分階段接菌對中藥殘渣堆肥腐熟度及微生物多樣性的影響

陸曉林， 白紅艷， 張愛悅， 戴傳超， 馬 艷， 賈 永*

1.南京師范大學生命科學學院， 江蘇 南京 210023 2.江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所， 江蘇 南京 210014

近年來，隨著中藥資源的開發和應用，我國中藥殘渣每年產量達到千萬噸[1]. 中藥殘渣本身含有大量有機物質和營養，可作為理想生物質資源的原材料. 堆肥作為一種有效且環保的方法，可以將有機廢棄物轉化為優質有機肥或土壤改良劑，用于農業和園藝生產[2]. 已有研究表明，在堆肥過程中接種外源微生物通常能促進有機質的生物降解，縮短堆肥時間，提高堆肥腐熟度[3-4]，但在堆肥過程中發現傳統的一次性添加菌劑方式不僅大大降低了堆肥效率，且堆肥產品質量也得不到保障[5].

研究[6-7]表明，不同堆肥時期的堆體理化性質和營養特性會對堆體優勢微生物種群產生影響. 在嗜溫期，Bacillus(芽孢桿菌屬)、Aspergillus(曲霉屬)及Pseudomonas(假單胞菌屬)的大量繁殖與有機碳和有機氮的變化均呈顯著相關[1,6,8]；在嗜熱期，大量分布的Bacillus、Saccharomycetales_unclassified(酵母菌屬)及Thermoascus(熱子囊菌屬)受到堆體含水率、pH和EC的顯著調控[1,7,9]；在腐熟期，Proteobacteria(變性菌門)一般大量分布，且有機質含量、溫度、氨態氮含量及總磷含量分別對Streptomyces(鏈霉菌屬)、Trichoderma(木霉屬)、Penicillum(青霉屬)和Sphingobium(鞘脂菌屬)等優勢種群具有顯著影響[10-13]. 不同堆肥階段優勢微生物菌群差異顯著，這可能與不同堆肥階段所需的功能菌群不同有關[12]. 因此，外源性功能微生物菌劑的添加種類應根據不同堆肥時期及堆體的養分情況有所差異. 此外，傳統一次性接菌的方式容易在多個菌株間產生拮抗作用，不利于微生物菌劑功能的發揮[5,13]. 不同堆肥階段接種不同的微生物菌劑，有利于菌劑中不同菌株間拮抗作用的減小，最大化地發揮其功能. 此外，嗜熱期細菌和真菌的多樣性與堆體元素關鍵酶(如木素過氧化物酶、漆酶、脫氫酶和蛋白酶)密切相關，顯著影響堆肥過程中養分的變化[14-15]. 因此，闡明嗜熱期微生物多樣性及其與環境因子的相互關系對于促進堆肥效率具有重大意義. 已有研究發現，僅在降溫期，接種放線菌能顯著提高放線菌多樣性并加強與土著放線菌菌群的協同關系，從而促進有機質的降解[16]；接種Phanerochaetechrysosporium(黃孢原毛平革菌)可顯著提高腐殖質含量、促進木質纖維素的降解[17]，但對于堆肥過程中，分階段添加不同的功能微生物菌劑對堆肥品質及其微生物區系的影響還有待深入研究.

該研究通過在中藥殘渣大規模堆肥過程的嗜溫期、嗜熱期、腐熟期分別接種不同的功能微生物菌劑，探索分階段接菌對中藥殘渣木質纖維素降解、腐熟度和產品品質的影響，分析其對不同堆肥階段優勢功能菌群的影響，以期為構建高效降解木質纖維素的復合微生物菌劑的添加提供新的接菌方式和理論依據.

1 材料與方法

1.1 供試材料

堆肥體系中的主要物料成分為青蒿、金銀花、茯苓、桂枝、桃仁、元胡、川穹、平貝、獨活和牡丹皮(質量比為88∶44∶11∶11∶11∶10∶10∶7∶7∶21)，氮含量為1.77%，碳含量為40.43%，碳氮比為22.84，含水率為69.47%. 該試驗于2017年11月14日在江蘇省東海縣好徠斯生物科技有限公司進行，堆肥試驗持續136 d. 室內溫度始終維持在20 ℃左右且裝有通風換氣裝置，以保證室內外空氣充分流通.

1.2 供試菌株與培養方法及固態菌劑制備

所用供試菌種信息如表1所示，其中，LG-1、LG-2、LG-4三種菌株能參與木質纖維素降解途徑[1,9,18]，SM-1和SQ-1菌株在室內耐受高溫且能利用纖維素. 細菌(LG-1)、真菌(LG-2、LG-3、LG-4)和放線菌(SM-1和SQ-1)菌懸液的制備及培養條件參照文獻[3,13]. 將50 mL LG-1、LG-2、LG-3、LG-4、SM-1和SQ-1菌液(菌液濃度均超過1×108CFUmL)分別與麥麩鋸木屑復合物混合(二者質量比為2∶1)，于28 ℃下發酵1周，得到中藥殘渣降解復合菌劑，其含水率約60%.

1.3 試驗設計

將新鮮復配的中藥殘渣建成長×寬×高分別為8.0 m×2.0 m×1.5 m的條剁堆體，堆體質量接近10 t. 試驗分為3個處理，包括2個接菌處理(接菌量為干物料的0.1%)和1個對照處理，共設置3個堆體. 其中，M0堆體作為對照(CK)，添加等量的無菌且相同水分、碳含量、氮含量的麩皮鋸木屑發酵基質；M1堆體采用分階段接菌(multi-stage inoculation)策略，菌種的接種順序根據堆體在3個不同時期的典型功能微生物種群來確定，即堆體建立初期(0 d)接入LG-1和LG-2，進入高溫期 (10 d) 時接入LG-3和LG-4，進入降溫腐熟期(109 d)時接入SM-1和SQ-1；對于M2堆體采用一次性接菌(single-stage inoculation)處理，建立之初即將LG-1、LG-2、LG-3、LG-4、SM-1和SQ-1菌劑全部接入. 分別在堆肥發酵的第0、18、45、67、77、109、136天取樣，距堆體頂端50～80 cm處分5點采集樣品，并將樣品混合均勻. 樣品一部分保存于4 ℃冰箱，一部分保存于-20 ℃冰箱. 整個好氧堆肥的供氧方式為翻堆和鼓風供氧相結合，試驗堆體分別在第0、4、9、20、32、45、55、64、80、103、109、117天進行翻拋.

表1 中藥殘渣堆肥供試菌劑

1.4 理化參數分析

堆體溫度于每天10:00和16:00檢測并記錄. 堆肥樣品的含水率(moisture content, MC)和pH測定參照WANG等[7]的方法進行；發芽指數(germination index, GI)采用20顆蘿卜種子(廣東-短葉十三)，并參照TIAN等[1]的方法進行測定；總有機碳(total organic carbon, TOC)含量、碳氮比(carbon to nitrogen, CN)、有效磷(available phosphorus, AP)和總磷(total phosphorus, TP)含量的測定參照WEI等[10]方法進行；腐殖質(humic substances, HS)的提取及其含量測定參照WU等[19]方法進行；堿解氮(alkali hydrolysis nitrogen, AN)含量參照TANG等[20]方法進行測定；速效鉀(available potassium, AK)含量的測定參照ZHAO等[21]方法進行.

1.5 木質纖維素降解率及相關酶活測定

纖維素降解率(cellulose degradation ratio, CDR)、木質素降解率(lignin degradation ratio, LDR)、纖維素酶活性(cellulase activity, CA)、木聚糖酶活性(xylanase activity, XA)和錳過氧化物酶活性(manganese peroxidase activity, MnP)檢測均參照WEI等[15]方法進行. β-糖苷酶活性(β-Glucosidase activity, β-Glu)的測定參照DU等[14,22]方法進行. 纖維素酶活性以1 g鮮樣的1 mL粗酶液30 min水解底物生成1 μmol還原糖量記1個酶活單位(U). 對于錳過氧化物酶活性，于290 nm處5 min內測定其吸光度的變化率，以每分鐘OD變化0.001為1個酶活單位(U). 木聚糖酶活以1 g鮮樣的1 mL粗酶液30 min水解木聚糖每釋放0.1 mg木糖為1個酶活單位(U). β-糖苷酶活性將不加粗酶液的反應體系作為對照，將每個處理的含粗酶液體系比對照體系OD值大于0.01記為1個酶活單位(U).

1.6 變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)分析

采用土壤DNA試劑盒(MP Biomedicals, USA)對堆肥原料(composting materials, CM)及堆肥樣品〔(嗜溫期(18 d)、嗜熱期(45 d)和腐熟期(136 d)〕提取總DNA并檢測其質量[22]. PCR擴增及DGGE電泳程序參照WEI等[5,23]方法進行.

1.7 數據處理與統計分析

采用SPSS 17.0和Origin pro 2017C軟件對理化性質和酶活數據統計分析并作圖. 采用Quantity One 4.5軟件分析DGGE圖譜中泳道內DNA條帶的信號強度. Shannon-Wiener多樣性指數(H′)用于表示不同堆肥樣品微生物菌群結構的α-多樣性.

(1)

式中，Pi為條帶i在泳道的相對信號強度. 采用PCoA分析不同堆肥樣品菌群組成的β-多樣性. 使用Canoco 5.0軟件對環境因子與菌群多樣性之間進行冗余分析. 不同數據組間差異顯著性采用Duncan法檢驗(α=0.05)，試驗數據用平均值(mean)±標準誤(standard deviation, SD,n≥3)表示.

2 結果與分析

2.1 接種對堆肥過程中理化性質及腐熟度的影響

結果表明，M1處理在20 d時堆體溫度超過50 ℃(51.2 ℃)，較M0處理和M2處理分別提前1 d和2 d〔見圖1(A)〕. 此外，M1處理下整個堆肥期間的最高溫度為67.8 ℃，M0和M2處理分別為66.9和66.8 ℃. 127 d時，M1處理下溫度開始降至60 ℃以下，較M0和M2處理分別提前4和5 d. 因此，M1處理可顯著提高堆體溫度和縮短發酵周期. 由圖1(B)可見，在67 d時，M1處理下的發芽指數為83.61%，顯著高于M0處理(65.05%)和M2處理(70.95%)(P<0.05)，說明M1處理下能促進物料的腐熟(發芽指數>80%)，并且有效降低堆肥產品的植物藥害性.

由表2可見：堆肥前期(0～45 d)各處理下pH的變化范圍為4.11～4.38，這可能與物料含有較高的酒石酸、乙酸、草酸和蘋果酸等有機酸有關[24]；在堆肥嗜熱期(45～77 d)，由于微生物分解有機酸和蛋白質產生氨態氮的代謝活動加強，促使pH快速上升；在77 d 時，M0、M1和M2處理的pH分別為7.76、7.68和7.52；隨后在77～109 d，各處理下pH均出現明顯下降，表明此期間氨態氮的釋放速率遠小于硝態氮的固定速率，且M1處理能顯著促進堆體氨態氮的釋放，穩定堆體在較高的pH(P<0.05)，這利于微生物活力的提高[25]；最終在136 d時，各處理pH保持在7.58～7.91之間. 在136 d時，M1處理下的總有機碳損失率為53.86%，顯著高于M0處理(41.91%)和M2處理(40.11%)(P<0.05)，分階段接菌促進了有機碳的礦化過程. 這可能與M1處理下嗜熱階段擁有更高的溫度和微生物代謝活性有關. 0～136 d內，各處理碳氮比急劇下降. 堆肥結束(136 d)時，M0、M1和M2處理下的碳氮比分別為9.17、8.29和9.81，均符合堆肥腐熟度要求(碳氮比<20)[1]. 腐殖質通常包含一個或多個官能團的芳香族化合物，其能提高物料的保水性能、調節堆體pH和養分狀況[26]. 在109 d時，M1處理的腐殖質含量為175.07 gkg，顯著高于M0處理(157.78 gkg)和M2處理(163.20 gkg)(P<0.05). 而M0處理在77～136 d內，腐殖質含量從161.60 gkg降至150.92 gkg,這反映了堆肥后期M0處理堆體內較高的不穩定有機化合物正在進行生物降解. 堆肥結束(136 d)時，M1、M2和M0處理較堆肥前的腐殖質含量分別增加了50.20%、47.20%和16.82%. 因此，分階段接菌促進了有機碳的生物降解和腐殖化過程. 此外，在M1處理中，嗜溫期0～18 d堆體TP濃度出現明顯的“富集效應”，其含量達5.51 gkg；并且分階段接菌明顯促進了整個堆肥過程中堿解氮的含量及堆肥后期77～136 d內速效鉀的積累(見表3).

注： 數值為平均值±標準誤(P<0.05). 小寫字母表示相同堆肥階段下不同接菌處理的顯著性差異. 下同.圖1 堆肥過程中堆體溫度和發芽指數的變化Fig.1 The changes of pile temperature and GI during composting

表2 不同接菌處理對堆肥過程中含水率、pH、總有機碳含量、總氮含量、碳氮比和腐殖質含量的影響

表3 不同接菌處理對堆肥過程中堿解氮、速效鉀、有效磷和總磷含量的影響

2.2 接種對堆肥木質纖維素生物降解的影響

該研究表明，纖維素降解率在接菌組與對照組之間差異顯著(P<0.05)〔見圖2(A)〕. 堆肥結束時各處理纖維素降解率表現為M2處理(40.88%)

圖2 堆肥過程中木質纖維素降解率及其相關酶活性的變化Fig.2 Changes of cellulose and lignin degradation ratio and related enzyme activities during composting

堆肥過程中，各處理下纖維素酶活性在堆體建立初期(0 d)保持較低水平，隨后明顯升高〔見圖2(C)〕. 此外，在0～45 d內M1處理比M2處理和M0處理均表現出較高的纖維素酶活性. 由圖2(D)可見，所有處理在45 d前木聚糖酶活性均較高，隨后波動下降. 因此，堆肥初始物料中存在的大量易降解的有機物質被微生物所利用，促進了微生物的生長和酶的合成，從而導致木質纖維素在堆肥前期的生物降解. 由圖2(E)可見：堆體建立初期(0 d)，M1處理下β-糖苷酶活性為10.28 U，顯著高于M2處理(2.38 U)和M1處理(2.66 U)(P<0.05)；0～67 d，M1處理下的β-糖苷酶活性始終最高，表明分階段接菌可能促進了堆肥過程中微生物菌群的共代謝能力. 此外，β-糖苷酶活性最高值分別出現在M1處理的0 d (10.28 U)、M2處理的77 d (7.52 U)以及M0處理的18 d (6.35 U)，這種差異可能是因堆體溫度影響了微生物生長及代謝類型所致. 過氧化物酶能夠利用H2O2作為電子受體，參與木質素或多環芳烴的降解，并在堆肥過程中木質纖維素等復雜化合物的降解上發揮重要作用. 由圖2(F)可見，錳過氧化物酶活性變化與纖維素酶活性變化相似，伴隨著堆肥的進行，錳過氧化物酶活性逐漸升高，表明微生物降解木質素主要在堆肥后期. M1、M2、M0處理下錳過氧化物酶活性最大值分別為22.07、7.93和6.60 U，且在67～109 d M1處理中錳過氧化物酶活性顯著高于M0處理和M2處理(P<0.05).

2.3 接種對堆肥過程中微生物菌群多樣性的影響

該研究利用DGGE分析了堆肥過程中細菌〔見圖3(A)～(D)〕和真菌〔見圖3(E)～(H)〕群落結構的變化. 與堆肥原料(CM)相比，嗜溫期不同處理之間細菌條帶數量總體增加且差異顯著，表現為時間和環境對堆肥細菌菌群的雙重影響. 由表4可見：在嗜溫期，M0和M1處理下細菌Shannon-Wiener多樣性指數分別為2.04和1.66，高于M2處理(1.29)，但二者之間沒有顯著性差異；在嗜熱期和腐熟期，M1處理下細菌Shannon-Wiener多樣性指數分別為2.04和2.01，顯著高于其他處理(P<0.05). 這表明分階段接菌促進了堆肥后期耐熱性細菌的生長. 而對于真菌群落而言，與堆肥原料(CM)相比，嗜溫期所有處理條帶數量均明顯減少，各處理下真菌Shannon-Wiener多樣性指數均較低，說明從第1天開始堆肥環境的變化就引起了真菌多樣性的降低；之后，嗜熱期各處理下真菌的Shannon-Wiener多樣性指數增加，M0、M1和M2處理下分別為1.69、2.09和2.15，但各處理之間沒有顯著性差異.

圖3 堆肥過程中細菌及真菌菌群結構的變化Fig.3 The changes of bacterial and fungal community during composting

表4 不同接菌處理對堆肥過程中微生物Shannon-Wiener多樣性指數的影響

圖4 嗜熱期堆體細菌和真菌群落組成的主坐標分析Fig.4 Principal coordinate analysis (PCoA) ordinations of bacterial and fungal community composition in thermophilic stage of composting

鑒于嗜熱期(45 d)不同處理之間纖維素降解率及相關酶活差異顯著，筆者對該階段樣本中細菌和真菌組成進行PCoA分析. 由圖4可見：對于細菌來說，嗜熱期不同處理之間沿成分軸離散程度較高，差異顯著；除M0處理外，同一處理下重復樣本之間集群程度較高，表明接菌處理可以影響堆肥過程中菌群結構的變化. 對于真菌群落而言，不同處理所有樣本之間沿2個成分軸分布均較為分散，但菌群結構差異明顯，接種和樣本的空間異質性可能是影響嗜熱期真菌多樣性的重要因素.

2.4 環境因子與樣本微生物菌群結構的相關性

注： M1-1、M1-2、M1-3為不同處理下的3個生物學重復，以此類推. OTU數字序號與DGGE圖譜上條帶序號對應.AN、AP、AK、TP、CDR、LDR、MC分別代表堿解氮含量、有效磷含量、速效鉀含量、總磷含量、纖維素降解率、木質素降解率、含水率.圖5 嗜熱期堆體微生物群落組成與環境因子的相關性分析Fig.5 Correlation analysis of microbial community composition and environmental factors in thermophilic stage of composting

冗余分析用于闡明環境因子對堆肥嗜熱期細菌和真菌多樣性的影響(見圖5). 由圖5(A)(B)可見，挑選的環境因子解釋了多數細菌菌群的差異. 由圖5(C)(D)可見，環境因子也解釋了多數真菌菌群的差異. 在嗜熱期，不同處理中細菌和真菌群落組成均與各環境因子之間呈顯著相關. 此外，細菌OTU6主要促進木質纖維素降解，其與有效磷(AP)和堿解氮(AK)含量之間均呈正相關；OTU4和OTU8均與堿解氮(AN)含量呈正相關. 冗余分析表明，TP是影響嗜熱期真菌物種多樣性最重要的因素，而pH、堿解氮(AN)、碳氮比、纖維素降解率(CDR)和木質素降解率(LDR)對真菌群落的影響(貢獻率均>9%)均相對較小. 值得注意的是，真菌OTU1、OTU2、OTU3、OTU4和OTU5等主要促進纖維素降解，均與有效磷(AP)含量呈正相關；真菌OTU6、OTU10、OTU15和OTU16等主要促進木質素降解，均與含水率(MC)、堿解氮(AN)含量呈正相關.

3 討論

3.1 接菌對堆肥腐熟度及土著微生物的影響

該研究中，M1處理可顯著促進工業化堆肥過程中溫度、發芽指數、總有機碳降解率、腐殖質含量和堿解氮含量的上升，這很可能得益于不同階段接種合適的微生物菌劑避免了菌群之間的拮抗作用，更有利于促使堆體微生物生物學活性的提高，加快微生物對堆體養分的生物轉運. 研究[17]表明，通過在降溫期接種Phanerochaetechrysosporium可以顯著促進堆體腐殖質含量. SONG等[4]通過在嗜溫期接種抗酸化菌劑能促進堆體早期Bacillus和Escherichia(埃希氏桿菌屬)等土著細菌的富集，從而加快乙酸及丙酸的降解. ZHAO等[13]發現，在嗜熱期接種放線菌也可以極大地促進堆體腐殖質組成的形成. 因此，在合適的堆肥過程中接種微生物能加強外源微生物與堆體底物代謝的相關性.

3.2 分階段接菌促進堆肥發酵過程的機制

此外，堆體蛋白酶、脲酶、磷酸酶、脫氫酶和硫酸酯酶均與關鍵元素轉化密切相關[14]，而木質纖維素的生物降解通常由纖維素酶、木聚糖酶、錳過氧化物酶及β-糖苷酶共同參與[15,27]. 微生物菌劑的分階段接種主要促進了堆肥過程中纖維素酶活性、木聚糖酶活性及錳過氧化物酶活性，從而促進木質纖維素的有效降解. 這可能是由于分階段接菌更能改善菌劑與Mycobacterium(分枝桿菌屬)等土著菌群的競爭關系，增加了微生物多樣性，激活了更多與纖維素降解及腐殖化進程有關的微生物種群，彼此協同互作降解難降解的碳組分[13]. 此外，分階段接菌還會改變堆體有機酸的分布，改善堆肥微環境，進而優化Proteobacteria等細菌群落結構，促進了堆體磷的有效性[5].

3.3 堆肥系統土著微生物特性及其與環境因素的關系

已有研究[26,28]表明，Acinetobacter(不動桿菌屬)、Luteimonas(藤黃單胞菌屬)、Aspergillus、Mycothermus(熱鏈球菌屬)和Remersonia廣泛分布于堆肥嗜熱期.Aspergillus作為嗜熱真菌屬能夠適應溫度和水分的變化，并且某些Aspergillus物種能夠分泌纖維素酶和半纖維素酶促進堆體腐熟[1].Bacillus是一種受溫度影響較小的木質纖維素降解菌，也可大量分布于此時期[29]. 此外，pH、可溶性有機氮、硝態氮、發芽指數及有機質等環境因子對嗜熱期微生物菌群結構影響顯著[8]，如NH3、NO2含量均與Ascomycota(子囊菌門)呈顯著正相關[30]；總氮的富集更利于營造土著細菌菌群與菌劑產生良好互作的微生境，并通過分階段接菌可強化二者的相互影響，從而激發木聚糖酶和漆酶的大量分泌[15]. 已有研究表明，高豐度的Trichoderma在菇渣和豬糞聯合堆肥的嗜熱期可促進纖維素的降解[28]；在干牛糞堆肥高溫期Mycothermusthermophilus作為優勢真菌，通過分泌淀粉酶和脂肪酶參與半纖維素降解途徑[31]. 筆者也發現，嗜熱期真菌多樣性高于細菌多樣性，且存在更多與木質纖維素降解呈正相關的真菌條帶. 筆者推測，真菌群落對于中藥殘渣生物降解的貢獻率更加突出，同時基于菌群與環境因素的關系，可通過改變外部養分供給、調控堆肥理化狀況，從而優化菌群結構，促進在較冷氣候下中藥殘渣的堆肥效率. 因此，后續研究應更加側重于分階段接菌處理對堆肥發酵過程中菌群種屬的分析及其促進堆肥發酵過程的機制研究，從而提高產品在大田農業生態系統中的應用價值.

4 結論

a) 與不接菌和一次性接菌處理相比，分階段接菌可以顯著提高堆體溫度至67.8 ℃及增加堆體中木質纖維素降解酶活性，從而促進堆體腐熟進程，136 d的堆肥產品中腐殖質含量增長了50.20%.

b) 在分階段接菌處理中，嗜溫期0～18 d堆體TP含量出現明顯的“富集效應”，其含量達5.51 gkg，嗜熱期真菌種群多樣性顯著受到堆體中環境因子的影響，且與堆體中木質纖維素的生物降解密切相關.

c) 隨著微生物高通量測序技術的出現，在隨后的研究中可結合活體培養技術，對分階段接菌處理條件下不同堆肥階段的關鍵功能菌群變化及其影響因素進行研究，并進一步分析其改善堆肥進程及堆肥產品品質的內在機制.