乳腺癌轉移灶標本FLOT1基因檢測對早診早治的意義

王雪銘 趙海軍 杜倩倩 劉志勇 趙云峰 韓慶茹

乳腺癌是發生于乳腺上皮或導管上皮的惡性腫瘤，患者晚期轉移常見于肺、肝、腦、骨等，其發生往往因為影響了重要器官功能[1]，需要病理活檢才能進一步制定治療方案。隨著醫學科學技術的進步，患者就醫后的病理活檢越來越精準，但挽救治療效果并不很滿意，所以，通過對轉移灶給以病理分析，期望能找到更切合實際的乳腺癌早診早治手段。近年來，對FLOT1基因在腫瘤的表達越來越被重視，已經發現，FLOT1基因在食管癌、肺癌、乳腺癌都有高表達[2]，而且，FLOT1基因的表達程度與癌癥的生物學特性密切相關[3]，即表達程度高的患者，發生遠處轉移的幾率也高，通過轉染動物實驗，FLOT1基因在腫瘤的早診早治中可以指導臨床采取措施[4]。乳腺癌患者晚期轉移就醫者，多已危及生命，采集的標本組織來源雖然不同，但其FLOT1基因蛋白表達具有共性，本文對標本的FLOT1基因研究進行報告。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年5月至2019年5月石家莊市第四醫院的晚期乳腺癌患者病理標本96例(乳腺癌組)，患者均因晚期乳腺癌發生轉移，在不同醫院就醫并進行病理活檢而確診，其中病理性骨折55例，肺轉移呼吸困難26例，肝轉移繼發黃疸8例，其他7例。同時選取石家莊市第四醫院和樂亭縣醫院良性乳腺腫瘤或者良性增生結節病理標本96例為空白對照組，患者均為女性，年齡33～75歲，平均年齡(51.2±14.3)歲；病程1～26周，平均(11.6±4.4)周。入組對象知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 患者手術或穿刺活檢，取得精準的病理標本或者蠟塊。調閱病理切片或從蠟塊取樣，并與病理科合作，進行FLOT1基因檢測，檢測試劑由上海通蔚生物公司提供。此外，選擇96例乳腺良性腫瘤或良性增生結節標本為空白對照組，給予FLOT1基因檢測，進行分析對比。基因表達量檢測采用Western 印跡法，即放射免疫沉淀法裂解液，提取切片細胞總蛋白，通過二喹啉甲酸法對蛋白定量，把上面蛋白(40 μg/每孔道)以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉移至聚偏氟乙烯膜，然后5%脫脂奶粉封閉轉好的膜，1 h后洗膜，再加稀釋好的一抗，在4℃條件下搖床孵育過夜，再洗膜后加1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記抗體，先室溫孵育，1 h后再洗膜，此時電化學發光顯影、定影。經過化學發光成像系統及配套的軟件采集圖像。實驗重復3次。

1.3 評價指標

1.3.1 FLOT1基因檢測陽性強度：以熒光定量強度(單位AU)分析。

1.3.2 FLOT1基因檢測陽性率：FLOT1基因檢測陰性計1分；FLOT1基因檢測弱陽性(+)計2分；FLOT1基因檢測陽性(++)計3分；FLOT1基因檢測強陽性(+++)計4分。FLOT1基因檢測陽性率=FLOT1基因檢測陽性(++)例數+ FLOT1基因檢測陽性(+++)例數/總例數。

2 結果

2.1 2組標本FLOT1基因檢測陽性強度比較 乳腺癌轉移灶標本FLOT1基因檢測陽性強度顯著高于乳腺良性腫瘤或良性結節標本，差異有統計學意義(P<0.001)。見表1，圖1。

表1 乳腺癌轉移灶標本和乳腺良性腫瘤或良性結節標本FLOT1基因檢測陽性強度比較

圖1 上面是乳腺良性腫瘤或良性結節標本FLOT1基因蛋白定量，下面是乳腺癌轉移灶標本FLOT1基因蛋白定量

2.2 乳腺癌轉移灶標本FLOT1基因檢測陽性率與乳腺良性腫瘤或良性結節標本陽性率比較 乳腺癌轉移灶標本FLOT1基因檢測陽性率為97.92%顯著高于乳腺良性腫瘤或良性結節標本陽性率43.75%，差異有統計學意義(P<0.001)。見表2。

表2 乳腺癌轉移灶標本FLOT1基因檢測陽性率與乳腺良性腫瘤或良性結節標本陽性率比較 n=96，例(%)

3 討論

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，發病率呈現上升趨勢[4]。究其原因，主要還是早期發現、早期診斷、早期治療的方法不夠高級，特別是乳腺癌只有發生轉移才是多數患者死亡的原因[5]，但對乳腺癌發生轉移的機制一直不清楚。最近，從基因研究進行乳腺癌的早診早治研究成為突破降低乳腺癌死亡率瓶頸的研究熱點[6]。實際上，BRCA基因檢測已經逐漸普及，通過對易感人群進行BRCA基因檢測可以預測患乳腺癌的風險，但基因檢測的廣泛應用，不僅是篩查，通過對不同對象、不同組織的基因檢測，也可以指導選擇正確的治療方法，正確的選擇藥物等[7]。目前，從基因水平進行腫瘤早診早治已經取得了重大進步，世界范圍內基因診治各類腫瘤的實驗方案可謂層出不窮，而乳腺癌的基因診治也逐漸廣泛應用于臨床，隨著新的分子學技術的發展和分子免疫學理論的不斷完善，很多新的基因診治手段會用于乳腺癌[8]，而許多診治乳腺癌的基因不斷被克隆成功，為乳腺癌的早診早治提供安全、高效、特異的轉導系統。有學者跟隨著對乳腺癌疾病的基因啟動與基因調控的研究的深入，對導入的乳腺癌基因的定位和表達程度得到了更好的控制[9]。通過這些不懈的努力，乳腺癌基因水平的早診早治越來越前景廣闊。

脂筏結構蛋白在生物體中廣泛存在，且高度保守，參與細胞黏附、多種信號通路、軸突生長、跨膜轉運等，包含兩種同源亞型，即脂筏結構蛋白1(Flotillin-1，FLOT1)和脂筏結構蛋白2(Flotillin-2，FLOT2)。研究表明，多種腫瘤中FLOT1表達上調，如食管癌、肺癌、乳腺癌等，其表達與腫瘤進展、預后等密切相關[10]。也有研究指出，抑制FLOT1表達可降低乳腺癌細胞生長，如m iR-124可靶向抑制FLOT1降低乳腺癌細胞的增殖及遷移能力；敲除FLOT1可降低乳腺癌細胞的增殖及成瘤能力。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術是一種在轉錄后抑制基因表達的新技術[11]，能高效、特異的抑制目的基因表達，已成為病毒性疾病和腫瘤治療、基因功能研究等的有力工具。通過研究對FLOT1基因靶向抑制的作用機制，探討乳腺癌早診早治的相關方案，可以更好的為提高乳腺癌早診早治水平作出貢獻。

研究表明，FLOT1在乳腺癌細胞高表達，通過RNA干擾抑制其表達可誘導癌細胞凋亡，機制與下調STAT3信號通路有關[12,13]。探討FLOT1基因在乳腺癌細胞表達及靶向抑制其表達對癌細胞凋亡的影響及機制，從而取得對乳腺癌早診早治的研究方向，成為各基因公司和臨床醫師研究的熱點。有研究表明，FLOT-1在乳腺癌、食管鱗狀癌、腎細胞癌、移行細胞癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌等腫瘤中均高表達,并與臨床分期、轉移、浸潤和預后相關[14]，通過統計分析,發現胃癌組織FLOT1 m RNA表達水平高于癌旁組織,在浸潤深度T3+T4、淋巴結轉移陽性(N 1～3)和AJCC臨床分期Ⅲ+Ⅳ亞組中,FLOT1蛋白高表達胃癌患者的5年生存率均明顯低于低表達患者。

有研究對FLOT在細胞的增殖、凋亡、運動、黏附等眾多生物學進程中發揮重要作用給以越來越多的研究[15]，多種腫瘤中FLOT表達上調，影響腫瘤發生發展，作為細胞膜脂筏的一個主要結構蛋白，FLOT1與細胞黏附、細胞內吞、細胞的信號傳導等存在密切關系，主要通過將各種細胞信號通路的胞膜受體錨定在細胞膜上發揮信號傳導媒介的作用。研究發現，多種腫瘤中FLOT1出現異常表達，乳腺癌中FLOT1表達也明顯增強，與腫瘤分期、遠處轉移等臨床病理特征顯著相關[16]，下調FLOT1表達可抑制乳腺癌細胞增殖。而目前關于FLOT1對乳腺癌細胞凋亡的影響及機制研究的尚未明確。研究顯示，FLOT1在作為人卵巢癌生物標志物中的應用，本發明首次證實了通過檢測人血清FLOT1水平可以診斷卵巢癌，表明FLOT1可作為卵巢癌有效的生物標志物，診斷價值很高；還證實了使用FLOT1聯合CA125診斷，可將卵巢癌的診斷率提高24%[17]。提示用于檢測血清FLOT1水平的試劑可用于制備診斷卵巢癌的試劑或試劑盒，同時含有檢測血清FLOT1和CA125水平試劑的試劑盒能夠顯著提高卵巢癌的診斷率。

綜上所述，乳腺癌病理標本FLOT1基因檢測陽性強度與陽性率均顯著高于乳腺良性腫瘤和良性增生結節，提示臨床采集的乳腺腫瘤標本進行常規FLOT1基因檢測，對強陽性的病例，雖然病理為良性腫瘤，仍應視為乳腺癌發病的高風險因素，并積極給出預防措施。