芽孢桿菌B01固態(tài)發(fā)酵及其對(duì)園林廢棄物堆肥的影響

付冰妍, 孫向陽(yáng)*, 余克非, 鄒榮松, 孟童瑤, 揭 陽(yáng)

1.北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 北京 100083 2.國(guó)家林業(yè)和草原局鹽堿地研究中心, 北京 100091 3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院天津林業(yè)科學(xué)研究所, 天津 300270

伴隨著生態(tài)城市的建設(shè)，園林廢棄物產(chǎn)量急劇增加，我國(guó)每年產(chǎn)出約 1 400×104t的園林廢棄物[1]. 堆肥化正逐漸取代填埋、焚燒等方式成為處理園林廢棄物的理想選擇. 由于不易降解的木質(zhì)纖維素是園林廢棄物的主要組成成分，進(jìn)而致使堆肥周期過長(zhǎng)[2-3]. 將微生物作為菌劑接種于堆肥中對(duì)木質(zhì)纖維素的降解有促進(jìn)作用，被認(rèn)為是可加速堆肥進(jìn)程的有效手段. 細(xì)菌因具有適應(yīng)性強(qiáng)、來源廣泛和生長(zhǎng)速率快等優(yōu)點(diǎn)，其對(duì)堆肥的影響研究不斷深入[4-5]. 已有研究主要集中于液體菌劑，但液體菌劑存在研制需嚴(yán)格無菌的操作條件、產(chǎn)品不便于存儲(chǔ)運(yùn)輸?shù)热毕輀6]. 因此，有必要嘗試研制固體菌劑替代液體菌劑，并探究其對(duì)園林廢棄物堆肥效果的影響. 在沒有或幾乎沒有游離水的情況下，利用固體基質(zhì)作為能源或支持物進(jìn)行的發(fā)酵過程稱為是固態(tài)發(fā)酵[7]. 菌株利用固態(tài)發(fā)酵方式生產(chǎn)的固體菌劑具有成本低、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、易于運(yùn)輸存儲(chǔ)等優(yōu)勢(shì)[8-9]. 該發(fā)酵方式不僅有利于菌劑大規(guī)模的應(yīng)用，由于其載體常選用米糠、麥麩等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，還可以促進(jìn)農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品資源化[10]. 但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于細(xì)菌類固體菌劑發(fā)酵方式的研究尚不充分，而有關(guān)于固體菌劑的應(yīng)用大都以促進(jìn)植物生長(zhǎng)或抑制植物病蟲害等方面的研究為主，鮮見園林廢棄物堆肥方面的研究. 鑒于此，該研究將根據(jù)芽孢桿菌(Bacillussp.)B01的特性，對(duì)固態(tài)發(fā)酵載體、發(fā)酵條件等方面進(jìn)行優(yōu)化，制得固體菌劑；在此基礎(chǔ)上，將制成的菌劑應(yīng)用于園林廢棄物堆肥過程中，以期為芽孢桿菌屬類細(xì)菌固體菌劑的研制及其在堆肥中的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株B01，芽孢桿菌屬，筆者課題組實(shí)驗(yàn)室保藏.

培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基[11].

堆肥原料取自北京植物園香山堆肥廠的枯枝落葉，測(cè)定其基本理化性質(zhì). 堆肥原料pH為6.10，EC為0.77 mScm，腐殖質(zhì)含量為35.92 gkg，纖維素含量為37.81%，木質(zhì)素含量為17.80%，種子發(fā)芽指數(shù)(GI)為63.97%.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1固態(tài)發(fā)酵載體優(yōu)化

a) 單因素試驗(yàn)-碳源優(yōu)化. 選取價(jià)格低廉的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品作為初始固態(tài)發(fā)酵載體(麩皮、米糠混合物)，向其中分別加入乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉作為供試碳源，向錐形瓶中加入50 g固態(tài)發(fā)酵載體，121 ℃下滅菌20 min. 降溫后按照料水比1∶0.85、接種量15%接入載體中，置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)中培養(yǎng)，發(fā)酵48 h后取樣[12]. 向載體中加入無菌水，振蕩20 min[13]，通過平板菌落計(jì)數(shù)，選出最優(yōu)碳源.

b) 單因素試驗(yàn)-氮源優(yōu)化. 在最優(yōu)碳源基礎(chǔ)上，向載體中分別添加黃豆粉、蛋白胨、酵母浸粉作為試供氮源，其他發(fā)酵條件與碳源優(yōu)化試驗(yàn)相同，發(fā)酵48 h 后取樣. 通過平板菌落計(jì)數(shù)，選出最優(yōu)氮源.

c) 正交試驗(yàn). 根據(jù)最佳碳源、氮源試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步利用L9(34)正交設(shè)計(jì)對(duì)B01固態(tài)發(fā)酵載體進(jìn)行優(yōu)化.

1.2.2固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

在固態(tài)發(fā)酵載體優(yōu)化基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究裝瓶量、接種量、料水比以及干燥保護(hù)劑種類對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響. 按照裝瓶量10%、15%、20%，接種量10%、15%、20%，料水比1∶0.7、1∶0.85、1∶1，干燥保護(hù)劑種類為海藻糖、吐溫80、甘露醇進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，由此可得9組處理. 37 ℃下培養(yǎng)48 h，烘箱烘干；進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，選出最佳發(fā)酵條件.

1.2.3固體菌劑保質(zhì)期檢驗(yàn)

將制得的固體菌劑分別放置在冰箱(約4 ℃)和室溫(約25 ℃)兩種環(huán)境下存放，分別于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 d取樣，檢測(cè)菌數(shù)的變化情況.

1.2.4堆肥驗(yàn)證試驗(yàn)

利用可控制溫度和濕度的培養(yǎng)箱進(jìn)行堆肥試驗(yàn)，將園林廢棄物風(fēng)干，粉碎至粒徑約1.5 cm. 設(shè)置3組試驗(yàn)處理：①T-B01，添加固體菌劑B01；②T-EM，添加市售常見EM菌；③T-CK，不添加菌劑. 調(diào)節(jié)含水率為60%～65%，以2%接種量接入堆肥中，在試驗(yàn)開始后每4 d進(jìn)行一次樣品采集，連續(xù)取28 d，用于指標(biāo)測(cè)定分析. 每組試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行.

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

固態(tài)發(fā)酵過程中有效菌落數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)[14].

測(cè)定堆肥樣品的理化性質(zhì)時(shí)，先將樣品用去離子水以1∶10的固液比浸提，振蕩1 h后，取下，靜置，吸取上清液為待測(cè)樣品. pH用pH計(jì)測(cè)量. EC用電導(dǎo)率儀測(cè)量[15]. 測(cè)定種子發(fā)芽指數(shù)(GI)時(shí)，將20粒小白菜種子置于有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，擺放均勻，吸取5 mL濾液于培養(yǎng)皿中，同時(shí)用去離子水做空白對(duì)照，在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d，計(jì)算GI，每個(gè)樣品均做3個(gè)重復(fù)[16]. 木質(zhì)素含量采用濃硫酸法測(cè)定；纖維素含量采用72%濃硫酸水解法測(cè)定[17]；腐殖質(zhì)含量采用焦磷酸鈉浸提-K2C2O7容量法測(cè)定[18-19].

2 結(jié)果與討論

2.1 B01固態(tài)發(fā)酵載體最佳組成的確定

2.1.1不同碳源和氮源對(duì)B01固態(tài)發(fā)酵的影響

如表1所示，不同碳、氮源制備菌劑的活菌數(shù)量之間存在顯著差異. 以乳糖作為碳源可使B01固態(tài)發(fā)酵生物量達(dá)到9.66×109CFUg，與淀粉相比，活菌數(shù)量差距不大，但與葡萄糖相比，活菌數(shù)量提高了468.2%. 可以推測(cè)，緩效碳源更有利于B01的生長(zhǎng)，這可能與其碳源代謝機(jī)制有關(guān)[20-21]. 以黃豆粉作為氮源可使B01固態(tài)發(fā)酵生物量達(dá)到1.02×1010CFUg，與酵母浸粉和蛋白胨相比，活菌數(shù)量分別提高了34.2%和385.7%. 這與吳珊姣[22]的研究結(jié)果相似，可能是由于黃豆粉中含有的營(yíng)養(yǎng)成分較酵母浸粉和蛋白胨更為復(fù)雜多樣，黃豆粉既能提供足夠的能源物質(zhì)，又可以補(bǔ)充氨基酸、維生素、脂肪、無機(jī)鹽等其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)[23-24]. 故綜合分析后選擇乳糖和黃豆粉作為B01固態(tài)發(fā)酵中添加的碳、氮源.

表1 不同碳、氮源對(duì)B01固態(tài)發(fā)酵的影響

2.1.2利用正交試驗(yàn)對(duì)固態(tài)發(fā)酵載體配比優(yōu)化結(jié)果

表2 B01固態(tài)發(fā)酵載體正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 B01固態(tài)發(fā)酵載體正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析

表4 B01固態(tài)發(fā)酵載體正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.2 B01固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

B01固態(tài)發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，極差分析結(jié)果如表6所示. 由表6可知，影響B(tài)01固態(tài)發(fā)酵的因素表現(xiàn)為干燥保護(hù)劑種類>料水比>接種量>裝瓶量. 最佳固態(tài)發(fā)酵條件為處理5，即裝瓶量15%、接種量15%、料水比1∶1、干燥保護(hù)劑為海藻糖，這與何文等[27-28]的研究結(jié)果相似，該條件下，B01固態(tài)發(fā)酵菌落數(shù)可達(dá)到2.62×1010CFUg，遠(yuǎn)優(yōu)于其他處理. 這是因?yàn)楹Ｔ逄蔷哂忻{迫保護(hù)機(jī)制，研究[29]表明，在高溫環(huán)境下，細(xì)胞中結(jié)合水的量急劇下降，海藻糖可增加細(xì)胞存活率，從而降低B01死亡率. 此外，料水比也是影響固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵因素，低料水比會(huì)導(dǎo)致B01繁殖速率降低、固態(tài)培養(yǎng)基凝結(jié)成塊和溶氧量降低，從而限制菌落生長(zhǎng).

表5 B01固態(tài)發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 B01固態(tài)發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析

2.3 固體菌劑保質(zhì)期檢驗(yàn)

從圖1可以看出，將固體菌劑B01存儲(chǔ)于4 ℃下時(shí)，隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)，其菌落數(shù)下降較為緩慢；而存儲(chǔ)于25 ℃下時(shí)，菌落數(shù)在前10 d有所增加，隨后以較快的速度下降，這與王英超[30]對(duì)盾殼霉固態(tài)發(fā)酵的研究結(jié)果基本一致. B01菌落數(shù)在25 ℃下出現(xiàn)增加是因?yàn)樵摐囟葪l件與B01適宜生長(zhǎng)的溫度條件相接近，但后期隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗盡其菌落數(shù)出現(xiàn)大幅下降. 存儲(chǔ)90 d后，在25 ℃下，B01菌落數(shù)為7.87×109CFUg，存活率為30.19%；4 ℃下，其菌落數(shù)為1.22×1010CFUg，存活率為46.80%. 兩個(gè)溫度條件下B01菌落數(shù)均達(dá)到NY 609—2002《有機(jī)物料腐熟劑》的標(biāo)準(zhǔn). 與朱小燕[31]的研究相比，利用優(yōu)化后的固態(tài)發(fā)酵方式可使固體菌劑的保質(zhì)時(shí)間至少延長(zhǎng)125%.

圖1 B01菌落數(shù)隨存儲(chǔ)時(shí)間的變化情況Fig.1 Changes of B01 colony number with storage time

2.4 堆肥試驗(yàn)

2.4.1堆肥腐熟過程中pH和EC的變化

圖2 堆肥過程中pH的變化Fig.2 Changes of pH during composting

堆肥腐熟過程中不同處理下pH的變化情況見圖2. 由圖2可見，堆肥過程中各處理下pH的變化趨勢(shì)基本相同，均為先升后降，直至堆肥過程持續(xù)到第24天左右才出現(xiàn)緩慢下降. 堆肥初期(前8 d)pH上升是化學(xué)和生物學(xué)因素共同作用的結(jié)果，堆肥過程中有機(jī)物分解產(chǎn)生的NH3提高了pH，而pH升高將減慢微生物生長(zhǎng)的速度，減少微生物對(duì)NH4+的吸收[32]. 堆肥后期pH下降，是由于前期耗能多，微生物繁殖迅速，微生物活動(dòng)產(chǎn)生的有機(jī)酸導(dǎo)致的. 在堆肥結(jié)束時(shí)，T-EM、T-B01和T-CK處理組的pH分別降至8.12、7.88和8.06，僅有T-B01處理組的pH同時(shí)達(dá)到了NY 525—2002《有機(jī)肥料》和LYT 2700—2016《花木栽培基質(zhì)》的標(biāo)準(zhǔn).

堆肥腐熟過程中不同處理下EC的變化情況見圖3. 由圖3可見，各堆肥產(chǎn)品的EC均較原材料有所下降，但整體波動(dòng)不明顯. 堆肥初期(前8 d)有機(jī)物被大量降解產(chǎn)生氨，以及高溫期部分氨揮發(fā)，致使EC有所下降；在堆肥第16天左右EC出現(xiàn)回升現(xiàn)象，這是由于微生物活動(dòng)使有機(jī)物料持續(xù)礦化產(chǎn)生大量的礦質(zhì)鹽分及堆體體積逐漸減小所致. 該研究中，EC最低值出現(xiàn)在T-B01處理組，為0.67 mScm；EC最高值出現(xiàn)在T-EM處理組，為0.74 mScm.

圖5 堆肥過程中纖維素和木質(zhì)素降解率的變化Fig.5 Changes of cellulose and lignin degradation rates during composting

圖3 堆肥過程中EC的變化Fig.3 Changes of EC during composting

2.4.2堆肥過程中腐殖質(zhì)的變化情況

整個(gè)堆肥過程中，腐殖質(zhì)含量出現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)(見圖4)，這是因?yàn)槎逊是捌谖⑸镫y以利用結(jié)構(gòu)復(fù)雜的木質(zhì)素、纖維素，將其轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)，而是更多地利用了結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的腐殖質(zhì)作為其能源物質(zhì)，進(jìn)而推進(jìn)了礦質(zhì)化過程，導(dǎo)致腐殖質(zhì)在堆肥前期消耗大于產(chǎn)出[33]. 在堆肥腐熟期則相反，微生物會(huì)更多地利用木質(zhì)素纖維素等難降解物質(zhì)推進(jìn)腐質(zhì)化過程，致使腐殖質(zhì)總量增長(zhǎng). 可以看出，T-B01處理組腐殖質(zhì)總量在第8天就開始回升，而T-EM處理組和T-CK處理組分別是在第16、20天才開始回升. 這說明添加固體菌劑B01加快了腐質(zhì)化的進(jìn)程，使其堆肥成品的腐殖質(zhì)含量增加、品質(zhì)提高. 在堆肥結(jié)束時(shí)，T-B01、T-EM和T-CK處理組的腐殖質(zhì)總量分別為37.70、31.44和29.27 gkg，與EM菌和不添加菌劑相比，固體菌劑B01可使腐殖質(zhì)含量分別提高19.91%和28.80%. 這是因?yàn)橄鄬?duì)于EM菌而言，B01是分離于堆肥中的內(nèi)源微生物，可以更好地適應(yīng)堆肥環(huán)境，加快微生物繁衍和增殖速率，有利于堆肥中有機(jī)物的分解和腐殖質(zhì)的形成[34]. T-CK處理組雖然也有內(nèi)源微生物，但是T-B01處理組具備數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)，致使其腐殖質(zhì)增長(zhǎng)量、增長(zhǎng)速率均優(yōu)于T-CK處理組.

圖4 堆肥過程中腐殖質(zhì)含量的變化情況Fig.4 Changes of humus content during composting

2.4.3不同處理對(duì)堆肥木質(zhì)素和纖維素降解的影響

由圖5可以看出，木質(zhì)素、纖維素含量較初始時(shí)均有所下降. 在堆肥結(jié)束時(shí)，與EM菌和不添加菌劑相比，固體菌劑B01可使纖維素降解率分別提高11.04%和32.89%、木質(zhì)素降解率分別提高15.47%和28.23%. T-B01處理組的木質(zhì)素、纖維素降解率明顯高于其他兩組，可能是因?yàn)椋cT-CK處理組相比，菌劑的添加有利于木質(zhì)纖維素的降解. 與T-EM處理組相比，固體菌劑B01比液體EM菌更容易在堆肥中混勻，使微生物在堆體中均勻生長(zhǎng)，充分地發(fā)揮其降解作用，而且B01是具有木質(zhì)纖維素降解酶的菌株，可針對(duì)園林廢棄物中的木質(zhì)素、纖維素進(jìn)行高效降解. 張鵬飛等[35]在同樣的28 d堆肥試驗(yàn)中，木質(zhì)素降解率只有2%；而龔小強(qiáng)等[36]研究顯示，直到第77天，最佳處理組堆體中纖維降解率僅有25.17%. 這說明固體菌劑B01的添加能夠促進(jìn)堆體木質(zhì)素和纖維素的降解，加快堆腐速率.

2.4.4堆肥過程中種子發(fā)芽指數(shù)(GI)的變化情況

一般認(rèn)為，當(dāng)GI>50%時(shí)堆肥基本無毒，當(dāng)GI>80%時(shí)堆肥完全腐熟[37]. 各處理GI的變化情況(見圖6)顯示，隨著堆肥試驗(yàn)的進(jìn)行，對(duì)植物有毒性物質(zhì)的減少致使各處理的GI呈上升趨勢(shì)，且T-B01處理組GI高于其他兩組，在第16天時(shí)已經(jīng)大于80%，達(dá)到完全腐熟的狀態(tài). 而李燕[38]的研究顯示，第35天時(shí)GI才超過80%. 這說明添加固體菌劑B01可降低堆肥毒性，縮短堆肥腐熟時(shí)間. 在堆肥結(jié)束時(shí)，GI最高值出現(xiàn)在T-B01處理組，為93.6%；其次是T-EM處理組，為89.7%；最低值出現(xiàn)在T-CK處理組，為86.3%.

圖6 堆肥過程中GI的變化Fig.6 Changes of germination index during composting

3 結(jié)論

a) 通過優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果得到最佳固體菌劑B01制備條件：固態(tài)發(fā)酵載體配比為麥麩35%、米糠45%、乳糖6%、黃豆粉6%、硅藻土8%，保護(hù)劑為5%海藻糖，接種量為15%，裝瓶量為15%，料水比為1∶1. 在該條件下，B01固態(tài)發(fā)酵菌落數(shù)可達(dá)2.62×1010CFUg，存儲(chǔ)90 d后，25 ℃下其菌落數(shù)為7.87×109CFUg，存活率為30.19%；4 ℃下其菌落數(shù)為1.22×1010CFUg，存活率為46.80%. 兩個(gè)溫度條件下B01菌落數(shù)均達(dá)到NY 609—2002《有機(jī)物料腐熟劑》的標(biāo)準(zhǔn).

b) 對(duì)于接種固體菌劑B01的處理組，在堆肥結(jié)束時(shí)，pH為7.88，已經(jīng)達(dá)到NY 525—2002《有機(jī)肥料》和LYT 2700—2016《花木栽培基質(zhì)》的標(biāo)準(zhǔn)，EC為0.67 mScm，GI為93.6%，與EM菌相比，可使纖維素降解率提高11.04%、木質(zhì)素降解率提高15.47%、腐殖質(zhì)含量增加19.91%；與不添加菌劑相比，可使纖維素降解率提高32.89%、木質(zhì)素降解率提高28.23%、腐殖質(zhì)含量提高28.80%；并且在第16天時(shí)該處理組GI已經(jīng)達(dá)到81.27%.

致謝：在此感謝北京市教委生態(tài)修復(fù)工程學(xué)高精尖學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目的資助.