核酸混樣檢測中假反應性的原因分析和質量控制

張龍穆，袁欣，楊忠思*

(1.青島市中心血站，山東 青島 266000；2.青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島 266000)

0 引言

核酸檢測(nucleic acid amplification test，NAT)技術因檢測靈敏度高、特異性強，極大地降低輸血傳播病毒的殘余危險度[1,2]，歐美地區(qū)等發(fā)達國家從上世紀90年代開始逐漸將NAT技術應用到血液篩查中[3]。2016年開始NAT已全面應用于國內(nèi)獻血者血液標本的篩查[4]，為進一步推進核酸檢測，規(guī)范開展核酸檢測后獻血者傳染病篩查的技術和流程，國家衛(wèi)計委頒布了《血站技術操作規(guī)程(2019版)》[5]。但國內(nèi)采供血系統(tǒng)NAT檢測人員相對較少，日常工作忙碌而繁瑣，在試驗過程中可能更注重結果的有效性，難免出現(xiàn)對試驗過程中的可能出現(xiàn)的假反應性問題的重視不足，對混樣陽性pool拆分試驗陽性率低的問題未引起足夠重視。核酸檢測拆分陽性率低不僅浪費試劑，還可能威脅到血液安全，目前國內(nèi)外對核酸拆分陽性率低的原因和對策研究較少，我們通過對本實驗室工作中各環(huán)節(jié)進行針對性分析，找出核酸檢測拆分陽性率低的主要原因加以改進，從而進一步提高血液質量，降低輸血途徑傳播病毒的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采血管：為本站當前使用的EDTA-K2抗凝的分離膠試管，為一次性無菌無RNA酶真空采血管(BD公司)。

1.2 儀器與試劑

儀器：羅氏cobas S201核酸檢測系統(tǒng)(美國羅氏)，Hamilton STAR加 樣 儀(瑞 士Hamilton)，Thermo低 速 離 心機(美國)。試劑：HBV、HCV、HIV-(1+2)NAT聯(lián)合檢測試劑(cobasTaqScreen MPX)V2.0(美國羅氏)。

1.3 方法

分析核酸檢測拆分試驗陽性率低的原因：統(tǒng)計本2017年1月至8月陽性拆分率，從人、機、料、法、環(huán)多個方面，逐項列出可能導致拆分陽性率低的原因(圖1)，主要包括：操作人員不良操作習慣、儀器維護擦拭不規(guī)范、試劑上機時間長、強陽性標本同步太多、環(huán)境定期清潔不足等有關問題。核酸實驗室全體人員集體討論，并邀請羅氏技術支持進行現(xiàn)場指導，最后初步確認為標本處理環(huán)節(jié)交叉污染所致，主要改進方向：盡量避免核酸與酶免同步檢測，即減少強陽性標本進行核酸檢測的次數(shù)，同時強化實驗室工作人員的防污染意識。統(tǒng)計分析實施改進措施前后拆分陽性率的差異，評價改進效果。

表1 改進前后NAT檢測拆分陽性情況對比

圖1 實驗室可能導致拆分陽性率低的原因

1.4 統(tǒng)計學分析采用

SPSS 13.0軟件對不同時間段拆分陽性率進行比較分析，拆分陽性率比較采用χ2檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2017年1月至2017年8月份，羅氏核酸系統(tǒng)檢測49641份ELISA檢測陰性標本中，NAT混樣混項目陽性53例，經(jīng)拆分后共檢出陽性17例，占總檢測人數(shù)的0.034%，拆分陽性率為32.1%。2017年9月至2018年3月份，羅氏核酸系統(tǒng)檢測64741份ELISA檢測陰性標本中，NAT混樣混項目陽性45例，經(jīng)拆分后共檢出陽性24例，占總檢測人數(shù)的0.037%，拆分陽性率為64.4%。實施改進措施前后拆分陽性率統(tǒng)計學分析。2017年1月至2018年3月份實驗結果，對實施改進措施前后拆分陽性率比較，采用χ2檢驗進行統(tǒng)計分析，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.238，P＜0.05)，見表1。從9月份實施改進措施以后拆分陽性率明顯升高(圖2)。

3 討論

圖2 拆分陽性率pool比例變化

核酸擴增技術能顯著縮短人類免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)等病毒檢測的窗口期，提高病毒的檢出率，2010年開始逐步應用于國內(nèi)獻血者血液標本的篩查，降低了經(jīng)輸血途徑傳播病毒的風險[6]。考慮到核酸試劑成本等方面，現(xiàn)階段國內(nèi)還是主要以混樣模式(6混樣或8混樣)進行獻血者的血液篩查[1,6]，核酸混樣檢測模式相對于單人份檢測模式，雖然節(jié)約核酸檢測成本，也帶來一些問題。以本實驗室使用的羅氏S201檢測系統(tǒng)為例，如果初次混樣陽性(6混樣)，為確定具體的陽性標本，需要進一步進行單樣本拆分試驗，但有一部分拆分試驗結果為全部陰性，據(jù)各地試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2016年山東省使用羅氏核酸檢測拆分陽性率為64.3%(內(nèi)部交流數(shù)據(jù)，未公開發(fā)表)，而本實驗室2017年1-8月拆分陽性率僅為32.1%(表1，2)。按照試劑說明書判定規(guī)則，拆分全陰性的6個標本全部判為核酸檢測合格。雖然初次混樣陽性結果以假反應性對待，但也并不排除某些原因導致核酸拆分試驗的假陰性問題的可能性，如核酸檢測標本的處理、保存不當，會造成病毒核酸降解[7,8]。相關報道顯示，酶免陰性核酸陽性的獻血者通過追蹤或補充實驗，多數(shù)為隱匿性感染，病毒載量多數(shù)都低于定量檢測的檢測下限[9-11]，說明隱匿性感染時一般血液中的病毒載量也非常低，混樣檢測會降低試劑的檢測靈敏度[12]，導致低病毒載量的標本核酸檢測的確存在檢出概率問題，有研究顯示通過超高速離心的方法使低濃度的陽性標本鑒別率明顯提高[13]，因此拆分陰性標本是否可以斷定初次混檢就是假反應性也有待考證。

核酸檢測影響因素眾多，如操作人員因素、儀器誤差因素、獻血者血液標本及試劑質量因素、實驗操作因素、環(huán)境因素等。筆者針對拆分陽性率低的問題進行可能原因分析(圖1)，核酸實驗室全體人員集體討論，并邀請羅氏技術支持進行現(xiàn)場指導，最后初步確認為標本處理環(huán)節(jié)交叉污染所致，主要原因可能是前期酶免核酸同步檢測較多(2016至2017年因生育政策調整，本實驗室產(chǎn)假人數(shù)較多，導致核酸工作人員不足)，確定主要改進方向：避免核酸與酶免同步檢測，即減少強陽性標本進行核酸檢測的次數(shù)，同時通過實驗室全體人員集體討論的方式，也使實驗室工作人員主動提升的日常工作中的防污染意識。采取積極有效的改進措施后，2017年9月至2018年3月份，羅氏核酸系統(tǒng)檢測64741份ELISA檢測陰性標本中，NAT混樣混項目陽性45例，經(jīng)拆分后共檢出陽性24例，占總檢測人數(shù)的0.037%，拆分陽性率為64.4%。采取有效的措施使改進前后未拆分出數(shù)量明顯減少(32.1% VS 64.4%，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。筆者認為因各實驗室情況各異，出現(xiàn)類似拆分率低的情況應列出的可能的原因，應結合實驗室具體情況進行逐個排除，最后針對主要的一個或幾個原因進行改進，當然每一次改進主要還是應該重視人的因素，重視改進-培訓-評估的重要性。

雖然有學者認為NAT混樣混項目陽性而未拆分出的標本，不能完全排除極低病毒濃度的情況出現(xiàn)[14,15]。但本室每次拆分實驗所設陰性室內(nèi)質控均在控，故可認為假陰性導致的未拆分出實驗為小概率事件(當然也不能完全排除極低病毒濃度的情況出現(xiàn))，對于本文的拆分陽性率的統(tǒng)計比較誤差可以忽略。筆者認為對于未拆分出樣本，可以考慮增加拆分次數(shù)或用另一種不同原理的檢測系統(tǒng)再次檢測，驗證能否提高拆分陽性率，我們將通過后續(xù)試驗加以驗證。

實驗室從2017年9月份實施的上述一系列改進措施，明顯提高了核酸檢測拆分陽性率。針對拆分陽性率低的問題進行可能原因分析，核酸實驗室全體人員集體討論，最后初步確認為標本處理環(huán)節(jié)交叉污染所致，主要原因可能是前期酶免核酸同步檢測較多，確定主要改進方向：避免核酸與酶免同步檢測，即減少強陽性標本進行核酸檢測的次數(shù)，同時通過實驗室全體人員集體討論的方式，也使實驗室工作人員主動提升的日常工作中的防污染意識。