水保措施對柑橘果園土壤細菌群落結構的影響

吳波波， 王 鵬*， 肖勝生， 余小芳， 舒 旺， 張 華， 丁明軍

1.江西師范大學地理與環境學院， 江西 南昌 330022 2.江西師范大學， 鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室， 江西 南昌 330022 3.江西省水土保持科學研究院， 江西 南昌 330029

土壤細菌豐度高、種類多、代謝活性豐富，能迅速對環境擾動做出反應，是土壤生態系統重要的活性部分[1]，其群落在調節養分循環、影響植物生產力和生態系統穩定性方面起著重要作用[2]. 已有研究證實，影響土壤條件的農業實踐會改變土壤微生物群落，尤其是細菌群落[3]. 不同學者在許多研究中也已探索了水保措施對土壤細菌群落結構的影響，大多數研究表明，與輪作和凈耕相比，作物覆蓋增加了土壤有機質含量和細菌多樣性，是改善土壤微環境的有效策略[4-6]；輪作增加了土壤細菌的數量，但并沒有影響細菌的豐富度或多樣性[7]；凈耕容易導致土壤有機質含量銳減、細菌多樣性降低、樹體早衰、果實品質下降[8]. 也有研究得出相反結論，例如，Sanaullah等[9]研究了農業管理系統對陸地生態系統功能的影響，發現豆科植物輪作降低了病蟲害壓力，增加了土壤中的氮含量，從而導致土壤微生物活性增強，細菌多樣性提高；DONG等[10]認為，凈耕可以增加土壤碳儲量和養分含量，穩定土壤結構，從而增強土壤微生物活性. 可見，不同水保措施對土壤細菌群落結構的影響較為復雜，它們之間的相互作用及其作用機理尚未明確，水保措施對土壤特性及細菌群落影響的爭論仍然存在. 此外，盡管已有學者開展了水保措施對土壤菌群群落結構的影響研究[6]，但對亞熱帶環境下不同水保措施導致的柑橘果園土壤細菌群落結構響應尚不明確，特別是細菌群落交互作用的網絡對亞熱帶柑橘果園土壤環境變化的響應還鮮有報道.

柑橘是中國乃至世界上最具經濟價值的果樹之一[11]. 隨著人口快速增長及農戶追求經濟利益最大化等因素的影響，中國南方越來越多的坡地次生林轉變為果園[12]，柑橘果園也因其高經濟收益在該地區廣泛分布[13]. 規模機械化開挖對果園土壤的強烈干擾易導致土壤養分循環失衡及農作物生產力下降[14]，探索新的水保措施已成為該區域柑橘產業可持續發展的重要途徑. 在土壤中，細菌數量、群落結構質量變化(如多樣性指數)是土壤健康重要且敏感的指標[15]，對土壤細菌群落結構的深入認知，將有助于制定合理有效的水保措施. 此外，土壤細菌群落的分布模式和驅動因素可能在不同水保措施間有所不同，而不同水保措施下的土壤細菌群落在土壤養分利用效率之間的差異會嚴重影響植物的生長，因此，了解土壤細菌的多樣性、群落組成及其交互作用對于通過調控細菌群落以實現作物的可持續生產至關重要.

鑒于此，為研究不同水保措施對柑橘果園土壤細菌群落結構的影響，該研究選取了江西省德安縣柑橘果園的4種水土保持試驗小區作為研究對象，通過Shannon-Wiener指數和Chao1指數探究了不同水保措施下柑橘果園土壤細菌的多樣性，利用高通量測序技術分析了不同水保措施下柑橘果園土壤細菌的群落組成，并通過構建其分子生態網絡，探索了不同水保措施對柑橘果園土壤細菌群落交互作用的影響，以期為柑橘果園土壤生態系統研究提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 樣地概況

試驗地位于江西省德安縣燕溝小流域內的江西水土保持生態科技園(115°42′38″E～115°43′06″E、29°16′37″N～29°17′40″N). 該區屬于亞熱帶季風氣候區，平均海拔30～90 m，多年平均降水量為 1 537 mm，多年平均氣溫為16.7 ℃，年日照時數為 1 700～2 100 h. 地貌類型主要為淺丘崗地，植被類型屬于亞熱帶常綠闊葉林，植被類型主要有針葉林、山地針葉林、常綠闊葉林等，土壤主要為第四紀紅黏土發育的紅壤，土壤厚度為0.5～1.5 m. 該區位于中國紅壤分布的中心區域，屬全國土壤侵蝕二級類型區，在江西省和南方紅壤丘陵區具有典型代表性.

1.2 樣地設置及采樣方法

試驗地為柑橘果園水土保持試驗區，柑橘果園按照 1 335株hm2的初始密度于2001年栽植. 試驗設置4個水保措施(從2001年持續至2019年)，分別為狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)、經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)和凈耕果園(JG)，每個水保措施設置1個小區，共4個試驗小區. 試驗小區坡度均為10°，面積均為20 m2(寬2 m、長10 m)，各小區其他管理措施一致.

2019年5月進行采樣. 在每個試驗小區內進行3次重復采樣，每次采樣為5個采樣點的混合，按照S型選取5個采樣點. 每個采樣點去除表面凋落物后，用土鉆按照表層(0～10 cm)、中層(10～20 cm)和底層(20～40 cm)進行土壤分層取樣，去除石頭、植物殘留物、動物和其他雜物后分成2份，冷藏帶回實驗室. 其中，一份放在-80 ℃冰箱保存，用于高通量測序，另一份風干后用于測定土壤基本理化指標. 因測序成本較高，用于高通量測序的樣品是3次重復采樣樣品充分混合而成的.

1.3 試驗分析

全磷(TP)含量采用HJ 632—2011《堿熔-鉬銻抗分光光度法》測定；對于全氮(TN)含量，將土壤經過濃硫酸-高氯酸消解后，采用HJ 634—2012《氯化鉀溶液提取-分光光度法》測定；對于pH，樣品加水后(水土比為1∶2.5)采用便攜式水質分析儀(HI9828，HANNA，Italy)測定；土壤有機碳(SOC)含量采用碳氮元素分析儀(Elemantar vario MAX，Germany)測定；土壤有機質(SOM)含量采用重鉻酸鉀-硫酸外加熱法測定(總共36個樣品，即每個土層設置3個重復).

細菌16S rRNA基因測序采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)提取土壤樣品基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA. 對16S rRNA基因的V3～V4高變區片段進行PCR擴增，引物序列為338F(5′-ACTCCTA CGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′). 擴增條件：95 ℃預變性2 min，接著進行25個循環，包括95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；循環結束后72 ℃最終延伸5 min(PCR儀，ABI GeneAmp? 9700型，USA). 總共12個樣品(每個土層不設置重復)，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN,USA)切膠回收PCR產物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測. 參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega,USA)進行檢測定量. 16SrRNA基因測序在上海美吉生物醫藥科技有限公司的Illumina Miseq PE300平臺進行. 原始數據上傳至NCBI數據庫中(序列號為SUB7239364).

細菌的絕對豐度采用Real-time熒光定量 PCR法獲得，在博日LineGene9600plus平臺上進行. 反應體系(20 μL)：ChamQSYBR ColorqPCRMasterMix(2X)10 μL，5 μmolL正、反向引物各 0.5 μL，樣品模板 DNA 2 μL，ddH2O 4.5 μL. 細菌熒光定量PCR的擴增引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′). 反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，72 ℃修復延伸，共40個循環. 最后按照博日LineGene9600plus實時熒光定量檢測系統默認程序制備熔解曲線并檢測是否存在非特異性擴增. 每個樣品均設置3個平行，并利用不含DNA的去離子水作為陰性對照. 利用含有細菌16S rRNA基因全長的質粒構建標準曲線，稀釋梯度為原濃度的10-3～10-8. 所有 PCR反應的擴增效率均在 90%以上，相關系數(R2)均大于99%.

1.4 數據處理

利用Mothur(V.1.36.1)對原始DNA序列進行過濾處理，去除嵌合體，得到優化序列；按照97%相似性將優化序列劃分可操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTU)；基于OTU進行稀釋性曲線分析，計算Chao1指數和Shannon-Wiener指數. 采用RDP classifier貝葉斯算法對照Silva數據庫以70%置信度對OTU代表序列進行物種分類，并在各分類水平上統計每個樣品的群落組成(為避免各樣品微生物量的差異，按最小樣本序列數進行樣本序列抽平，得到標準化數據用于后續統計分析). 采用單因素方差分析進行不同土層和不同水保措施下土壤樣品間細菌16S rRNA的基因拷貝數和土壤理化指標的顯著性檢驗(顯著性水平P≤0.05視為差異顯著)；多重比較分析采用LSD法；相關性分析采用Spearman相關分析法. Veen圖用于反映不同水保措施下共有和獨有OTU的數量. 基于Bray-Curtis距離做PLS-DA分析以反映細菌群落結構的整體差異，通過冗余分析來研究土壤理化指標與細菌群落的關系.

注： 同一列標有不同小寫字母的表示不同處理間差異顯著(P<0.05)；標有不同大寫字母的表示同一處理不同土層之間差異顯著(P<0.05).圖1 不同水保措施下土壤理化性質Fig.1 Soil physicochemical properties under different soil and water conservation measures

為確定細菌群落成員之間的聯系(正相關和負相關)，使用Cytoscape 3.4.0進行網絡可視化和模塊化分析[16]. 網絡分析采用CONET插件(http:psbweb05.psb.ugent.beconet)[17]，每個OTU的分類標識在門類級別分配，將獲得的原始OTU數據(具有分類學豐度的表格)用作輸入矩陣，根據CONET網站(http:psbweb05.psb.ugent.beconettutorial4.php)上提供的指南進行網絡構建. 參數設置如下：每個OTU至少進行30個序列的預處理和過濾，4個相似性度量(Spearman，Pearson，Kullbackleibler和Bray-Curtis)，自動設置閾值并將錯誤發現率(FDR)校正設置為0.05，導出鄰接矩陣，用鄰接矩陣來編碼每對節點之間的連接關系，對每一條邊進行100次的Permutation和 Bootstrap顯著性檢驗.

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質和細菌16S rRNA基因拷貝數

在各土層中，TD、QY和LZ土壤中的TN、SOC和SOM含量均高于JG，特別是QY，其3層土壤中的平均TN、SOC和SOM含量與JG相比分別提高了近50%、40.33%和40.26%. 與JG相比，QY表層土壤和LZ中層土壤細菌16S rRNA基因拷貝數分別提高了近1.51倍和0.64倍(見圖1). TD土壤細菌16S rRNA基因拷貝數沿剖面深度無顯著變化. 值得注意的是：4種水保措施下土壤中的TN、SOC和SOM含量均沿剖面深度呈下降趨勢，而QY表層土壤中的TN、SOC和SOM含量在4種水保措施下均顯著最高，且這3個指標均與細菌16S rRNA基因拷貝數呈顯著正相關(見表1). 此外，與TD、QY和LZ相比，JG僅底層土壤中的TP含量與土壤細菌16S rRNA基因拷貝數較大，且二者呈顯著正相關(見表1).

2.2 土壤細菌群落多樣性

將柑橘果園不同水保措施下12個土壤樣品中的質控后序列按97%相似性進行聚類，得到的細菌優化序列總數為 623 653，有效序列范圍為 42 776～61 081. 各樣品文庫的覆蓋率(Coverage)均近99%，說明此次研究樣品的基因序列檢出率較高，測序結果能夠真實反映柑橘果園不同水保措施土壤細菌群落的真實情況.

表1 不同水保措施及不同土層土壤細菌16S rRNA豐度和土壤理化性質之間的相關性

圖2 不同水保措施下特有和共有OTU分布的Venn圖Fig.2 Venn diagram showing the unique and shared operational taxonomic units (OTU) of bacteria detected in soil samples under different soil and water conservation measures

與JG相比，QY和TD對柑橘果園土壤細菌均勻性、多樣性和豐富度均產生了更積極的影響. 圖2顯示了4種水保措施下土壤樣品中獨有的和共有的OTU數量. 與JG相比，TD、QY和LZ土壤中獨有的細菌OTU數量分別為920、973和812個. 盡管QY對底層土壤細菌多樣性沒有明顯影響，但與其他水保措施相比，QY表層土壤細菌Shannon-Wiener指數和中層土壤細菌Chao1指數均分別為最高，而TD中底層土壤細菌Shannon-Wiener指數和表層土壤細菌Chao1指數分別為最高(見表2). 此外，與TD、QY和LZ相比，JG各層土壤細菌Shannon-Wiener指數均為最低(見表2). 相關性分析表明，TN含量、pH、SOC含量、SOM含量均與Shannon-Wiener指數呈顯著正相關，而與Chao1指數無顯著相關性(見圖3). 在不同水保措施下，土壤細菌群落結構可通過基于Bray-Curtis距離的PLS-DA分析明顯區分，并聚成4個類群(見圖4).

表2 不同水土保持措施下土壤細菌群落多樣性指數(Shannon-Wiener)和物種豐富度指數(Chao1)

注：TD-1、TD-2、TD-3分別表示TD措施下表層、中層、底層土壤，其他以此類推.圖4 不同水保措施下土壤細菌群落結構差異(PLS-DA分析)Fig.4 Difference of bacterial community structures under different soil and water conservation measures (Partial Least Squares Discriminant Analysis)

2.3 土壤細菌群落組成

高通量測序得到的3 531條OTUs分屬于34門、93綱、230目、368科、616屬和1 241種. 圖5為門水平上的細菌分類，結果顯示，4種水保措施的優勢菌門包括綠彎菌(Chloroflexi，占比為28.39%～45.32%)、酸桿菌(Acidobacteria，占比為13.20%～23.31%)、變形菌(Proteobacteria，占比為14.65%～22.95%)和放線菌(Actinobacteria，占比為7.20%～11.26%)，占細菌序列的80%以上. 在不同水保措施和土層之間，單個細菌類群的相對豐度差異明顯. 與TD、QY和LZ相比，JG土壤中Chloroflexi的相對豐度較高，而Acidobacteria和Proteobacteria的相對豐度較低. 在表層土壤中，QY與JG土壤中Proteobacteria以及QY與LZ土壤中Acidobacteria的相對豐度均較高. 除Chloroflexi相對豐度增加外，不同水保措施下土壤中Proteobacteria、Acidobacteria(TD除外)和Actinobacteria的相對豐度均沿剖面深度呈減少趨勢.

圖6為環境因子對主要門分類種群(平均相對豐度大于1%)的冗余分析結果. 由圖6可見，第一主軸解釋了門分類群落59.30%的方差變化，第一主軸和第二主軸共解釋了61.69%的方差變化. 其中，TN含量對門分類種群影響的顯著性最高(P=0.002)，其次為SOC和SOM含量(P=0.005). pH和TP含量的影響均不顯著(P分別為0.086和0.445). 所以TN、SOC和SOM含量(尤其是TN含量)是影響不同水保措施下柑橘果園土壤細菌群落組成的主要環境因子. TN、SOC、SOM含量均與Chloroflexi的相對豐度呈顯著負相關，與Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria的相對豐度均呈顯著正相關.

2.4 土壤細菌群落交互作用

注： 平均相對豐度低于1%以下的部分合并，并用others表示.圖5 不同水保措施下土壤細菌群落門水平分類Fig.5 Phylum-level taxonomic composition of the bacterial community under different soil and water conservation measures

圖6 不同水保措施下細菌門分類群落與環境因子的冗余分析結果Fig.6 Redundancy analysis of bacterial phyla and environmental parameters under different soil and water conservation measures

為了探索不同水保措施對土壤細菌群落交互作用的影響，筆者使用網絡分析法分析了4種水保措施下土壤細菌的共生模式. 結果(見圖7)顯示，在不同水保措施下，土壤細菌群落交互作用網絡共檢測到21個細菌菌門，其中Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria和Chloroflexi為主要節點. 根據Layeghifard等[18]的研究，連通性最高的細菌門通常被認為是網絡中的核心菌群. 筆者發現不同水保措施下土壤細菌交互作用的核心菌群均為Proteobacteria(見圖7). 與JG相比，TD、QY和LZ土

壤細菌群落交互作用網絡的節點數和負正相關連線數比較高，其中QY的節點數比JG多約47.6%(見表3)，表明TD、QY和LZ對土壤細菌群落交互作用網絡的影響均強于JG，尤其是QY. 特別重要的是，與TD和LZ相比，QY土壤細菌群落交互作用網絡的節點數(186個)和連線數(283條)均較高(見表3)，表明QY的網絡更大、更復雜，且更高的平均聚類系數(0.348)和模塊數(15個)使得節點之間的聯系更加緊密，網絡更加模塊化. 而與QY相比，TD的平均聚類系數較低，僅為0.121，且LZ的平均路徑長(2.08)和平均連通度(2.91)均較小(見表3). 此外，與TD、QY和LZ相比，JG土壤細菌群落交互作用網絡的節點數最少，連線數卻最高(見表3)，特別是Proteobacteria、Acidobacteria和Actinobacteria之間的聯系更緊密(見圖7)，表明JG可以促進細菌菌群之間的交互作用，尤其是合作.

表3 不同水保措施下土壤細菌群落的交互作用網絡參數

注： 紅線和綠線分別表示顯著正相關(Spearman相關，P<0.05，R>0.8)和顯著負相關(Spearman相關，P<0.05，R<-0.8)；點的大小代表細菌相對豐度的多少.圖7 不同水保措施下土壤細菌群落的分子生態網絡Fig.7 Molecular ecological networks of bacterial communities under different soil and water conservation measures

3 討論

3.1 水保措施對土壤細菌豐度和多樣性的影響

該研究發現，與其他水保措施相比，狗牙根全園覆蓋(QY)增加了表層土壤細菌數量，豐富了中表層土壤細菌種類，而狗牙根條帶覆蓋(TD)下中底層土壤細菌種類最多，二者是增加柑橘果園土壤細菌多樣性的有效水保措施. 由于土壤微生物群落對生態系統服務具有重要作用[2]，因而在土壤微生物群落中16S rRNA基因拷貝數較高是有益的. 與凈耕果園(JG)相比，狗牙根全園覆蓋(QY)顯著提高了表層土壤中的TN、SOC和SOM含量，且土壤細菌16S rRNA基因拷貝數提高了近1.51倍(見圖1). 狗牙根草通過固定大氣中的氮，增加了土壤TN含量，這一結果與Reckling等[19]的報道相似. 植物殘渣和凋落物會作為新鮮有機質被摻入土壤中，促進SOC和SOM含量增加并改善土壤質量. 草根和根系分泌物在SOC和SOM的積累中也起著十分重要的作用[20]. 相關性指數分析(見表1)顯示，TN、SOC和SOM含量是表層土壤細菌16S rRNA基因拷貝數的驅動因素，因此狗牙根全園覆蓋(QY)下表層土壤中具有更高的TN、SOC和SOM含量可以解釋細菌生存和繁殖所需的營養來源.

雖然與其他水保措施相比，狗牙根全園覆蓋(QY)下底層土壤細菌的Chao1指數最小，但其對底層土壤細菌多樣性沒有明顯影響，這與ZHONG等[21]的結論存在差異. 而狗牙根全園覆蓋(QY)中表層土壤細菌Shannon-Wiener指數更高，相關性分析(見圖3)表明研究區的TN、SOC、SOM含量均與Shannon-Wiener指數呈顯著正相關，這表明與其他水保措施相比，狗牙根全園覆蓋(QY)增加了土壤中的TN、SOC和SOM含量，從而適度干擾了細菌群落，降低了種群之間競爭性生態位的排除和選擇機制，增加了多種物種在不直接爭奪資源的情況下緊密共存的可能性，碳源利用和代謝活性的改善最終促進了其中表層土壤細菌多樣性以及物種豐富度的增加. ZHONG等[21]也認定全園覆蓋是有益的. 與其他水保措施相比，狗牙根全園覆蓋(QY)下土壤細菌群落在土壤剖面深度上的差異性最大(見圖4). 這可能是由于在根際之外，土壤細菌的活性相對較小，草根分泌物有利于改善細菌多樣性[22]. 狗牙根全園覆蓋(QY)的草根根系密度較大，富含碳的狗牙根根系分泌物可能激活了土壤細菌的活性，因此具有更高的細菌多樣性. 與其他水保措施相比，狗牙根條帶覆蓋(TD)下土壤細菌16S rRNA基因拷貝數雖較小，但其中底層土壤細菌Shannon-Wiener指數最高. 魏常慧等[23]亦表示條帶覆蓋的中底層土壤蘊藏著豐富的物種. 因此，筆者認為，狗牙根條帶覆(TD)蓋能改善中底層土壤細菌多樣性，其較少的土壤擾動也意味著能更好地保護土壤結構，促進SOC固存和團聚體穩定. 而與狗牙根全園覆蓋(QY)相比，經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)表層細菌數量和多樣性均較少，這可能是由于其土壤的頻繁擾動增加了土壤中凋落物數量和根系分泌物，提高有機質輸入量并降低了碳氮比，從而刺激表層土壤細菌群落的特定功能并降低了細菌多樣性.

此外，相關性指數分析(見表1)表明，TP含量是底層土壤細菌16S rRNA基因拷貝數的驅動因素，因而與狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)相比，底層土壤TP含量更高的凈耕果園(JG)其底層細菌16S rRNA 基因拷貝數顯著更大. 但與DONG等[10]研究結果不同的是，與狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)相比，凈耕果園(JG)各層土壤細菌的Shannon-Wiener指數均最低，這表明其對各層土壤干擾較大，土壤細菌均質化嚴重.

3.2 水保措施對土壤細菌群落組成的影響

該研究發現，不同水保措施改變了柑橘果園土壤細菌群落在土壤剖面上的組成，土壤細菌群落差異顯著，TN、SOC和SOM含量(尤其是TN含量)是主要影響因素. 高通量測序結果(見圖5)表明，4種水保措施下土壤細菌優勢菌門中相對豐度最高的是Chloroflexi，其次為Acidobacteria、Proteobacteria和Actinobacteria，這與已有研究結果[24-26]一致. TN含量是4種水保措施下土壤細菌群落最主要的影響因素，因而Chloroflexi最高的相對豐度可以通過它對TN含量的高需求性來解釋[27]. 值得注意的是，與狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)相比，凈耕果園(JG)土壤中Chloroflexi的相對豐度較大，冗余分析結果(見圖6)表明，Chloroflexi的相對豐度與TN、SOC和SOM含量均呈顯著負相關；與凈耕果園(JG)相比，狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)土壤中Acidobacteria和Proteobacteria的相對豐度較大，冗余分析結果(見圖6)顯示，上述細菌的相對豐度與TN、SOC和SOM含量均呈顯著正相關. 以上分析表明，水保措施可以通過影響某些土壤特性來改變細菌群落結構，TN、SOC和SOM含量(尤其是TN含量)的差異是造成柑橘果園土壤細菌群落差異的主要原因. 這與DONG等[10]的研究結果相似，TN含量是影響不同種植系統中土壤群落差異的最重要因素之一. SOC和SOM在其他塑造細菌群落中的重要性也已有報道[28]. 此外，Chloroflexi是嗜熱菌，在高溫下生長良好，在有機物的分解中具有重要作用[29]. 柑橘果園土壤容易暴露在陽光下，因此Chloroflexi的相對豐度最高，尤其是凈耕果園(JG). Chloroflex是多糖的主要降解菌，主要生長在低氧土壤中[30]，在果園缺氧區多糖降解中起著重要作用. 凈耕果園(JG)致密的表層土壤易將植物根部的生長限制在表層[31]，從而導致土壤微生物的氧氣供給不暢.

除Chloroflexi的相對豐度增加外，不同水保措施下Proteobacteria、Acidobacteria〔狗牙根條帶覆蓋(TD)除外〕和Actinobacteria的相對豐度均沿剖面深度呈減少趨勢. Proteobacteria主要分布在植物凋落物和根系分泌物中，與高碳利用率有關，在碳循環中起關鍵作用，富營養特性明顯[32-33]. 成長快速的富營養菌群豐度在富營養條件下更容易增加[34]，因而Proteobacteria在營養狀況較好的狗牙根全園覆蓋(QY)表層土壤中更為豐富. 隨著土壤深度增加，筆者發現中底層土壤逐漸轉為貧營養的Chloroflexi，其在增加的同時也抑制了其他富營養菌的生長. 如果說碳是細菌的能量來源，那么氮則是養分循環的關鍵部分. Chloroflexi對土壤氮的需求很高，但無法固定氮[27]. 因此能礦化氮的Chloroflexi的相對豐度與土壤TN含量呈顯著負相關(見圖6)，其可能與作物在爭奪氮資源. Acidobacteria屬貧營養細菌，是全球碳循環的重要參與者，不但具有降解復雜和難降解的碳化合物的能力，還能夠利用NO3--N作為氮源[35-36]. 狗牙根條帶覆蓋(TD)中底層土壤TN含量較高，因而Acidobacteria的相對豐度沿剖面深度呈增加趨勢. LIU等[37]發現TN、SOC和SOM含量均與Actinobacteria的相對豐度存在正相關關系，這與筆者所得研究相似. 但Sul等[38]觀察到Actinobacteria在較低的SOC位點更為豐富，原因可能在于不同研究區的生態系統或SOC含量范圍有所不同.

3.3 水保措施對土壤細菌群落交互作用的影響

該研究發現，Proteobacteria是4種水保措施下土壤細菌交互作用的核心細菌，狗牙根全園覆蓋(QY)的土壤細菌群落交互作用網絡的穩定性優于其他水保措施. 與其他優勢菌門相比，作為擁有富營養優勢的Proteobacteria可能具有更寬的生態位寬度和更高的抗干擾能力，在土壤細菌群落交互作用網絡的穩定性維持中起著主導作用. 而其他非優勢菌門可以作為多樣化的庫來增強細菌的抗逆性和抵抗環境干擾的能力[39]. 因此，水保措施可能會重塑土壤中復雜的細菌群落交互作網絡. 模塊數量增多，表明生態位越多，網絡模塊化可以增強網絡在環境擾動下的穩定性[40]. 當4種水保措施中模塊數量最多的狗牙根全園覆蓋(QY)受到外界環境干擾時，細菌菌群更容易通過相互合作應對環境干擾. TIAN等[41]認為更大的網絡復雜性可以穩定混合交互的細菌群落，提高資源的轉移效率. 與經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)和狗牙根條帶覆蓋(TD)相比，狗牙根全園覆蓋(QY)的土壤細菌群落交互作用網絡具有更大的網絡直徑、更長的平均路徑和更大更復雜的網絡(較多的節點數和連線數)，這種變化增加了生態位寬度，增強了土壤微食物網中不同細菌之間的相互聯系，有助于其更有效地利用土壤養分. 由于生態位重疊，土壤碳輸入的選擇效應可能加劇共存種群之間的養分競爭，而營養競爭是代謝能力相似的物種間拮抗互作的主要驅動因素之一[42]，最大碳輸入使狗牙根全園覆蓋(QY)土壤潛在競爭對手之間的養分競爭加劇，土壤細菌群落交互作用的穩定性最好. 而與狗牙根全園覆蓋(QY)相比，經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)土壤細菌群落交互作用網絡的平均連通度更小，狗牙根條帶覆蓋(TD)土壤細菌群落交互作用網絡的平均聚類系數更低，這表明二者土壤細菌群落的交互作用網絡易受外界環境的干擾，細菌群落內部的資源競爭在土壤中較弱，土壤細菌群落交互作用的穩定性較差.

此外，與狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)相比，當負正相關連線數比較低的凈耕果園(JG)環境發生擾動時，其土壤細菌群落的交互作用網絡會在很短的時間內將環境擾動傳遞到整個網絡，導致網絡結構不穩定. 同時這種不穩定的網絡可能導致參與土壤碳氮等養分循環的細菌物種群落發生顯著改變[43]，進而影響植被生長. 因而土壤底部養分較差的凈耕果園細菌群落只能通過減少競爭和加強合作來應對環境壓力，特別是Proteobacteria、Acidobacteria和Actinobacteria. 與其他3種水保措施相比，凈耕果園(JG)雖然增加了網絡的正負相關連線數量，但各層土壤細菌Shannon-Wiener指數均最低. 筆者推測，細菌多樣性的減少可能會促進柑橘果園土壤中部分細菌(主要節點)之間相互作用的頻率和幅度，但土壤細菌群落交互作用網絡的穩定性隨之變差. 凈耕果園(JG)復雜的土壤細菌群落交互作用多集中在部分細菌(Proteobacteria、Acidobacteria和Actinobacteria)之間，而大多細菌物種被排除在交互作用之外，這可能導致了細菌多樣性的喪失. 同時，這些較強的交互作用降低了細菌群落交互作用網絡的穩定性，也為細菌群落間的交互作用、多樣性和穩定性之間提供了一種機制聯系[44].

4 結論

a) 與凈耕果園(JG)相比，狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)各土層土壤中的TN、SOC和SOM含量均呈增加趨勢，狗牙根全園覆蓋(QY)對土壤養分的貢獻最大. 與經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)和凈耕果園(JG)相比，狗牙根全園覆蓋(QY)增加了表層土壤細菌數量，豐富了中表層土壤細菌種類，狗牙根條帶覆蓋(TD)提高了中底層土壤細菌多樣性，二者是增加柑橘果園土壤細菌多樣性的有效水保措施.

b) 不同水保措施改變了柑橘果園土壤細菌群落在土壤剖面上的組成. 除Chloroflexi的相對豐度增加外，不同水保措施下Proteobacteria、Acidobacteria〔狗牙根條帶覆蓋(AD)除外〕和Actinobacteria的相對豐度均沿剖面深度呈減少趨勢. 凈耕果園(JG)導致厭氧細菌(Chloroflexi)的含量增加，后者可能與作物在爭奪氮資源. 狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經濟作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)均提高了參與碳循環細菌的相對豐度，其中包括Acidobacteria和Proteobacteria. 不同水保措施下土壤細菌群落差異顯著，TN、SOC和SOM含量(尤其是TN含量)是主要影響因素.

c) Proteobacteria是4種水保措施下土壤細菌交互作用的核心細菌，狗牙根全園覆蓋(QY)的土壤細菌群落交互作用網絡的穩定性優于其他水保措施.

d) 狗牙根全園覆蓋(QY)提高了土壤中的TN、SOC和SOM含量，增加了土壤細菌多樣性，增強了土壤細菌群落交互作用的穩定性. 因此，筆者鼓勵采取狗牙根全園覆蓋(QY)，這一結果將進一步為土壤生態系統研究提供參考. 但狗牙根全園覆蓋(QY)對土壤的細菌多樣性和細菌群落交互作用等影響非常復雜，在不同的土壤類型和氣候條件下是否具有普遍有效性有待于進一步研究.