好氧-厭氧兩相堆肥過程中抗生素耐藥基因的變化特征及影響因素研究

李厚禹, 徐 艷, 成衛(wèi)民, 邵振魯, 李碧菡, 鄭向群*

1.農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所, 天津 300191 2.山東農業(yè)大學, 山東 泰安 271018

我國作為農業(yè)大國，畜禽養(yǎng)殖業(yè)逐步由分散式向集約化養(yǎng)殖方式轉變，為提高畜禽產量及預防疾病，大量使用抗生素，濫用情況日益嚴重[1]. 然而，大部分抗生素會以其原體或代謝物的形式隨尿液和糞便排出畜禽體外，排出的抗生素會對外界環(huán)境產生選擇性壓力，從而導致抗生素耐藥菌(antibiotic resistance bacteria, ARB)和抗生素耐藥基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的大量產生[2-4]. 目前，畜禽糞便常被作為肥料施用于農業(yè)生產過程中，ARBs與ARGs可能通過該途徑進入土壤、水等環(huán)境中，致使環(huán)境中存在ARGs的遷移擴散. XIE等[5]研究表明，施用糞肥是將ARGs直接引入農田土壤系統(tǒng)的主要途徑. 曾慶濤[6]研究發(fā)現(xiàn)，我國多個地區(qū)設施農業(yè)大棚內、外土壤中均檢出大量ARGs，其豐度范圍分別為1.15×10-7～9.78×10-2和LOD(Limit of detection, 檢出限)～4.92×10-2copies16S rRNA copies，且發(fā)現(xiàn)土壤中ARGs可通過顆粒物進入空氣，污染大氣. 金明蘭等[7]在養(yǎng)禽場周圍的水環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了磺胺類ARGs及磺胺類抗性菌株的存在，且具有多重抗性. 此外，ARGs還可能會通過基因水平轉移或親代遺傳的方式在微生物間傳播[8]. DUAN等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ARGs在土壤微生物和蔬菜之間也會發(fā)生水平基因轉移，ARGs通過土壤微生物可能轉移到植物體內，通過食物鏈進一步危害人類健康. 因此，處置畜禽糞便的堆肥技術除了考慮去除典型污染物、提高肥料營養(yǎng)成分外，也應關注堆肥過程中基因污染物ARGs豐度的變化規(guī)律及其產出肥料中的殘留情況，為后續(xù)優(yōu)選畜禽糞便處理方式提供參考依據(jù).

目前，好氧堆肥被認為是處理和再利用畜禽糞便的主要方法之一，可以有效殺滅動物糞便中的病原菌，將畜禽糞便制備成有機肥[10-11]. 吳丹[12]對北京地區(qū)禽場糞便進行好氧堆肥的試驗中發(fā)現(xiàn)，ARGs去除率較高，為90.0%～99.9%. 武晉萍等[13]研究也發(fā)現(xiàn)，中藥渣與雞糞復合好氧堆肥能夠顯著降低ARGs的相對豐度. 然而，好氧堆肥處理過程不能有效去除所有ARGs. 張凱煜[14]在高溫堆肥過程對豬糞來源ARGs影響的研究中發(fā)現(xiàn)，與堆肥初期相比，ermF甚至出現(xiàn)增加的情況. ZHANG等[15]也發(fā)現(xiàn)，經過堆肥處理后，一些ARGs (blaCTX-M、blaTEM、ermB、ereA和tetW)的絕對豐度減少了0.3～2.0 logs，但也存在另一部分ARGs (ermF、sul1、sul2、tetG、tetX以及mefA)絕對豐度增加的現(xiàn)象，增加了0.3～1.3 logs. 因此，當前迫切需要對堆肥工藝進行優(yōu)化，以更有效去除糞肥中的ARGs，降低細菌耐藥對環(huán)境帶來的風險；同時，厭氧發(fā)酵作為畜禽糞便資源化和肥料化利用的另一種重要方式，能夠有效消減ARGs的豐度. 郭斯韜等[16]對污泥厭氧發(fā)酵過程中ARGs變化特征的研究中發(fā)現(xiàn)，tetG、tetO、tetW、sul1和sul2的絕對豐度經過厭氧發(fā)酵過程后均有所下降. 錢燕云等[17]研究提到，污泥厭氧處理可以有效減少污泥中高濃度ARGs，tetL和tetW的絕對豐度分別消減了0.8和0.9 logs. 多數(shù)學者對堆肥過程中ARGs豐度變化的研究集中于好氧或厭氧單一堆肥過程，而缺乏對好氧-厭氧兩相聯(lián)合堆肥過程中ARGs去除效果的研究.

基于此，該文通過構建好氧-厭氧聯(lián)合堆肥工藝處理豬糞及玉米秸稈，闡明好氧-厭氧兩相堆肥過程中ARGs豐度及微生物群落的變化特征，定量分析堆肥過程中ARGs及其宿主微生物的傳播遷移風險，明確影響ARGs及其宿主微生物相對豐度變化的關鍵因子，旨在為農業(yè)固體廢棄物的無害化、資源化利用、抗生素農業(yè)面源污染防治，以及ARGs和潛在致病菌的阻控，提供科學的理論依據(jù)和技術基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗設計與樣品采集

堆肥處理所使用的原料豬糞及玉米秸稈(原料成分見表1)采集于天津市寧河區(qū)玉米良種場，其中，豬糞采用新鮮豬糞，玉米秸稈粉碎至粒徑1～3 cm. 堆肥原料置于內直徑為500 mm、容積為100 L、攪拌速率為18 rmin的堆肥反應器中，設定攪拌時間為1次d，豬糞與秸稈按照質量比3∶1混勻，調節(jié)含水率為60%～70%，均勻混合，每次翻堆后取樣. 以是否結合厭氧發(fā)酵為變量設計單一變量試驗，控制組進行為期27 d的連續(xù)好氧堆肥，試驗組共分為2個階段，第一階段為期15 d的持續(xù)好氧堆肥，第二階段為連續(xù)12 d的密閉厭氧堆肥，即周期為27 d的好氧-厭氧兩相堆肥試驗. 于整個堆肥階段的第0、3、7、11、15、18、21、24、27天采樣. 采集的堆肥樣品分為兩份：一份于4 ℃下儲存，用于理化指標的測定；另一份在-80 ℃下儲存，用于后續(xù)ARGs豐度及微生物群落結構的分析.

表1 堆肥原料成分

1.2 理化指標測定

采用數(shù)字電子溫度計(Toolwell，深圳市拓爾為電子科技有限公司)測定環(huán)境溫度及堆肥反應器中的堆體溫度. 利用pH計(pH5S Spear pH Tester，上海三信儀表廠)測定堆肥樣品(蒸餾水與樣品以2.5∶1 的比例充分混合)的pH. 采用電導率儀(SX650，上海三信儀表廠)測定上清液(新鮮堆肥樣品與超純水按1∶10比例混勻)的電導率. 堆肥樣品中的TP和TN按照NY 525—2012《有機肥料》所提供的前處理方法進行消煮，所得溶液均使用AA3連續(xù)流動分析儀(SEAL，天津中通科技有限公司)測定其含量. TOC則采用NY 525—2012《有機肥料》中的重鉻酸鉀法進行水浴加熱，并用硫酸亞鐵溶液滴定，進而測定其含量.

1.3 DNA提取

采用DNA提取試劑盒(六合通DNeasy Power Soil Kit，北京六合通經貿有限公司)從3～5 g堆肥樣品中提取DNA，具體操作步驟按照DNA提取試劑盒流程手冊進行. 提取DNA后，采用微量核酸蛋白質分析儀(NANOP HOTOMETER C40，德國IMPlEN公司)檢測DNA含量及純度，并于-80 ℃冰箱保存，待進一步的ARGs檢測分析.

1.4 ARGs的定量

該試驗選擇文獻[18]中所涉及的11種ARGs(見表2)、1種可移動遺傳原件(intI1)以及16S rRNA進行測定. 并采用WafergenSmartchip超高通量熒光定量PCR系統(tǒng)完成ARGs的定量測定，其反應體系為1×LightCycler 480 SYBR Green I Master，每個引物濃度為500 nmolL，DNA模板濃度為2 ngμL，反應體積為100 nL.

表2 ARGs的種類

1.5 微生物群落的測定

采用Illumina Miseq高通量測序技術分析堆肥處理過程中第0、7、15、27天樣品的微生物群落結構，其中第0天為混合堆肥原料，第7天為好氧堆肥高溫期結束，第15天為第一階段好氧堆肥階段結束，第27天控制組與試驗組試驗結束. 選用16S rRNA V4區(qū)引物(515a-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA,806-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT)對細菌DNA進行擴增. 最后，采用1%瓊脂糖凝膠在170 V的電壓下電泳30 min 檢測DNA擴增產物，從而獲得擴增片段的質量情況.

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.1軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并在R語言環(huán)境下繪制熱圖，用來表達ARGs及微生物優(yōu)勢菌屬的豐度. 為使數(shù)據(jù)在圖中更具有區(qū)分度，在繪制熱圖前利用R語言對ARGs數(shù)據(jù)進行歸一化，區(qū)間為[0, 5]；對微生物優(yōu)勢菌屬豐度數(shù)據(jù)進行歸一化，區(qū)間為[0, 1]. 采用STAMP軟件對微生物群落結構和ARGs分別進行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)，比較二者之間的變化模式，并進一步利用Canoco 4.5軟件對堆肥過程中環(huán)境因子、微生物群落結構與ARGs相對豐度進行冗余分析(redundancy analysis, RDA)，探究環(huán)境因子、微生物群落結構與ARGs變化之間的相互關系.

2 結果與討論

2.1 堆肥過程中ARGs的含量變化

圖1為2組堆肥過程中ARGs相對豐度熱圖. 由圖1可見：經過27 d的堆肥處理，與第0天相比，ermB的相對豐度在控制組與試驗組中分別降低了18.28%、39.68%；tetK在控制組中增加了20.71倍，而在試驗組中降低了72.19%. 這說明好氧-厭氧兩相堆肥能夠更有效地降低部分ARGs的相對豐度. 此外，strA、tetM-01、sul1的相對豐度在控制組中分別降低了24.90%、7.02%、5.11%，在試驗組中分別增加了1.80、1.50、1.18倍，這表明好氧-厭氧兩相堆肥過程仍會引起個別ARGs的增殖. 該結果與部分學者研究得到的厭氧堆肥后可能會增加ARGs相對豐度的結果[19-20]類似. 潘洪加[21]研究結果表明，厭氧處理雖然能夠有效去除ARGs，但對部分ARGs(如四環(huán)素類)的去除效果不佳. ZHANG等[22]在豬糞厭氧發(fā)酵試驗中也發(fā)現(xiàn)，相較于堆肥原料，堆肥產物中sul1、sul2和dfrA7的絕對豐度也升高了0.5～1.0 logs.

圖1 堆肥過程中的ARGs相對豐度的變化情況Fig.1 Change of the relative abundance of ARGs during composting

圖2 堆肥過程中ARGs絕對豐度的變化情況Fig.2 The change of the absolute abundance of ARGs during composting

為進一步探究好氧-厭氧兩相堆肥過程中ARGs的變化趨勢，對控制組與試驗組15～27 d (堆肥后期)ARGs的絕對豐度變化進行比較. 由圖2可見，1～15 d 好氧堆肥處理過程中，控制組與試驗組多數(shù)ARGs絕對豐度的變化趨勢類似，經過好氧堆肥處理后，ARGs的絕對豐度均得到了有效降低. 已有研究[2,15]也表明，高溫環(huán)境下ARGs絕對豐度能夠得到明顯消減. 而在15～27 d(堆肥后期)，控制組仍為好氧堆肥，sul1、sul2、ermF、strB的絕對豐度連續(xù)增加，分別由2.79×104、9.12×103、6.13×103、4.48 ×103copiesg增至5.37×104、9.24×104、7.28×104、1.19×104copiesg. 這與QIAN等[23]所得結論一致，部分ARGs的絕對豐度從好氧堆肥初期到高溫期逐漸降低，而在高溫期過度到腐熟期時則出現(xiàn)ARGs絕對豐度回升的現(xiàn)象. 而該階段試驗組采用厭氧發(fā)酵，sul1、sul2、ermF、strB的絕對豐度在18～24 d的變化趨勢與控制組相同，分別由3.20×104、5.04×103、1.86×103、4.22×103copiesg增至1.04×104、4.86×104、7.71×104、9.92×104copiesg，但在24～27 d其絕對豐度分別減少了1.53×104、2.32×104、2.32×103、1.63×104copiesg. 因此，好氧-厭氧兩相堆肥過程能夠有效地減緩ARGs絕對豐度回升趨勢，抑制部分ARGs的增殖. 值得注意的是，與第15天相比，Ⅰ類整合子intI1的絕對豐度在控制組中呈增加趨勢(增加了1.5倍)，而在試驗組中降低了27.64%，而I類整合子(intI1)對多數(shù)ARGs的交流和整合起重要作用，從而使細菌具有耐藥性[24-25]. 因此，好氧-厭氧兩相堆肥過程中整合子intI1絕對豐度的降低可以進一步說明好氧-厭氧兩相堆肥能夠有效抑制ARGs的傳播.

2.2 堆肥過程中微生物群落結構的變化

堆肥處理作為生物轉化過程，在對ARGs產生影響的同時，也對微生物群落結構的變化產生一定影響. 控制組及試驗組堆肥過程中門水平微生物群落的變化情況如圖3所示. 由圖3可見，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)為各處理組中的優(yōu)勢菌門，相對豐度遠高于其他門水平微生物，平均相對豐度占比分別為33.48%、25.37%、24.02%、11.04%，與已有研究結果[23,26]一致. 而經過好氧堆肥高溫階段(0～7 d)，厚壁菌門的相對豐度占比大幅增加，控制組中其占比由22.47%升至66.59%，試驗組中則由21.94%增至76.99%. 在經過堆肥處理第二階段(15～27 d)后，厚壁菌門的相對豐度占比分別降低了40.9%(控制組)、57.42%(試驗組)，說明好氧-厭氧兩相堆肥能更有效地降低厚壁菌門的相對豐度. 此外，變形菌門的相對豐度占比在控制組中由30.45%(第0天)降至15.05%(第7天)，最終回升至25.53%(第27天)；在試驗組中變形菌門的相對豐度由37.20%(第0天)降至7.83%(第7天)，在第27天時增至20.13%. 相比較而言，試驗組中變形菌門相對豐度降低的效果更加明顯. 值得注意的是，已有研究[27-29]發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和變形菌門可能是ARGs的主要攜帶者. 綜上，好氧-厭氧兩相堆肥可能更有效地降低ARGs的相對豐度.

各堆肥處理過程中屬水平微生物(相對豐度占比前20位的菌屬)的相對豐度變化情況如圖4所示. 由圖4可見，與第0天相比，經過堆肥處理后，假單胞菌屬(Pseudomonas)、梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)的相對豐度在控制組分別減少了94.79%、96.10%，而在試驗組中分別減少了96.09%、90.07%. 已有研究[30-31]表明，堆肥過程中2種相對豐度降幅較大的微生物均為人類潛在致病菌和ARGs的寄主細菌. 第27天的堆肥產物與第15天相比，纖細芽胞桿菌屬(Gracilibacillus)、海洋桿菌屬(Oceanobacillus)(二者均屬于Firmicutes)的相對豐度在控制組中分別增加了1.6、1.9倍，而在試驗組中其相對豐度分別減少了45.97%、18.91%. 此外，黃桿菌屬(Flavobacterium，屬于Proteobacteria)的相對豐度在試驗組中的降解程度(26.04%)高于控制組(14.94%). 綜上，好氧-厭氧兩相堆肥能夠更有效地降低ARGs宿主微生物及致病菌的相對豐度. 值得注意的是，鞘脂桿菌屬(Sphingobacterium)的相對豐度在試驗組中增加了172.0倍，遠大于控制組(4.0倍)，而鞘脂桿菌屬是一種潛在的條件致病菌[32]. 因此，好氧-厭氧兩相堆肥也會引起個別潛在致病菌的增殖，存在一定的環(huán)境風險. 因此，需要進一步探究影響ARGs宿主微生物及致病菌的關鍵因子，為ARGs及致病菌的消減提供理論依據(jù).

圖4 堆肥過程中微生物(屬水平)相對豐度的變化情況Fig.4 The change on relative abundance of microbial (at genus level) during composting

2.3 微生物群落與ARGs之間的關系

基于Bray-Curtis距離，采用PCA以堆肥時間為分組依據(jù)對各處理堆肥樣品中的ARGs〔(見圖5(a)〕、微生物群落結構〔(見圖5(b)〕進行分析. 結果發(fā)現(xiàn)，各堆肥樣品中ARGs在第一軸、第二軸中按照堆肥時間聚類，且不同堆肥時間的樣品中ARGs相對豐度的差異顯著〔(見圖5(a)〕；同時，各堆肥處理過程中微生物群落結構的變化模式〔(見圖5(b)〕與ARGs類似. 該結果表明，堆肥過程中不同時段微生物群落結構的變化可能會影響ARGs的相對豐度變化. 這與Selvam等[33]研究結果一致，ARGs相對豐度在不同堆肥階段出現(xiàn)增加或下降趨勢，可能與不同堆肥階段微生物群落結構的差異有關. YIN等[34]研究發(fā)現(xiàn)，添加銅的堆肥過程中，細菌群落的演替對ARGs相對豐度的變化有重要影響.

圖5 ARGs及微生物群落基于Bray-Curtis距離的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of antibiotic resistance genes and microbial community based on Bray-Curtis distance

圖6 ARGs與微生物群落(解釋量前10)之間的相互關系Fig.6 The relationship between microorganism (explain the amount of top 10) and ARGs during composting

為進一步明確ARGs與微生物之間的相互關系，采用RDA對二者進行分析. 由圖6可見，微生物群落結構對ARGs相對豐度變化的總解釋率為82.0%，起主要影響作用的是Clostridium_sense_stricto_1、Flavobacterium、Ureibacillus和Oceanobacillus，其中Clostridium_sense_stricto_1、Flavobacterium均與blaTEM、ermA呈正相關，Ureibacillus、Oceanobacillus均與tetM-01、tetH呈顯著正相關(P<0.05). 一方面，研究[35]表明，Clostridium_sense_stricto_1、Flavobacterium、Ureibacillus、Oceanobacillus為ARGs重要的攜帶菌屬，因此堆肥過程中ARGs攜帶菌屬相對豐度的降低可以解釋ARGs相對豐度減少的原因；另一方面，研究[36]表明，微生物菌株之間存在拮抗作用，拮抗菌株對高溫、酸堿耐受性較強，且其具有較好的耐藥性. 然而該試驗分析的優(yōu)勢菌屬并無拮抗菌株，堆肥體系中可能存在的其他拮抗菌株占比較小，對ARGs相對豐度的影響在該研究中不予考慮. 以上分析證實了PCA的結論，ARGs相對豐度的變化受微生物群落結構變化影響，與LIU等[37]所得結論一致. 此外，也有研究[30]表明，堆肥過程中ARGs相對豐度的變化除了受微生物群落演替的影響外，同時也受堆肥環(huán)境因子變化的影響.

2.4 堆肥環(huán)境因子對ARGs的影響

注： TP、TN、TOC分別代表TP、TN、TOC的濃度.圖7 環(huán)境因子與ARGs之間的相互關系Fig.7 The relationship between ARGs and environmental factors during composting

采用RDA評價堆肥環(huán)境因子與ARGs之間的相關關系. 由圖7可見，環(huán)境因子在第一軸和第二軸中對ARGs相對豐度變化的總解釋率為71.2%，其中溫度、電導率、含水率和pH是對ARGs相對豐度變化起關鍵作用的環(huán)境因子，解釋率分別為22.0%、16.7%、16.2%和15.0%. 溫度、含水率均與blaTEM、strA呈正相關，與其他大部分ARGs呈較弱的正相關或負相關. 已有研究[10,38]表明，溫度會影響豬糞堆肥中微生物新陳代謝、分布及其動態(tài)，能夠直接或間接地影響ARGs相對豐度的變化. ZHANG等[39]研究也發(fā)現(xiàn)，ARGs相對豐度變化受溫度的影響. 筆者研究結論證實了高溫能夠有效地消減ARGs的相對豐度. 含水率決定了微生物的生長和堆肥過程中典型的生化過程[40]，從而影響ARGs相對豐度的變化. ZHANG等[41]在分析豬糞與棉花秸稈復合堆肥中ARGs相對豐度變化影響因素的試驗中也發(fā)現(xiàn)，含水率顯著影響ARGs相對豐度的變化. 電導率、pH均與tetK、ermA、ermB及整合子intI1呈正相關. 電導率變化是由微生物引起的Cl-、SO42-、Na+和NH4+等堆肥體系中可溶性鹽含量變化所致[42]，也是微生物對ARGs作用的間接體現(xiàn). pH變化有可能抑制微生物的自我復制過程，從而可能對ARGs的傳播產生影響，這與支蘇麗等[43]研究結果一致. 綜上，ARGs相對豐度的變化與堆肥進程所處的環(huán)境緊密相關，但相較于微生物群落結構，環(huán)境因子對ARGs相對豐度變化的影響相對較弱. ZHANG等[31]在豬糞及中藥渣的共堆肥試驗中也發(fā)現(xiàn)，相較于環(huán)境因子，微生物群落結構對ARGs相對豐度的影響作用更顯著，與筆者所得結論一致.

3 結論

a) 與好氧堆肥過程相比，好氧-厭氧兩相堆肥能夠更有效地抑制部分ARGs的絕對豐度在堆肥后期回升，從而有效降低堆肥產物中部分ARGs的豐度，然而該工藝仍不能完全去除ARGs，因此亟需進一步優(yōu)化好氧-厭氧兩相堆肥工藝，從而提高對ARGs的消減效率.

b) 好氧-厭氧兩相堆肥能夠有效減少潛在致病菌及ARGs潛在宿主微生物，從而有效抑制潛在致病菌的傳播擴散與ARGs的遷移，減小環(huán)境風險及人類健康風險.

c) 微生物群落結構及堆肥環(huán)境因子對堆肥過程中ARGs相對豐度的變化起到了直接或間接的作用. 通過明確堆肥過程中影響ARGs相對豐度變化的因素，進一步探索優(yōu)化堆肥工藝，篩選有利于提高堆肥無害化效果的微生物菌屬.