miR-26在大鼠腦缺血再灌注神經損傷中的保護作用與機制研究

李巍 呂彥 張景華 趙子艾 孫顯輝 劉欣 趙永剛

腦缺血是臨床上致殘率與病死率都很高的疾病，好發于中老年，男性發病率略高于女性。該病起病急、進展快，治療上需要改善血腫周圍腦血流、減輕腦水腫[1]。研究認為腦缺血不僅會導致神經細胞突起損傷，還會誘發腦缺血再灌注神經損傷。腦缺血再灌注神經損傷是指腦組織缺血導致局部腦細胞損傷，恢復血液再灌注后的腦缺血反應進一步加重的現象[2,3]。腦缺血再灌注神經損傷的具體發生機制還不明確，不過局部腦缺血可使腦血管內皮細胞發生從靜止狀態到促炎狀態的改變，促使了血腦屏障的破壞和白細胞聚集[4,5]。腦缺血的發生伴隨有許多基因的表達發生顯著變化，其中微小RNA(MicroRNA，miRNA)可能同樣參與該病的發生發展[6]。miRNA是一種短小的非編碼RNA分子，其通過聯結mRNA中的3’-非翻譯區位點來調節目的基因的表達，從而發揮對疾病的調控作用[7,8]。miR-26是microRNAs 調控網絡中的重要組成之一，位于人類22q11.21，其在腫瘤中為抑癌基因，在多種癌細胞內的表達量呈現下降的趨勢[9,10]。miR-26被證明不同的神經細胞中存在表達變化[11,12]，但是與腦缺血再灌注神經損傷的關系還不明確。Apba-1編碼X11蛋白，后者是一個與阿爾茲海默病淀粉樣前體蛋白，可調節胞外分泌的神經元黏附力與腦組織囊泡轉運蛋白的信號轉換過程[13,14]。本文探討miR-26在大鼠腦缺血再灌注神經損傷中的保護作用與機制，希望為今后的研究提供新的靶點，為臨床患者提供新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇健康雄性SD大鼠48只(動物許可證號：SCXK2019-0041)，體重(240±20)g，由學科學院動物中心提供。大鼠置于獨立通風籠盒分籠飼養，每籠5只，籠內溫度為20℃～23℃，濕度為40%～60%。喂養配制的大鼠飼料，飲純凈水，墊料每2天更換1次，適應性飼養1周后進行后續實驗。Apba-1一抗(北京百奧萊博科技有限公司)、Trizol 試劑(美國Invitrogen 公司)、mRNA檢測試劑盒(日本Takara 公司)、β-actin鼠單克隆抗體(北京四季青公司)、miR-26 mimic與miR-NC(上海生工公司)。

1.2 動物分組與處理 大鼠隨機分為假手術組、模型組、miR-26 mimic組和miR-NC組，每組12只。模型組、miR-26 mimic組和miR-NC組都制備腦缺血再灌注模型，采用線栓法建立模型，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.33 ml/100 g)大鼠，切開頸部正中2～3 cm，進行鈍性分離，暴露頸部組織，用動脈夾夾緊頸內動脈遠心端和頸總動脈近心端并剪斷枕動脈，插入魚線線栓進入頸內動脈，當感受到阻力之后，停止進線，扎緊并固定魚線，褪去動脈夾后造模完成，將大鼠放置于籠內進行飼養。腦缺血2 h后，用彎鑷夾住魚線尾部后緩慢的退出魚線，剪斷露在體外的線栓，建立腦缺血再灌注神經損傷模型，然后自由喂食和水。造模后1、3、7 d，4組分別取4只大鼠。將9 μl無菌0.9%氯化鈉溶液、miR-26 mimic、miR NC(100 μmol/L)與2.5 μl的轉染試劑混合均勻靜置30 min。選擇大鼠頭部正中切口，將混合液注射大鼠左側腦室，注射速度約為3 μl/min，留針時間5 min，在處理后6 h進行相關指標的檢測與判定。整個過程維持肛溫在(37.0±0.5)℃，自由取食、供水。

1.3 觀察指標 (1)按照Tarlov評分標準對大鼠進行神經行為學評分，分為0～4分，分數越高，神經行為功能越好[2]。(2)斷頭處死大鼠，取腦組織并冷卻至-20℃ 30 min，制成1 mm厚的切片， 37℃恒溫下固定10 min并進行HE染色，正常組織呈紅色，梗死組織呈白色。使用Image-Pro Plus分析大鼠腦梗死和腦水腫的體積百分比。(3)取部分腦組織，用液氮保存，一部分用于miRNA檢測分析，一部分用于蛋白表達檢測分析。在miRNA檢測分析上，將腦組織進行液氮下研磨，加入1 ml Trizol進行研磨15 min左右，提取總RNA并進行反轉錄，按照qRT-PCR試劑盒中的說明書檢測miR-26表達水平，反應條件：95℃ 10 s，60℃ 20 s，72 ℃ 15 s，反應擴增40個循環，結果以目的基因與GAPDH mRNA 表達值的比值表示。U2的正向引物：5’-ACCGGCCATTTAAACCTTACA-3’，反向引物：5’-AGGGGGGGGCCATTAC-3’。miR-26的正向引物：5’-GCTGGGTTGAGAGGGCGA-3’， 反向引物：5’-ATTCCCACTGGACACAAAC-3’，用2-ΔΔCT法計算基因的表達。采用Western Blot 檢測蛋白表達配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠，轉膜后用含50 g/L 脫脂奶粉的TBST在37℃下封閉1.5～2 h；兔抗鼠的Apba-1 單克隆抗體(1∶1 000稀釋)和β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃過夜；TBST洗滌3次，在室溫下孵育二抗1 h(HRP 標記的IgG羊抗兔，1∶5 000稀釋)；TBST洗滌3次后，采用自動發光檢測系統檢測蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 4組大鼠神經行為學評分比較 模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組大鼠均造模成功，3組造模后1、3、7 d的Tarlov評分都顯著低于假手術組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠造模后不同時間點的神經行為學評分比較 n=4,分，

2.2 4組大鼠腦水腫與腦梗死體積比較 模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的腦水腫與腦梗死相對體積顯著高于假手術組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著低于模型組與miR-NC組(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠造模后不同時間點的腦水腫與腦梗死相對體積比較

2.3 4組大鼠miR-26 mRNA表達水平比較 模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的miR-26 mRNA相對表達水平顯著低于假手術組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠造模后不同時間點的miR-26 mRNA相對表達水平比較

2.4 4組大鼠Apba-1蛋白表達水平比較 模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的Apba-1蛋白相對表達水平顯著低于假手術組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)。見表4,圖1。

表4 4組大鼠造模后不同時間點的Apba-1蛋白相對表達水平比較

圖1 4組造模后不同時間點的Apba-1蛋白相對表達水平

3 討論

當前腦缺血還無特效治療方法，但是規范化治療與管理可有效降低病死率，改善患者的預后[15,16]。腦缺血的好發部位包括大腦中動脈、大腦前動脈、頸內動脈、大腦后動脈等，從而出現缺血、缺氧性神經細胞壞死和凋亡，嚴重情況下可導致患者死亡[17]。同時腦缺血不僅會導致神經細胞突起損傷，還可造成腦缺血再灌注神經損傷，誘發機體出現記憶、語言、行動能力等障礙。線栓法大鼠大腦中動脈梗死是當今探索腦缺血再灌注神經損傷的主要動物模型，主要是采用人為物理方法阻塞大鼠大腦中動脈，使大鼠腦組織形成缺血性梗死及相應的神經損傷[18,19]。

miRNA作為致病基因轉錄后水平的調控因子，能調節靶mRNA 的表達，從而影響相應蛋白的翻譯，對機體的生理功能與病理功能產生相應的影響[20]。有研究顯示，在腦缺血再灌注神經損傷模型中，miR-26的表達顯著增加[21,22]。本研究也顯示模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的miR-26 mRNA相對表達水平顯著低于假手術組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)。miR-26基因組存在著有兩個基因位點，分別位于在11號染色體、21號染色體。miR-26的表達調控在基因水平、染色體水平和轉錄水平有著重要作用，且可抑制癌基因的過量表達，從而抑制腫瘤的發生[23,24]。

當前miRNA已經被廣泛研究并且已經活躍在細胞的生長、凋亡、增殖、分化等過程中，miRNA通過調節其靶基因參與缺血性腦梗死的病理生理學的進程，也在神經突延伸和分支中發揮重要的調節作用[25,26]。本研究顯示模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組大鼠均造模成功，3組造模后1、3、7 d的Tarlov評分顯著低于假手術組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)；模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的腦水腫與腦梗死相對體積顯著高于假手術組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著低于模型組與miR-NC組(P<0.05)，表明miR-26的過量表達能抑制腦水腫與腦梗死，從而改善大鼠的神經行為功能。miR-26是一類高度保守的內源性小RNA，可以調節組織血管生成，并誘導缺血情況下的一系列變化，腦缺血再灌注損傷中起關鍵作用[27,28]。有研究顯示注射miR-1、miR-21和miR-26可減少非熱休克誘導的心臟缺血再灌注損傷大鼠的心肌梗死體積[29,30]。還有研究顯示miR-26在星型膠質細胞的表達是下調的，并且可以抑制促炎細胞因子的表達。miR-26作為腦缺血miRNA調控網絡的重要成員之一，被預測在星型膠質細胞中表達可能上調并與腦缺血再灌注神經損傷相關[31,32]。

腦缺血再灌注神經損傷是高度復雜的機制，涉及到炎性反應，導致缺血性神經元缺血和壞死性死亡[33]。腦缺血再灌注神經損傷發生的病理生理變化并不是完全定型和不可逆的，尋找有效保護再灌注神經損傷的治療靶點具有重要價值。miRNA的異常表達和一些疾病的發生發展有著緊密關系。沉默miR-26可以減弱神經膠質細胞增殖并且增加激酶抑制因子2A表達，從而在反應性星形膠質細胞增殖中發揮作用[34]。Apba-1是腦缺血的關鍵分子，通過TargetScan 和MiRanda 等預測分析軟件預測miR-26可以調控細胞內Apba-1水平[35]。本研究顯示模型組、miR-26 mimic組、miR-NC組造模后1、3、7 d的Apba-1蛋白相對表達水平顯著低于假手術組(P<0.05)，miR-26 mimic組顯著高于模型組與miR-NC組(P<0.05)，表明miR-26的高表達能促進Apba-1的表達，從而在腦缺血再灌注神經損傷中起作用。

綜上所述，miR-26在大鼠腦缺血再灌注神經損傷中的過量表達能促進Apba-1的表達，從而抑制腦水腫與腦梗死，改善大鼠的神經行為功能，發揮相應的腦功能保護作用。