miR-32-5p靶向NFIL3基因促進脂多糖誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應

李金秀 夏天 康壽磊

肺泡上皮細胞是肺臟結構和功能的基礎，肺泡上皮細胞凋亡是急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的一個重要病理變化特征，ALI時肺組織嚴重破壞，呼吸功能嚴重受損[1]。炎性反應在ALI的發生發展中有重要地位[2]。從分子生物學水平出發，在細胞層面通過探討特異性靶點可作為干預治療ALI的潛在手段，而研究發現部分miRNA在肺損傷和修復過程中異常表達，并通過影響其靶基因的表達而調控炎性反應，與ALI的進展密切相關[3]。miR-32-5p參與結核分枝桿菌中的炎性反應，其過表達減弱了炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)的積累[4]。核因子白介素-3(nuclear factor interleukin-3，NFIL3)是一種關鍵的轉錄抑制因子，對于NK細胞和先天淋巴細胞的發育至關重要[5,6]。研究發現NFIL3可通過靶向胰島素樣生長因子2受體抑制缺氧誘導的凋亡細胞死亡[7]。然而miR-32-5p和NFIL3對脂多糖誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應的影響及機制是否與miR-32-5p調控NFIL3相關還尚未可知，本文研究miR-32-5p是否通過調控NFIL3影響脂多糖誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 肺上皮細胞A549購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、BCA試劑盒、PBS緩沖液購自美國Sigma公司；Lipofectamine TM 2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海聯科生物技術有限公司；RIPA蛋白裂解液、PVDF膜、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；抗體均購自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組:將肺上皮細胞A549在37℃、含10%胎牛血清的DMEM完全培養液中培養，每天換液1次，將融和至80%左右的細胞無血清饑餓培養12 h后進行分組，用終濃度為30 μg/ml的LPS溶液刺激細胞作為LPS組，以未經任何處理的細胞作為正常對照(NC)組。將miR-con、miR-32-5p、anti-miR-con、anti-miR-32-5p分別轉染至未經任何處理的A549細胞中，記為miR-con組、miR-32-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-32-5p組。將anti-miR-con、anti-miR-32-5p、pcDNA-con、pcDNA-NFIL3轉染至A549細胞中再用30 μg/ml的LPS處理，記為LPS+anti-miR-con組、LPS+anti-miR-32-5p組、LPS+pcDNA-con組、LPS+pcDNA-NFIL3組。將anti-miR-32-5p與si-con、si-NFIL3分別共同轉染至A549細胞中再用30 μg/ml的LPS處理，記為LPS+anti-miR-32-5p+si-con組、LPS+anti-miR-32-5p+si-NFIL3組；轉染均按照Lipofectamine TM 2000轉染試劑盒進行操作。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-32-5p和NFIL3 mRNA的表達水平:收集各組細胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照TaKaRa熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；72℃延長5 min。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3 Western blot檢測NFIL3、cleave-caspase-3蛋白表達:收集各組細胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12 000 g離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡:用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，離心收集各組細胞，PBS漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞。依據試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15 min。流式細胞儀檢測激發波長488 nm和發射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復3次。

1.2.5 ELISA法檢測TNF-α和IL-6的表達:取各組細胞，離心取上清，然后按照ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.2.6 熒光素酶報告實驗檢測miR-32-5p對NFIL3的靶向調控:TargetScan數據庫顯示NFIL3 3′UTR區域有miR-32-5p結合位點。構建含有miR-32-5p結合位點的NFIL33′UTR野生型和突變型熒光素酶表達載體(WT-NFIL3和MUT-NFIL3)，取對數生長期肺上皮細胞A549接種于24孔板(5×104個/孔)，待細胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM 2000將WT-NFIL3和MUT-NFIL3組細胞分別轉染miR-con和miR-32-5p。依據說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統計學分析。實驗重復3次。

2 結果

2.1 LPS誘導的肺上皮細胞A549中miR-32-5p和NFIL3的表達水平 qRT-PCR和Western Blot檢測結果顯示，與NG組相比，LPS組A549細胞中miR-32-5p表達水平顯著升高，NFIL3 mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。可見，LPS誘導的肺上皮細胞A549中miR-32-5p高表達，NFIL3低表達。見表1，圖1。

圖1 NFIL3蛋白的表達

表1 miR-32-5p、NFIL3mRNA及NFIL3蛋白表達

2.2 miR-32-5p低表達抑制LPS誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應 與NG組相比，LPS組A549細胞中miR-32-5p、cleave-caspase-3表達水平顯著升高，TNF-α、IL-6含量顯著升高，細胞凋亡率也顯著升高(P<0.05)；與LPS+anti-miR-con組相比，LPS+anti-miR-32-5p組A549細胞中miR-32-5p、cleave-caspase-3表達水平顯著降低，TNF-α、IL-6含量顯著降低，細胞凋亡率也顯著降低(P<0.05)。可見，LPS可誘導肺上皮細胞凋亡和炎性反應，而miR-32-5p低表達可抑制LPS誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應。見表2，圖2。

表2 miR-32-5p低表達抑制LPS誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應

圖2 miR-32-5p低表達抑制LPS誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應；A 流式細胞儀檢測細胞凋亡;B cleave-caspase-3蛋白的表達

2.3 高表達NFIL3抑制LPS誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應 與NG組相比，LPS組A549細胞中cleave-caspase-3表達水平顯著升高，NFIL3表達水平顯著降低，TNF-α、IL-6含量顯著升高，細胞凋亡率也顯著升高(P<0.05)；與LPS+pcDNA-con組相比，LPS+pcDNA-NFIL3組A549細胞中cleave-caspase-3表達水平顯著降低，NFIL3表達水平顯著升高，TNF-α、IL-6含量顯著降低，細胞凋亡率也顯著降低(P<0.05)。可見，高表達NFIL3可抑制LPS誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應。見表3，圖3。

圖3 Western Blot檢測cleave-caspase-3、NFIL3蛋白的表達

表3 高表達NFIL3抑制LPS誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應

2.4 miR-32-5p靶向NFIL3 通過TargetScan數據庫預測到NFIL3與miR-32-5p存在結合位點。熒光素酶報告基因檢測實驗結果顯示，轉染NFIL3基因野生型和突變型表達載體后，相較于miR-con組，miR-32-5p組野生型肺上皮細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而突變型肺上皮細胞的熒光素酶活性差異不

顯著(P>0.05)。Western Blot檢測結果顯示，相較于miR-con組，miR-32-5p組肺上皮細胞中NFIL3表達水平顯著降低；相較于anti-miR-con組，anti-miR-32-5p組肺上皮細胞中NFIL3表達水平顯著升高(P<0.05)。可見，miR-32-5p可靶向調控NFIL3的表達。見表4、5，圖4。

圖4 miR-32-5p靶向調控NFIL3表達；A starbase對miR-32-5p和NFIL3結合進行預測示意圖;B Western Blot檢測NFIL3表達量

表4 miR-con或miR-32-5p與報告質粒共轉染A549細胞后雙熒光素酶活性檢測

2.5 敲減NFIL3可以部分逆轉anti-miR-32-5p對LPS誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應的影響 與LPS+anti-miR-con組相比，LPS+anti-miR-32-5p組A549細胞中NFIL3表達水平顯著升高，cleave-caspase-3表達水平顯著降低，TNF-α、IL-6含量顯著降低，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與LPS+anti-miR-32-5p+si-con組相比，LPS+anti-miR-32-5p+si-NFIL3組A549細胞中NFIL3表達水平顯著降低，cleave-caspase-3表達水平顯著升高，TNF-α、IL-6含量顯著升高，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。可見，敲減NFIL3可以部分逆轉anti-miR-32-5p對LPS誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應的抑制作用。見表6，圖5。

表5 Western Blot檢測NFIL3的表達

表6 敲減NFIL3可以部分逆轉anti-miR-32-5p 對LPS誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應的影響

圖5 Western Blot檢測NFIL3、cleave-caspase-3蛋白表達

3 討論

ALI為常見且復雜的炎癥性肺疾病，ALI發病率和死亡率較高，主要的病理生理改變是彌漫性肺毛細血管內皮-肺泡上皮屏障功能的破壞及炎癥損，減輕肺上皮細胞凋亡和炎性反應可減緩ALI的進展[8]。miRNA參與細胞增殖、分化、凋亡、脂肪代謝等生命過程[9]，且研究表明ALI發病過程中miRNA表達異常，miRNA可通過與靶mRNA部分結合在轉錄和轉錄后水平調節靶基因表達，參與ALI的整個發病過程，miRNA在急性肺損傷中具有重要調節作用[10]。如脂多糖處理中miR-29b高表達，下調miR-29b可保護LPS誘導的大鼠ALI，減輕炎性反應[11]。miR-155反義寡核苷酸(ASO)可以降低IL-6和TNF-α水平，抑制炎性反應，保護內毒素誘導的小鼠ALI[12]。而miR-32-5p對ALI的影響還未見報道。研究發現下調miR-32-5p促進KLF4的表達增加了前列腺癌的化學敏感性，促進細胞凋亡[13]。敲低miR-32-5p極大抑制了大鼠神經性疼痛，并降低了炎性細胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6蛋白的表達[14]。本實驗結果顯示，脂多糖處理促進miR-32-5p的表達，miR-32-5p低表達抑制cleave-caspase-3的表達，抑制脂多糖誘導的肺上皮細胞凋亡；且還降低IL-6、TNF-α的水平。與前人研究結果相似，說明miR-32-5p低表達可以減輕炎性反應，促進肺上皮細胞凋亡。

NFIL3是一種重要的負轉錄因子，它通過與IGF2R啟動子結合，抑制缺氧條件下H9c2心肌細胞中IGF2R信號通路誘導的細胞凋亡[7]。NFIL3過度表達通過抑制TRAIL和拮抗過氧化氫誘導的細胞死亡來支持腫瘤細胞的存活[15]。抑制NFIL3消除了IL-5對地塞米松誘導的細胞凋亡的保護作用[16]。以上結果表明，過表達NFIL3促進細胞存活，抑制細胞凋亡。本實驗結果顯示，脂多糖處理抑制NFIL3的表達，高表達NFIL3抑制cleave-caspase-3的表達，抑制脂多糖誘導的肺上皮細胞凋亡。此外，CIK細胞中超表達NFIL3能有效減少細菌入侵，并能抑制入侵后細胞的增殖；其與顯著激活NF-κB活性，提高干擾素IFN和白介素IL-10基因的表達有關[17]。而本研究中過表達NFIL3也降低了IL-6、TNF-α的水平。本實驗還發現miR-32-5p靶向調控NFIL3的表達，敲減NFIL3可以部分逆轉抑制miR-32-5p對脂多糖誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應的抑制作用。提示，miR-32-5p可能通過調控NFIL3影響脂多糖誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應。

綜上所述，miR-32-5p可抑制脂多糖誘導的A549細胞凋亡和減輕炎性反應，其機制與上調NFIL3及抑制炎性因子TNF-α、IL-6的表達有關。可為ALI的治療提供新思路和新靶點。