miR-138靶向GRK6調控骨關節炎軟骨細胞增殖和凋亡的研究

樊萍 馮秀媛 胡楠 蒲丹 呂曉虹 孫怡寧 何嵐

骨關節炎(osteoarthritis，OA)患者臨床表現主要為關節僵硬、疼痛、腫脹等，性別、年齡及炎性反應等多種因素均與OA發生發展密切相關[1]。OA病理特征主要為關節軟骨退變、軟骨細胞外基質減少，軟骨細胞是軟骨組織中主要細胞類型，且具有維持軟骨完整性功能，并可有效維持軟骨損傷及重構的平衡關系[2,3]。研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)可通過調控軟骨組織降解及軟骨細胞凋亡而參與OA發生及發展過程[4,5]。但部分miRNA在OA發生發展過程中的作用機制尚未完全闡明。通過尋找新型miRNA探究其在OA致病機制中的作用有助于尋找治療該病的新方法。研究表明微小RNA-138(microRNA-138，miR-138)通過抑制WNT/β-Catenin信號通路而促進NEK2誘導的軟骨細胞存活[6]。但關于miR-138如何通過調控下游靶基因而發揮作用尚未可知。靶基因預測顯示G蛋白偶聯受體激酶 6(G protein-coupled receptor kinase 6，GRK6)可能是miR-138的靶基因，有研究指出抑制GRK6表達可減弱IL-1β誘導的軟骨細胞外基質降解，減輕軟骨細胞炎癥損傷[7]。但OA軟骨細胞中GRK6的表達水平是否受miR-138表達的影響尚未可知。因此，本研究通過探討miR-138與GRK6的靶向調控作用，分析其對OA軟骨細胞增殖及凋亡的影響及潛在作用機制，以期為OA治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 慶大霉素、RPMI 1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清均購自上海生工生物工程有限公司；Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司；Lipofectamine2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；反轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；miR-138 mimics與無意義小分子陰性對照片段(miR-con)、GRK6小干擾RNA(si-GRK6)及陰性對照(si-con)均購自美國Invitrogen公司；青霉素與鏈霉素均購自美國Sigma公司；兔抗人GRK6、Bcl-2、Bax抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗均購自美國Abcam公司；ECL化學發光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；miR-138、U6、GRK6、β-actin引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人原代OA細胞分離及培養:選取2015年2月至2018年3月我院經關節鏡清理及膝關節清理的OA患者30例為研究對象(OA組)，其中男16例，女14例；年齡53～65歲，平均年齡(58.62±7.36)歲；根據國際軟骨修復協會分級標準，患者宏觀評分均為Ⅰ級損傷[8]。同時選取同期醫院急診外科就診的緊急創傷性截肢患者5例(Normal組)，切取正常軟骨標本。排除標準：類風濕性關節炎患者；化膿性關節炎患者。本研究經醫院倫理委員會批準，患者知情且簽署同意書。參照相關文獻[9]分離軟骨細胞：無菌條件下，剪切OA患者軟骨標本及非OA患者正常軟骨標本，去除標本多余纖維結締組織，軟骨組織剪切成方塊(1 cm3)，PBS(含有青霉素鈉、慶大霉素雙抗)洗滌5次，加入0.25%胰蛋白酶消化，放入37℃恒溫培養箱內消化30 min，棄上清，加入0.2%Ⅱ型膠原酶，放入37℃恒溫培養箱內消化16 h，每隔4 h收集細胞，用200目濾網過濾細胞，4℃條件下，1 000 r/min轉速離心5 min，棄上清，用含有10%胎牛血清及雙抗的RPMI 1640培養液洗滌3次，細胞接種于培養瓶內(密度1×105/ml)，放入37℃恒溫培養箱繼續培養，取對數生長期軟骨細胞接種于6孔板(密度1×105/ml)，經甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色鑒定軟骨細胞。

1.2.2 實驗分組:取對數生長期OA軟骨細胞，以1×105/ml的密度接種于6孔板，放入37℃恒溫培養箱培養16 h后收集細胞進行轉染，參照Lipofectamine2000轉染試劑試劑盒說明書分別將miR-138 mimics與miR-NC轉染至OA軟骨細胞，分別為OA+miR-138組、OA+miR-con組。為探究GRK6對OA軟骨細胞生物學行為的影響，本研究分別將si-GRK6與si-con轉染至OA軟骨細胞，分別為OA+si-GRK6組、OA+si-con組。后續實驗中為驗證miR-138是否通過抑制GRK6表達而影響OA軟骨細胞增殖及凋亡，分別將GRK6過表達載體(pcDNA-GRK6)與空載體(pcDNA)分別與miR-138 mimics共同轉染至OA軟骨細胞，分別為OA+miR-138+pcDNA -GRK6組、OA+miR-138+pcDNA組。轉染6 h后更換為RPMI 1640完全培養基，繼續培養48 h收集細胞。

1.2.3 qRT-PCR檢測細胞中miR-138、GRK6 mRNA表達水平:用Trizol試劑分別提取各組軟骨細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒配置反應體系，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR實驗。miR-138、GRK6 及其內參引物分別為：miR-138正向引物：5’-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3’，反向引物：5’-TGGTGTCGTG GAGTCG-3’；U6正向引物：5’-CTC

GCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCAC

G AATTTGCGT-3’；GRK6 正向引物：5’-CAGCCCATG

GAGCTCGAGAA C-3’，反向引物：5’-G GTGCA AACTGTTAAACGGCGC-3’；β-actin正向引物：5’-TGCTGT CCCTGTATGCCT CT-3’，反向引物：5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應體系：cDNA 2 μl，正反向引物各1 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環40次。應用LightCycler 480熒光定量PCR儀收集熒光信號并分析溶解曲線，采用 2-ΔΔCt法計算miR-138、GRK6 mRNA相對表達量，實驗重復3次。

1.2.4 細胞增殖實驗:OA軟骨細胞轉染48 h后收集細胞，細胞以3×105個/ml的密度接種于96孔板，每孔加入20 μl MTT，繼續培養4 h，每孔加入150 μl DMSO，分別于作用時間24 h、48 h、72 h時在490 nm波長下應用酶標儀讀取各孔吸光度值(OD)，實驗重復3次。

1.2.5 細胞凋亡實驗:收集各組OA軟骨細胞，胰蛋白酶消化，收集細胞，預冷PBS洗滌細胞，10 000 r/min轉速(4℃)離心5 min，棄上清，依次加入5 μl膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)與碘化丙錠(PI)，充分混勻，室溫避光孵育20 min，應用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.2.6 熒光素酶報告基因實驗:分別構建野生型(GRK6-WT)與突變型GRK6-3’UTR序列的報告基因質粒(GRK6-MUT)，收集對數生長期OA軟骨細胞，參照Lipofectamine2000轉染說明書進行miR-138 mimics與GRK6熒光素酶報告載體共轉染，OA軟骨細胞分為GRK6-WT+miR-138 mimics共轉染組；GRK6-WT+miR-con共轉染組；GRK6-MUT+miR-138 mimics共轉染組；GRK6-MUT+miR-con共轉染組，轉染后繼續培養48 h，檢測不同組相對熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測GRK6、Bcl-2、Bax蛋白表達:收集各組對數生長期軟骨細胞，加入預冷RIPA緩沖液裂解，提取細胞總蛋白，參照BCA蛋白濃度測定，按照試劑盒說明書檢測蛋白濃度并定量蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳反應分離蛋白，反應結束后經電轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入蛋白一抗(稀釋比1∶1 000)放入4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入相應二抗混合(稀釋比1∶2 000)，TBST洗滌，ECL顯影，曝光，應用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 miR-138和GRK6在人原代OA軟骨細胞及正常細胞中的表達 OA軟骨細胞中miR-138的表達水平顯著低于Normal組，差異有統計學意義(P<0.05)；GRK6 mRNA及蛋白表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1,表1。

圖1 Westen blot檢測人原代OA軟骨細胞及正常細胞中GRK6蛋白的表達

表1 人原代OA軟骨細胞及正常細胞中miR-138和GRK6的表達

2.2 轉染miR-138對人原代OA軟骨細胞增殖的影響 與Normal組比較，OA組軟骨細胞活力顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；OA軟骨細胞中轉染miR-138 mimics后，與OA+miR-con組比較，軟骨細胞活力顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 轉染miR-138對人原代OA軟骨細胞增殖的影響

2.3 miR-138過表達對人OA軟骨細胞凋亡的影響 相對于Normal組，OA組軟骨細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與OA+miR-con組相比，OA+miR-138組軟骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Western blot檢測結果顯示，OA組軟骨細胞中Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達量顯著增加(P<0.05)；與OA+miR-con組比較，OA+miR-138組軟骨細胞中Bcl-2蛋白表達量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，Bax蛋白表達量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3,圖2。

表3 轉染miR-138對風濕關節炎關節成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡和Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達

2.4 沉默GRK6對人OA軟骨細胞增殖和凋亡的影響 與OA+si-con組比較，OA+si-GRK6組軟骨細胞增殖活力顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，而Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖3,表4。

圖3 Western blot檢測GRK6、Bax和Bcl-2蛋白的表達

表4 沉默GRK6對人OA軟骨細胞增殖和凋亡的影響

2.5 miR-138靶向調控GRK6的表達 靶基因預測顯示miR-138與GRK6的3’UTR區存在結合位點。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與miR-con、GRK6-WT共轉染組比較，miR-138 mimics、GRK6-WT共轉染組細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-con、GRK6-MUT共轉染組比較，miR-138 mimics、GRK6-MUT共轉染組細胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。Western blot法檢測結果顯示，與miR-con組比較，miR-138組細胞中GRK6蛋白表達下調(P<0.05)；與anti-miR-con組比較，anti-miR-138組細胞中GRK6蛋白表達上調(P<0.05)。見圖4,表5、6。

圖4 miR - 138靶向調控GRK6的表達；A：GRK6的3’UTR中含有與miR-138互補的核苷酸序列；B：Western blot法檢測miR-138對GRK6蛋白表達的影響

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6 過表達GRK6逆轉了miR-138對人OA軟骨細胞增殖的促進和凋亡的抑制作用 與OA+miR-138+

表6 miR-138調控GRK6的表達

pcDNA組比較，OA+miR-138+pcDNA -GRK6組軟骨細胞增殖活力顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見圖5,表7。

圖5 Western blot檢測GRK6、Bax和Bcl-2蛋白的表達

表7 過表達GRK6逆轉了miR-138對人OA軟骨細胞增殖的促進和凋亡的抑制作用

3 討論

miRNA屬于一類內源性非編碼RNA，可通過抑制下游靶基因翻譯或促進靶基因降解而參與細胞增殖、凋亡及器官發育等多種生理病理過程，研究表明miR-138在肝細胞癌等多種腫瘤組織或細胞系中呈低表達，并可抑制腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲并誘導細胞凋亡[10-13]。研究表明miR-138可通過靶向沉默信息調節因子1(SIRT1)而調控膀胱癌細胞增殖及凋亡[14]。相關研究報道指出年齡相關性白內障患者晶狀體囊膜中miR-138表達上調，其可通過靶向負性調控SIRT1表達促進晶狀體上皮細胞凋亡[15]，與其研究結果不同，本研究結果顯示，OA軟骨細胞中miR-138的表達下調，分析原因可能為不同組織或細胞miR-138表達不同。因此miR-138在OA軟骨細胞中的作用及機制仍需進一步研究，本研究結果顯示，上調miR-138表達后，OA軟骨細胞增殖能力增強，細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達上調，Bax蛋白表達下調，已有研究報道指出Bcl-2、Bax基因在軟骨細胞凋亡過程中發揮重要作用，上調Bcl-2表達及下調Bax表達可抑制細胞凋亡的發生，探究根本原因在于其可阻斷細胞內部自身凋亡機制的啟動[16]。說明miR-138過表達可通過調控細胞凋亡基因表達而抑制OA軟骨細胞過度凋亡。提示miR-138過表達可能是抑制OA軟骨破壞的重要機制。

GRK6在多發性骨髓瘤患者血漿及其細胞系中呈高表達，下調GRK6表達可誘導細胞周期停滯于G0/G1期，抑制多發性骨髓瘤細胞增殖[17,18]。研究表明GRK6表達水平升高可促進機體內炎性巨噬細胞分泌、增強機體炎性反應從而參與多種病理過程[19,20]。本研究結果顯示GRK6在OA軟骨細胞中的表達上調，與文獻報道[17-20]相似，說明GRK6表達水平升高可能促進OA發生發展。本研究通過抑制GRK6表達，結果發現OA軟骨細胞增殖能力升高，細胞凋亡能力明顯受到抑制，表明抑制GRK6表達與miR-138過表達對OA軟骨細胞增殖及凋亡的作用相同。進一步研究分析發現miR-138可靶向負性調控GRK6表達，GRK6過表達可部分逆轉miR-138過表達對OA軟骨細胞增殖及凋亡的作用。說明miR-138可負向調控GRK6表達而抑制OA軟骨細胞凋亡，促進細胞增殖。提示miR-138可能作為OA軟骨修復因子。

綜上所述，miR-138在OA軟骨細胞中低表達，而miR-138過表達可通過負性調控GRK6表達而增強OA軟骨細胞增殖，抑制細胞凋亡，為OA治療及藥物研發提供新方向。但miR-138、GRK6能否作為OA進展過程中的潛在靶點還需深入研究。