3971中的數據，結果與GSE9014一致。這提示，CLDN10在乳腺癌中高表達，它可能作為一種抑癌基因來調控乳腺癌的發生、發展及預后。

MYC是一種原癌基因，它轉錄的蛋白產物含有一個基本的螺旋-環狀結構域[11]。它是人類癌癥中最常發生變化的癌基因之一，同時，MYC也已被證明是與細胞的致瘤轉化有關[12,13]。另外，幾乎所有類型的人類惡性腫瘤，包括宮頸癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌和胃癌，都有該基因的擴增和過表達有關[14]。除此之外，乳腺癌中MYC癌基因擴增和MYC蛋白過度表達的相關性已有報道，并且在腫瘤的發展過程中，它其是發揮促癌作用[13,15]。除此之外，在人類基因組中，FH的基因位于染色體1p43位點，包含22229個堿基，是一種抑癌基因[16]。相關文獻報道在一些腫瘤中，例如腎上腺皮質癌[17]、結直腸癌[18]、乳腺癌[19]，FH的丟失在這些癌癥的發生中起到了關鍵作用[20]。

我們通過cBioPortal(www.cbioportal.org)，發現CLDN10基因以擴增為主(圖7A)，并且我們篩選了同樣以擴增為主的癌基因MYC(圖7B)和抑癌基因FH(圖7C)。為了進一步說明CLDN10在乳腺癌中作用，我們首先發現GEO中乳腺癌MYC呈現高表達，FH低表達。接著我們用CLDN10分別與MYC和FH進行了相關性分析，結果發現CLDN10與MYC的表達成負相關，而與FH呈正相關，這說明CLDN10在乳腺癌中是一種抑癌基因，這與我們上述的推測一致，即CLDN10在乳腺癌中作為一種抑癌基因，這說明CLDN10在乳腺癌的發展中起抑制作用。

另外，我們使用網絡工具Kaplan-Meier Plotter，根據CLDN10的表達值的中位數將乳腺癌患者分為CLDN10低表達組和高表達組，同時制作了生存曲線圖，我們發現CLDN10高表達組的生存期較CLDN10低表達組的生存期長，這說明高表達CLDN10的乳腺癌患者預后更好，低表達的CLDN10乳腺癌患者預后不良。另外，我們使用TCGA數據庫，利用R軟件中的MaxStat包，將乳腺癌患者分為CLDN10高表達組和低表達組，發現CLDN10低表達組的生存期較CLDN10高表達組的生存期短，這與Kaplan-Meier Plotter的結論一致。總的來說，進一步證明了CLDN10在乳腺癌中抑制腫瘤的發生。

綜上所述，在本研究中，我們發現了CLDN10在乳腺癌中的表達較正常乳腺癌患者低，同時我們還證明了乳腺癌中CLDN10的表達與癌基因MYC呈負相關，但與抑癌基因HF正相關。最后，我們還發現低表達的CLDN10乳腺癌患者預后不良。總之，我們的研究認為，CLDN10在乳腺癌中低表達并預測乳腺癌患者的低生存率。