人羊膜上皮細胞在婦產科相關疾病中的應用及研究進展

王璐璐（綜述） 賴東梅（審校）

（上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院婦科-上海市胚胎源性疾病重點實驗室 上海 200030）

干細胞可用于治療多種嚴重疾病，主要基于兩個特性，即多能性和免疫調節性。多能性賦予干細胞分化為所需細胞類型的能力，從而用于細胞替代治療；而免疫調節性可用于控制炎癥反應和組織免疫排斥反應[1］。人胎盤中可分離出多種干細胞，而人羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）與其他類型胎盤干細胞不同，hAECs 來自外胚層，并在整個妊娠過程中保持分化潛能，屬于圍產期干細胞之一[2］。hAECs 在體內外均具有多能性和免疫調節作用，是干細胞治療和再生醫學領域的理想種子細胞[3］。近年來，hAECs 用于婦產科相關疾病的治療逐漸成為研究的熱點且相關主題的最新進展綜述較少，本文就hAECs 在婦產科相關疾病的治療中的應用進行綜述。

hAECs 的生理學特點人羊膜（amniotic membrane，AM）是胎盤最接近胎兒的一層，它是由上皮和以結締組織為主要成分的基質層組成的無血管膜，該層在懷孕期間包裹著胎兒和羊水，使發育中的胚胎免受來自周圍環境的各種刺激作用[2］。因此，AM 在胚胎的發育和保護中起著重要作用。AM 屬于胎兒附屬物，是胎盤發育的早期產物，主要由上皮層、基底膜、致密層、纖維母細胞層和海綿層組成。AM 主要包含兩種來自不同胚胎起源的多能干細胞，即人羊膜間充質干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）和hAECs[4］。hAMSCs 來源于胚胎中胚層，稀疏的分布在羊膜上皮下的基質中，而hAECs 是從原腸胚形成前的外胚層衍生而來，形成AM 最內層，是與羊水直接接觸的連續單層。兩者都保留了干細胞樣特性，均具有向3 個胚層分化的能力[3］。hAECs 和hAMSCs 可以通過差異酶消化分別從羊膜中分離出來，即使用低速胰蛋白酶-膠原酶消化羊膜組織，并且可以通過顯微鏡和流式細胞儀來鑒別[5］。在顯微鏡下，新鮮分離的hAECs 是中等大小的圓形細胞，有一個中心或偏心的細胞核，細胞核內有1 個或2 個核仁，細胞質較豐富且常空泡化，而hAMSCs 呈紡錘形或成纖維細胞樣形態。通過流式細胞儀鑒定表征分析，從AM中分離的hAECs 明顯表達上皮標志物角蛋白CK19，不表達間充質細胞標志物波形蛋白，而hAMSCs 表達波形蛋白，不表達角蛋白CK19，且hAMSCs 中CD90 和CD44 的表達水平高于hAECs，而hAECs 中CD73 則 高 于hAMSCs[6］。 盡管許多研究表明胎盤中可以分離出多種干細胞，但羊膜來源的細胞與胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）具有更緊 密 的 組 織學關系[2］。 此外，hAECs 上表達ESCs 表面選擇性表達分子，即階段性特異性胚胎抗原（SSEA3/4）和腫瘤排斥抗原（TRA1-60/1-81），且ESCs 標記物在hAECs 中的表達量都高于在hAMSCs 中的表達量高，表明hAECs可能處于更早的未分化狀態[6］。此外，hAECs 還表達自我更新和分化潛能所需的多能干細胞特異性轉錄因子，如八聚體結合蛋白4、性別決定區域相關的HMG-box 基因2（SOX-2）和Nanog[7］。在不同的培養和誘導條件下，hAECs 表現出向3 個胚層不同類型細胞的分化的能力，如心肌細胞[8］、神經元[9］、胰腺α 和β 細胞[10-11］、肝細胞[12］以及卵巢顆粒細胞[13］等。此外，hAECs 能夠分泌多種細胞因子，如生長因子、神經營養因子和抗炎因子等，來促進受損組織的修復[14］。

許多研究表明人AM 中具有免疫調節功能的細胞可參與維持胎兒耐受性，且AM 具有低免疫原性的特點[2］。胎盤的作用之一是形成母胎界面，在懷孕期間保護胎兒免受母體免疫識別攻擊和包括感染在內各種傷害。據報道，胎兒的這種“耐受性”由特定家族的人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）Ⅰb 類的表達引起，尤其是HLA-G 的表達和分泌被認為是介導胎兒耐受性的關鍵因素[15］，并且HLA Ⅰb 類表達和分泌增加有利于提高同種異體移植的耐受性，從而降低急性排斥反應的發生率[16］。研究表明，hAECs 表達HLA Ⅰ類抗原分子，但不表達HLA Ⅱ類抗原（HLA-DR）或共刺激因子CD80 和CD86，從而降低了hAECs 移植后的免疫排斥反應，且hAECs 表達和分泌HLA-G 的水平在用IFN-γ 處理后會增加[17］，因此hAECs 參與維持胎兒耐受性。另外，體外培養的hAECs 可成功移植到裸露的兔角膜上而不發生組織排斥[18］。總之，來源于AM 的hAECs 參與維持胎兒耐受性，具有免疫原性低的特點。

據報道，hAECs 可分泌大量的抗炎蛋白，如激活素a、IL-1 的受體拮抗劑（IL-1-Ra）和IL-10，沉積在羊膜基質內，抵御外來病原體的干擾[4］。另外，將hAECs 移植到博來霉素誘導的小鼠肺損傷模型體內，可以減少肺內轉化生長因子-β、IL-1 和IL-6 等炎性因子的表達，減輕肺纖維化，促進肺損傷的修復[19］。hAECs 還表達凋亡誘導基因FasL、TNF和TRAIL，促進白細胞凋亡[20］。總之，hAECs 具有免疫調節性，在母體和胎兒之間起到免疫屏障作用，同時對病原體產生適當的防御功能，從而保護胎兒免受子宮內病原體的侵害。此外，hAECs 還具有非致瘤性的優點[3］。端粒酶是一種在不斷增殖細胞和腫瘤細胞中高表達的酶[21］。與hES 不同，hAECs 不表達端粒酶活性，在體外增殖過程中始終保持正常核型，并維持未分化狀態[3］。有研究表明，將新鮮分離的hAECs 注射入嚴重聯合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）模型小鼠睪丸中，移植后10 周內均未發現腫瘤形成的證據[22］。

由于hAECs 具有多潛能干細胞特性、免疫原性低、免疫調節性和非致瘤性等特點，已被廣泛應用于多種疾病的治療研究，包括眼科疾病、肺纖維化、肝臟疾病、中樞神經系統損傷等[3］。越來越多的研究將hAECs 應用于婦產科相關疾病治療。

hAECs 對卵巢功能的修復作用早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是女性常見疾病之一。POI 主要特征是女性40歲之前出現雌激素不足或缺乏、促性腺激素水平升高，出現閉經，不孕和絕經前綜合癥，由于雌激素水平低下，導致心腦血管疾病、骨質疏松癥等風險顯著上升[23］。已知POI 的病因包括遺傳性、醫源性、自身免疫性、環境污染等，但絕大多數病因不明。POI 發生后，激素替代療法主要用于補充體內缺乏的雌激素，但不能恢復卵巢功能[24］。近年來，人們嘗試采用各種干細胞進行卵巢功能的修復，如ESCs、脂肪來源的間充質干細胞、人臍帶來源的間充質干細胞、誘導多能干細胞、精原干細胞、卵巢干細胞等[25］。人AM 來源的干細胞成本低，易獲取，創傷小，且hAECs 表現出低免疫原性、非致瘤性和多向分化的能力，已成為治療POI 的理想候選細胞。研究表明，在含有血清替代品補充劑（serum substitute supplement，SSS）的培養基中培養的hAECs 可以分化為卵母細胞樣細胞并表達生殖細胞特異性標志物[26］，且在體外人卵泡液誘導下hAECs 可分化為生殖細胞，形成卵泡樣結構[27］。我們課題組將熒光標記的hAECs 注射入POI 模型小鼠體內，顯示hAECs遷移至小鼠卵巢并分化為顆粒細胞，在接受hAECs移植治療的POI 模型小鼠卵巢中，卵巢功能標記物抗苗勒氏激素表達水平明顯（anti-Müllerian hormone，AMH）升 高[13］，經 過 維 生素C 預 處 理的hAECs 可發揮更好的修復作用[28］。顆粒細胞是卵巢微環境的重要組成部分，在調節生殖卵巢生理（包括排卵和黃體退化）中起關鍵作用，hAECs 顯著抑制TNF-α 介導的顆粒細胞凋亡，并減少受化學損傷卵巢的炎癥反應，促進各級卵泡數增加并改善卵巢功能[29］。越來越多的研究表明，干細胞移植可通過分泌多種營養和免疫調節因子來重塑受損組織中的局部微環境，從而修復受損細胞和組織，并且這些營養因子和免疫調節因子可從無血清條件培養基中獲取[30］。 hAECs 條 件 培 養 基（hAECs conditioned medium，hAEC-CM）中可檢測到分泌的細胞因子，且這些細胞因子可能在血管生成、免疫反應、細胞周期和細胞凋亡等生物學過程中起作用。我們課題組將hAEC-CM 注射到POI 模型小鼠單側卵巢中，卵巢中可觀察到次要和成熟卵泡的數量顯著上升，以及卵泡生長相關基因表達上調。在體外實驗中發現，hAECs 以旁分泌方式顯著抑制原代顆粒-葉黃素細胞內化療誘導的細胞凋亡并激活顆粒細胞的TGF-β/Smad 信號通路[31］，TGF-β 超家族對卵巢的卵泡發育和功能恢復過程起重要作用，如調節卵泡發育、卵泡募集、排卵和黃素化等[32］，并且hAEC-CM 可以促進受傷卵巢的血管生成，并提高共培養系統中人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，hUVECs）成管能力[31-33］。這些研究表明，hAECs 也可通過旁分泌產生的細胞因子來改善受損的卵巢微環境，從而抑制化學療法誘導的細胞凋亡，促進血管生成和調節各級卵泡發育。此外，microRNA 在卵泡發育過程中和POI 發病機理中發揮重要作用[34］，hAECs 衍生的外泌體可通過轉移microRNA 對抗顆粒細胞凋亡來恢復化療誘導的POI 模型小鼠的卵巢功能[35］。我們課題組為了提高hAECs 的歸巢率和存活率以更好地修復受損的卵巢功能，將hAECs 或hAEC-CM包裹在海藻酸鈉生物玻璃（sodium alginatebioglass，SA-BG）中，原位移植到卵巢上，發現SABG 包裹的hAECs 或CM 可以通過保護顆粒細胞功能和促進卵巢血管生成，更好地修復受損的卵巢功能[36］。我們課題組還發現hAECs 的免疫調節機制在卵巢功能修復中也發揮重要作用，hAECs 可通過上調脾臟中的Treg 細胞來恢復自身免疫性卵巢疾病模型小鼠的卵巢功能，并通過旁分泌方式調節卵巢中被激活的巨噬細胞的功能來減少炎癥反應[37］。總之，hAECs 可通過多種途徑修復受損的卵巢功能。

hAECs 對子宮內膜損傷和子宮瘢痕的修復作用子宮內膜分為功能層和基底層，功能層在每個周期中通過生長、轉化、剝脫和再生修復等一系列過程不斷循環再生。隨著人工流產、宮腔鏡手術等增多，子宮內膜損傷越來越常見[38］。輕度損傷可觸發局部炎性反應，促使上皮細胞再生，使子宮內膜達到無纖維瘢痕修復。重度損傷可累及子宮基底層，使子宮內膜細胞減少，腺體數量減少，失去正常的分泌功能，炎癥細胞浸潤吞噬上皮細胞，間質外露，間質細胞纖維活性增加，子宮內膜功能層和基底層失去正常界限，形成上皮再生障礙，無法對激素刺激產生應答，子宮內膜纖維粘連增生，纖維粘連間質中缺乏血管形成瘢痕，引起宮腔部分或完全纖維化，最終導致宮腔縮窄、扭曲甚至宮腔消失，形成宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA），即Asheman 綜合征，造成月經過少、閉經、不孕癥、反復流產、慢性盆腔痛等問題，嚴重困擾患者，至今仍無有效的預防和治療措施[39］。IUA 的治療措施主要聚焦于重建正常的子宮結構并恢復子宮正常功能，宮腔鏡粘連溶解術治療及術后放置球囊并結合激素療法是目前臨床上治療IUA 的主要方法，但效果欠佳且復發率高[39］。近年來應用外源性干細胞移植來改善子宮內膜損傷，為臨床治療重度子宮內膜損傷以獲得妊娠機會提供了新的思路，如使用骨髓來源的間充質干細胞、子宮內膜干細胞、經血干細胞、臍帶干細胞和脂肪干細胞等進行移植都可以幫助子宮內膜再生[40］。聯合應用雌激素和子宮內膜干細胞治療IUA 可使受損的子宮內膜再生并逆轉纖維化，改善子宮內膜微環境并恢復子宮內膜功能，顯著提高了IUA 的治療效果[41］。子宮內膜損傷模型大鼠采用脂肪干細胞移植治療后，受損的子宮內膜微血管密度、宮內膜厚度和腺體都明顯增加，且生育能力得到改善[42］。另一方面，脂肪干細胞移植可能會促進癌細胞生長，子宮內膜干細胞與多種婦科疾病的發病機制有關，如子宮內膜癌、子宮內膜增生、子宮內膜異位癥、子宮內腺肌病等，干細胞的致瘤性，免疫原性等限制了干細胞在子宮內膜修復領域的應用。相比而言，來源于人AM 的hAECs在非創傷性取材、低免疫原性和非致瘤性等方面具有極大優勢。我們課題組研究發現，hAECs 移植治療機械損傷建立的IUA 模型小鼠后，受損子宮內膜中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、增殖細胞核抗原和雌激素受體的表達水平增加，即血管生成能力和基質細胞增殖能力得到改善，促進子宮內膜增厚、內膜腺體增加、膠原沉積減少及產生更多微血管。子宮內膜形態得到改善，從而使得IUA 模型小鼠的妊娠率和產仔數增加[43］。同時，也有研究表明，經過hAECs 移植治療的IUA 模型鼠的促膠原沉積的信號分子表達明顯抑制，如α-SMA、TGF-β1 和TGF-β2 等，但抗纖維化分子TGF-β3 在治療組中表達水平顯著上調[44］。此外，IUA 模型小鼠的子宮內膜基質細胞中存在自噬抑制現象，自噬是細胞面對環境壓力的一種為了自我保護而主動降解的過程，即分解衰老的細胞器并在缺乏營養時提供能量[45］，而在體外hAECs 與子宮內膜基質細胞的共培養系統中，觀察到hAECs 可以激活受損的子宮內膜基質細胞中的自噬，因此，hAECs 可通過激活子宮內膜基質細胞的自噬來促進子宮內膜的修復[43］。

子宮瘢痕憩室（cesarean scar defect，CSD）是剖宮產術后的常見遠期并發癥，定義為剖宮產術子宮瘢痕因愈合不良而導致子宮肌層停止生長，子宮瘢痕處肌層變薄，形成一個與宮腔相通的凹陷或腔隙[46］。隨著剖宮產的增加，CSD 持續上升，世界范圍 內CSD 的患 病率達45.6%～64.5%[47］。 CSD 可引起月經期延長、月經間期流血、慢性盆腔痛、經期腹痛等，此外還可引起繼發性不孕、疤痕妊娠、前置胎盤、子宮破裂等產科并發癥。目前對于改善CSD患者的臨床癥狀或妊娠結局的最佳治療方法尚無共識。我們課題組在體外構建了大鼠剖宮產憩室模型，并且將hAECs 注射到子宮瘢痕周圍，發現hAECs 可通過上調VEGFA 促進血管生成和上調基 質 金 屬 蛋 白 酶-8（matrix metalloproteinase-8，MMP-8）減少膠原沉積，從而對子宮瘢痕進行修復，同時改善妊娠結局[48］。總之，hAECs 的移植治療可以抑制子宮內膜纖維化的進展，并促進子宮內膜血管生成和再生，從而修復子宮內膜損傷，同時也能通過促進瘢痕血管生成和降解瘢痕膠原來修復CSD。

hAECs 的抗腫瘤作用hAECs 除了具有自我更新和分化為各種組織器官的能力，還具有治療癌癥的潛力，主要通過調節血管生成和分泌細胞毒性的細胞因子來發揮抗腫瘤作用。血管生成是胚胎發育、正常生長和組織修復的重要生理過程，血管生成在分子水平上受到嚴格調節。血管生成失調發生在各種病理組織中，也是癌癥的基本病理特征之一[49］。腫瘤血管生成對于向生長中的腫瘤輸送氧氣和營養至關重要，同時在腫瘤病理的其他方面（如代謝失調和腫瘤擴散轉移）也發揮關鍵作用。腫瘤內促血管生成因子和抗血管生成因子之間的不平衡會導致異常的血管網絡建立，其特征是血管擴張不成熟、彎曲混亂和高滲透性，而異常的血管網絡會引起腫瘤血流和氧合的時間和空間異質性及腫瘤間質液壓力升高。這些異常及其形成的低氧微環境促進了腫瘤的生長和轉移，導致化學療法、放射療法和免疫療法的功效降低。為了對抗這種有缺陷的表型，腫瘤脈管系統正常化成為一種新的治療策略[50］。通過血管正常化（即重建腫瘤血管結構和功能）恢復適當的腫瘤灌注和氧合作用，改善腫瘤微環境的代謝狀況，可能會限制腫瘤細胞的侵襲性并提高抗癌治療的有效性[50］。hAECs 來源于胎盤，由于其端粒酶活性喪失，具有非致瘤性，同時也具有低免疫原性、多能干細胞的特征和調節血管形成的能力，因而被廣泛用于組織工程學研究，以增加血液灌注并促進傷口愈合[3］。研究發現，將熒光標記hAECs 經尾靜脈注入到子宮內膜癌模型鼠中，hAECs 歸巢于子宮腫瘤組織，分化為腫瘤血管內皮細胞或血管外周細胞，整合到子宮內膜癌血管結構中，從而增強腫瘤血管的完整性和減少腫瘤血管生成失調，使得腫瘤血管的結構和功能正常化，提高了腫瘤血管灌注的效率，并增強了化療藥物順鉑的細胞毒性作用[51］。另外，hAECs 對上皮性卵巢癌細胞（epithelial ovarian cancer，EOC）具有抑制作用。hAECs 通過分泌TGF-β1 介導癌細胞的細胞周期停滯在G0/G1 期，從而發揮對EOC 生長的抑制作用[52］。體內外研究表明，AM 細胞可能通過抗增殖和促凋亡及調節血管生成和細胞周期等，來抑制腫瘤的生長和侵襲，從而發揮抗癌作用[53］，加之hAECs 在調節血管生成和誘導癌細胞凋亡方面起重要作用，其有望成為抗腫瘤治療的候選者[54］。AM 來源的hAECs 不僅可用于再生醫學，而且具有抗癌能力，hAECs 及其衍生物為婦科惡性腫瘤的抗腫瘤治療提供了新選擇，但將其轉化為臨床應用仍需要進一步研究。

hAECs 對復發性流產的免疫調節作用復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是育齡期女性的一種常見疾病，發病率為1%～5%。RSA 的病因復雜，包括染色體異常、解剖結構異常、感染、內分泌因素和免疫性疾病等。 然而，多達50%～75% 的RSA 病因不清楚，又稱為原因不明的復發性流產（unexplained RSA，URSA）[55］。胚胎成功植入和妊娠維持需要母體對胎兒產生免疫耐受，但在保證妊娠期間胎兒免受母體免疫系統攻擊的同時也要保證對病原體產生防御功能，因此母胎界面正常免疫穩態的建立對順利妊娠至關重要[15］。輔助性T（T helper，Th）細胞及其相關細胞因子在母胎免疫調節中起重要作用，Th 細胞被抗原呈遞細胞激活后，開始克隆擴增和亞群分化（包括Th1 細胞、Th2 細胞、Th17 細胞和Treg 細胞等），同時分泌細胞因子并形成各自的細胞因子譜，從而決定隨后的免疫應答類型，而母胎界面的Treg 細胞減少和Th17/Treg 比值升高可能會令母體形成不適當的胎兒免疫耐受，導致URSA 的發生[56］。細胞因子在母胎之間的信號轉導中也起重要作用：Th1 細胞通常分泌促炎性細胞因子（如IFN-γ、TNF-α 和IL-2），起到抑制胚胎植入和誘導流產的作用，同時Th2 細胞可以分泌抗炎細胞因子（如IL-4、IL-6 和IL-10），通過免疫抑制作用對同種異體反應產生免疫耐受性，有助于維持妊娠，外源性或內源性因素引起的Th1/Th2 比例失衡會破壞母胎界面免疫耐受，從而導致妊娠終止[57］。hAECs 位于與羊水接觸的胎盤最內層，不僅具有多能干細胞的特性，而且通過發揮免疫調節作用來參與胎兒耐受性的維持[3］。hAECs 對被刺激的T 細胞的激活、增殖和促炎因子（IFN-γ 和TNF-α）的產生都有明顯的抑制作用[18］，且hAECs來源的外泌體可通過旁分泌方式介導母胎之間的信號轉導，發揮免疫調節作用并參與分娩啟動[58］。研究表明，hAECs 對URSA 患者的幼稚Th 細胞具有強大的免疫調節作用，包括抑制Th 細胞增殖，促進Th 細胞向亞群Treg 細胞分化，使細胞因子譜偏向Th2 模式以及抑制Th1 和Th17 細胞因子產生[59］。也有研究表明，hAECs 降低了從URSA 患者體內分離出的幼稚CD4+T 細胞活化的能力[60］。T細胞活化后TGF-β1 表達上調，并在活化T 細胞的增殖和分化中發揮關鍵作用[61］，但hAECs 會使活化T 細胞 的TGF-β1 表 達 顯 著降 低，將hAECs與幼稚T細胞共培養后，取上清，觀察到TGF-β1 水平降低[60］。 另外，hAECs 不表達HLA Ⅱ和共刺激分子[18］，從而降低了臨床應用后的免疫排斥風險，并且hAECs 較容易大量地分離出來，同時不受道德倫理的約束。hAECs 是調節母體免疫學異常的干細胞來源，對于RSA 患者，hAECs 可能是調節細胞介導的免疫異常的候選治療藥物之一。

結語目前干細胞治療仍然有許多有待解決的問題，包括治療效果評估、治療穩定性、致癌性、免疫應答、細胞來源和倫理學等方面[1］。胎盤通常在分娩后作為醫療廢物被丟棄，且胎盤的獲取無需其他任何侵入性操作，因此不會引起其他干細胞來源方面固有的倫理問題。一張AM 可分離獲得約2億個hAECs，可制備足夠數量的hAECs 用于疾病治療[3］。 hAECs 是尚未獲得與年齡或環境相關的DNA 損傷的新生細胞，免疫原性低[9］。hAECs 具有遺傳穩定性，移植到免疫缺陷小鼠體內不會形成腫瘤[22］。與其他干細胞相比，hAECs 具有明顯優勢，是干細胞治療的理想種子細胞。 在婦產科領域，hAECs 已被用于卵巢功能修復治療、子宮內膜損傷修復治療、剖宮產憩室修復治療、婦科惡性腫瘤抗腫瘤治療、復發性流產免疫調節治療等研究中，具有廣闊的應用前景。但真正應用于臨床，仍需要進行多中心、大規模、前瞻性的臨床研究評估，從而為今后hAECs 在婦產科相關疾病治療中的臨床應用提供理論依據。

作者貢獻聲明王璐璐 文獻調研，論文構思、撰寫和修訂。賴東梅 文獻調研，監督指導，論文修訂和終審。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。