腺相關病毒載體優化的研究進展

翟貫星（綜述） 傅衛輝 徐建青 張曉燕（審校）

（復旦大學附屬公共衛生臨床中心 上海 201508）

腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）是感染人和一些其他靈長類動物的小型（20 nm）復制缺陷的非包膜病毒，屬于細小病毒科（Parvoviridae）。AAV 依賴與其他病毒（主要是腺病毒）共同感染進行復制，最初在腺病毒制劑的污染物中被發現，并因此得名[1-2］。 AAV 有9 種常見血清型（AAV 1～9），還 存 在AAV10、AAV-DJ、AAV-DJ/8 等血清型。AAV 基因組包含兩個開放閱讀框：Rep 與Cap（圖1）。AAV 病毒缺乏明顯的致病性，目前尚不清楚AAV 是否會引起疾病，但會引起非常溫和的免疫反應。

圖1 AAV 基因組Fig 1 Viral genome of AAV

AAV 能夠同時感染分裂和靜止期的細胞。AAV 載體基因組可以作為附加體存在于細胞內，在各種實驗環境中也觀察到了載體整合。某些情況下，整合對于AAV 載體的治療或實驗效果至關重要[3］，AAV 具有在人類19 號染色體上特定位點（稱為AAVS1）穩定整合到宿主細胞基因組中的能力[4-5］。AAV 穩定整合的特點使其比逆轉錄病毒更具可預測性。不同血清型的AAV 病毒也具有不同的組織親和性[6］。AAV 作為基因治療載體，通過在載體上移除Rep與Cap消除其整合能力，所需基因與啟動子一起插入反向末端重復序列（inverted terminal repeat，ITR）之間，該序列有助于單鏈載體DNA 被宿主細胞DNA 聚合酶復合物轉化為雙鏈后在細胞核中形成串聯體[7］。在未分裂細胞中，這些串聯體在宿主細胞生命周期中保持完整；在分裂細胞中，游離DNA 不隨宿主細胞DNA 復制，AAV 的DNA通過細胞分裂而丟失[8］。AAV 的DNA 隨 機整合到基因組的發生頻率很低[8］。AAV 具有非常低的免疫原性，僅限于中和抗體的產生，而不會誘導細胞毒性反應[9-11］。較低的免疫原性和感染靜止細胞的能力，使AAV 非常適合作為人類基因治療的載體。

AAV 作為載體具有廣泛的應用前景，既可以用于腫瘤的治療（如黑色素瘤）[12］，也可作為載體構建疫苗（如HIV 疫苗）[13］，還可以作為免疫治療載體用于慢性感染疾病的治療（如乙型肝炎）[14］。AAV 在流感預防方面也有一定的應用，AAV 介導的抗體表達能夠保護老年和免疫缺陷小鼠免受流感病毒的損 傷[15］。 目前已有Glybera （AAV1）、Luxturna（AAV2）和Zolgensma（AAV9） 3 種基于野生型AAV 的基因治療產品上市[16］。許多AAV產品已經用于臨床Ⅰ期、Ⅱ期與Ⅲ期試驗。其中，有Ⅰ期臨床試驗采用AAV2 作為載體，用正常基因替換芳香族L-胺基酸類脫羧基酶（aromatic L-amino acid decarboxylase ADCC）缺乏癥患者的缺陷基因，主要靶 向 于腦部[17］。AveXis 公司用AAV9 研究 開 發的基因治療產品SMN，主要作用于脊髓，能夠治療脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy，SMA）患者，目前已經處于臨床Ⅲ期階段[17］。AAV 用于基因治療，不僅可以替換原有缺陷基因，也可以沉默、編輯缺陷基因，還能夠增加新的基因[18］。

為了實現更低、更安全的載體劑量，需要提高AAV 轉導效率、逃逸中和抗體、提高細胞/組織特異性。對AAV 本身進行改造，如對衣殼蛋白進行改造，不僅可以提高AAV 的轉導效率和靶向性，還能減輕體液免疫和細胞免疫，從而降低重組蛋白的免疫原性。根據不同的組織親和性，選擇不同血清型AAV，并針對某個器官組織使用特定的啟動子。對AAV 應用方面的改造有添加調控元件對AAV 表達進行調控及通過AAV 作為載體進行基因編輯等。本文將對AAV 載體改造及與應用改造的研究進展進行梳理。

AVV 載體的優化策略

增強AAV 對宿主的感染效率 AAV 感染效率比逆轉錄病毒載體低[19］，天然存在的AAV 血清型不能很好地適應臨床的需求，需進一步改造和優化。通過對AAV 的衣殼進行修飾與突變，能夠篩選出感染效率高的AAV 突變體，有利于AAV 載體傳 遞目的基 因。2019年，Bertin 等[20］對AAV2 的衣殼進行分子工程設計，通過對衣殼進行糖基化修飾，在3 個細胞系（HeLa、Huh7 和ARPE-19）中轉基因表達增加了1.3～2.5 倍，糖基化位點修飾的AAV在B 型血友病小鼠模型中，肝基因轉移引起人凝血因子（F）Ⅸ水平增加2 倍，而其T/B 細胞免疫反應并未改變。在玻璃體內基因轉移顯示綠色熒光蛋白表達增加約2～4 倍，并增強了整個視網膜的滲透，表明通過將衣殼蛋白糖基化能夠增強基因的傳遞，在肝和眼方面的基因治療中具有很好的翻譯潛力。Ran 等[21］也通過在rAAV-DJ 和rAAV-LK03 衣殼上對表面暴露的酪氨酸（Y）、絲氨酸（S）、天冬氨酸（D）和色氨酸（W）殘基進行定點誘變，產生的突變AAV 載 體rAAV-DJ-S269T、 rAAV-LK03-Y705+731F 與野生型相比，轉導效率顯著增強，提示定點誘變策略適用于其他非天然AAV，促進AAV 在人類基因治療中的應用。

為檢測AAV 轉染效率，Hanlon 等[22］設計了一個AAV 文庫構建體iTransduce，通過將AAV9 衣殼上的一個肽文庫與一個Cre 盒相結合，能夠靈敏地檢測轉基因表達。其中一種衣殼AAV-F 介導的大腦皮層轉基因表達比親代AAV9 高65 倍（星形細胞）和171 倍（神經元），這種高轉導效率無性別依賴性，并且在兩種小鼠品系（C57BL/6 和BALB/c）中均能持續高效轉導，使其成為小鼠中樞神經系統轉導中具有應用前景的衣殼載體。

降低機體對AAV 載體的免疫反應 AAV 雖然免疫原性低，但是仍會引起人體的免疫反應，40%～80% 的成人有過AAV 感染，因此可能會引起免疫排斥反應。人體中存在的針對AAV 的中和抗體構成了一項重大挑戰，限制了使用重組AAV 載體進行基因治療的臨床試驗，對AAV 衣殼進行突變或修飾能夠有效避免中和抗體的作用。

AAV 衣殼蛋白的定向進化路徑尚未明確。Pei等[23］通過定向進化的方法在活體內分離出可轉導入人肝細胞并逃避中和抗體的AAV 突變體LP2-10。LP2-10 由AAV 2、6、8 和9 不同血清型的衣殼組成，VP3 亞基衍生自與AAV6 的261～272 殘基進行交換的AAV8，LP2-10 既能夠轉導入人類肝細胞，又表現出比其他血清型更強的逃避靜脈免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）和（大多數人）血清中和抗體的能力。Tse 等[24］通過結構指導的方法來進化具有可變抗原的AAV 突變體，這種策略產生了高度分散的抗原，這種抗原在天然AAV分離株中不存在，因此無法被已存在的抗體識別。Selot 等[25］通過定點誘變篩選 出AAVrh.10 S671A突變體，不僅進入細胞的能力增強，并且在體內能夠迅速遷移到核周區域，進一步提高其在肝中的基因轉移效率。更重要的是，突變的AAVrh.10S617A能夠規避預先免疫動物的中和抗體作用（27～64倍）。開發逃避宿主中和抗體的AAV 載體系統將大大拓寬人類基因治療應用的范圍。

將AAV 衣殼進行化學修飾能夠有效避免中和抗體的作用。Mével 等[26］將N-乙酰半乳糖胺配體耦聯到AAV 衣殼的表面，以去唾液酸糖蛋白受體介導肝細胞的靶向遞送。化學修飾的衣殼顯示出與中和抗體的相互作用減少，揭示通過化學耦聯AAV的方法可能降低載體免疫反應。

AAV 通過外泌體包裹的形式降低AAV 的免疫反應。 Meliani 等[27］使用外泌體相關的AAV（exosome-associated AAV，Exo-AAV）作為肝臟基因傳遞系統，在降低治療性載體劑量的同時，防止機體對衣殼的體液免疫。Exo-AAV 載體可提高肝臟定向基因轉移的安全性和有效性。

提高AAV 的靶向性 為了更有效地轉導治療基因和靶向特定的組織或細胞，需要對AAV 載體進行改造以提高靶向性。

AAV 定向進化能夠篩選出靶向性高的AAV衣殼結構。 Davidsson 等[28］建立了BRAVE（barcoded rational AAV vector evolution）法對AAV進行優化。 通過BRAVE 方法，每個病毒顆粒在AAV 衣殼表面都具有已知功能的肽，并在包裝的基因組中具有獨特的分子條形碼，從單代篩選的RNA表達條形碼測序可以同時繪制數百種蛋白質的推定結合序列，在體內進行一次篩選就可大規模選擇工程化AAV 衣殼結構。使用BRAVE 方法和基于隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）統計的聚類，展示了25 種具有精細特性的合成衣殼變體，將此類病毒設計為在體內靶向人多巴胺神經元，并沿著大腦中的相連途徑運輸，從而實現前所未有的治療準確性。

AAV 啟動子和血清型是決定轉基因表達動態的兩個關鍵因素。開發適合特異性細胞或組織的啟動子可以實現對特定組織的靶向性。Nieuwenhuis 等[29］將4 種常用啟動子[短的CMV 早期增強子/雞β肌動蛋白（short CMV early enhancer/chicken β actin，sCAG）、人類巨細胞病毒（human cytomegalovirus，hCMV）、小鼠磷酸甘油酸激酶（mouse phosphoglycerate kinase，mPGK）與人類突觸蛋白（human synapsin，hSYN）］分別包裝進AAV1 中，然后注射到大鼠和小鼠的感覺運動皮層中以轉導皮質脊髓束。帶有hCMV 和sCAG 啟動子的AAV1 載體在神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞中具有轉基因表達，mPGK 和hSYN 啟動子具有最強的轉基因表達，mPGK 啟動子驅動了在皮質神經元和少突膠質細胞中的表達，而帶有hSYN啟動子的AAV 轉導誘導了神經元特異性表達，包括周圍神經網中的中間神經元和V 層的皮質脊髓神經元。這一研究有助于改善轉基因在大腦和脊髓的傳遞，皮質脊髓束的優化轉導有助于研究脊髓損傷。

擴展AAV 載體容量 AAV 載體容量小，目前最多只能容納4.7 kb 外源DNA 片段，通過相關技術擴展AAV 載體容量才能攜帶大型基因。

由內含肽（intein）介導的蛋白質反式剪接被單細胞生物體用來重構蛋白質。Levy 等[30］報道了雙AAV 系統在遞送分隔的胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器，然后通過反式剪接內含肽對其進行重構。在小鼠大腦（未分類皮質組織高達59%）、肝臟（38%）、視網膜（38%）、心臟（20%）和骨骼肌（9%）等部位的治療相關效率與劑量下，優化的雙AAV 系統可進行體內堿基編輯。結果顯示，堿基編輯可以糾正小鼠腦組織中引起C 型尼曼- 皮克病（Niemann-Pick disease，NP）的突變，修正后能延緩神經變性并延長壽命。優化的遞送載體有助于將靶向點突變有效引入多個目的組織中。Tornabene 等[31］通過內含肽在小鼠、豬以及人的視網膜中進行蛋白質反式剪接和全長蛋白重構，能夠重建大型治療性蛋白質，改善了兩種視網膜遺傳性疾病小鼠的表型。通過內含肽介導的蛋白質反式剪接結合AAV 對視網膜進行遞送，可治療大型基因突變導致的遺傳性失明。

Maddalena 等[32］設計的三AAV 系統最多能轉移14 kb 的基因，首先應用于Alstr?m 綜合征（Alstr?m syndrome type Ⅰ，ALMS1）中，因為ALMS1 基因突變會導致常染色體隱性遺傳性疾病。三AAV 系統轉導后的轉錄組學分析顯示，預期的全長產物與許多異常轉錄產物一致，但是只有全長轉錄本可以在體內有效翻譯。三AAV 載體轉導約4% 的小鼠感光體，并顯示ALMS基因的正確定位。低感光素轉導水平可能證明，在ALMS 小鼠模型的視網膜中出現了適度和短暫的改善。在豬視網膜中觀察到三AAV 載體的轉導水平達到單AAV 載體的40%，這預示需要進一步提高三AAV 載體在視網膜中的轉導效率。

優化調控AAV 載體基因表達的策略

調控AAV 載體的基因表達 基因治療技術的廣泛使用受到缺乏小型遺傳開關的限制，RNA 介導的基因調節可控制轉基因表達而無需其他蛋白質成分。

Zhong 等[33］設計了一種Ⅲ型錘頭狀核酶，以開發在哺乳動物mRNA 上高效的RNA 開關，并顯示它們可以被位阻的反義寡核苷酸嚴格調控。變體核酶能夠在體內調節AAV 傳遞的轉基因，從而在至少43 周內對蛋白質表達進行劑量依賴性控制，最多可達223 倍。這些可逆開關在慢性腎臟病貧血基因治療中的測試證明，寡核苷酸可調節促紅細胞生成素在生理水平的表達。這種小型、模塊化和高效的RNA 開關可提高安全性和功效，并拓寬基因療法的使用范圍。Remes 等[34］利用AAV 介導的RNA發夾激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）誘餌寡核苷酸（decoy oligonucleotide，dON）遞送，可能有效改善小鼠主動脈同種異體移植模型中的血管病變。AP-1 dON 處理可顯著降低41.5% 的移植物中的內膜-中膜比率（P＜0.05）。在處理過的主動脈移植物中，黏附分子、細胞因子的表達以及增生的平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）、基質金屬蛋白酶9陽性細胞和炎性細胞浸潤的數量均顯著降低，證明了抗AP-1 的RNA dON 方法在動物模型中治療同種異體血管病變的可行性、功效和特異性。 基于AAV 的方法提供了將基于核酸的治療劑延長遞送至血管壁的可能性。 侯愛生等[35］通過構建表達shRNA 的rAAV 載體，建立了一種敲減小鼠海馬EAAT3 表達的動物模型，為進一步研究EAAT3 調控機制和相關分子信號通路打下研究基礎。邢夢瑤 等[36］通 過rAAV9 介 導 的RNA干擾能有效抑制H9c2 細胞NF-κB p65 基因的表達，抑制p65 基因表達對H9c2 細胞活力無明顯抑制，但能減少Ang Ⅱ誘導的細胞凋亡。

亮氨酸拉鏈（或亮氨酸剪刀[37］）是蛋白質中常見的三維結構基序，在AAV 衣殼上進行亮氨酸拉鏈的修飾，通過拉鏈結構對基因表達進行調控，翻譯后將外源肽和蛋白質整合到AAV 衣殼上，同時保留載體功能。基于此，Thadani 等[38］展示了一個模塊化平臺，用亮氨酸拉鏈卷曲螺旋結合基序裝飾AAV 衣殼，形成特定的非共價異二聚體。通過鎳柱親和力證明，AAV 衣殼可通過這種方法成功展示6組氨酸標記的肽。該蛋白質展示平臺可以促進在AAV 表面上摻入生物部分，從而擴大載體增強和工程改造的可能性。

基因編輯技術提高AAV 載體的精準度 AAV與CRISPR-Cas 技術相結合能夠對靶向部位進行精準 的 編 輯[39］。AAV 是CRISPR-Cas 的 主 要候選 載體，可用于在體內進行治療性基因組編輯。Hanlon等[40］觀察到高水平AAV 整合（高達47%）到Cas9 誘導的鼠類神經元、小鼠大腦、肌肉和耳蝸治療相關基因中的雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）區，小鼠腦中全基因組AAV 定位顯示，除CRISPR/Cas9 目標位點外，AAV 整合并未增加。然而，基于CRISPR-Cas9 的體內肝臟基因組編輯存在功效和安全性問題[41］，Li 等[42］提出的解決方法是，通過自刪除AAV-CRISPR 系統，將插入和缺失突變引入AAV 附加體，該系統顯著降低金黃色葡萄球菌的Cas9 蛋白水平，同時在肝臟中實現了高目標編輯率，在預測的潛在脫靶位點均未觀察到自缺失Cas9誘導RNA 脫靶，該系統高效且通用。這種自我刪除的AAV-CRISPR 系統有助于實現人類肝臟基因組編輯。Zhang 等[43］在單鏈AAV 中包裝了Cas9 核酸酶，在自互補AAV（self-complementary AAV，scAAV）中包裝了CRISPR sgRNA，并將該雙AAV系統送入杜氏肌營養不良癥（duchenne muscular dystrophy，DMD）小鼠模型中，有效的基因組編輯所需的自互補AAV 劑量比單鏈AAV 低至少20 倍。王娟[44］設計的AAV-SaCas9-sgRNA，通過約3.2 kb的SaCas9 與AAV9 載體介導CRISPR-Cas9 系統，靶向肌肉生長抑制素（myostatin）基因敲除，無論在體外NIH3T3 細胞模型中，還是在小鼠模型中，都顯著提高肌肉生長抑制素蛋白的表達量，從而引起肌肉性狀發生明顯變化。

在體外細胞實驗中，AAV 與CRISPR 能夠較好地實現體外編輯。Kumar 等[45］利用金黃色葡萄球菌的Cas9（SaCas9）開 發AAV，可 在 人 類 衍 生 的293FT 細胞和小鼠衍生的Neuro2A（N2A）細胞中進行體外基因組編輯，以及在小鼠腦神經元中進行體內基因組編輯，還證明了其有能力調節Dox 和Cre 重組酶在空間上的基因組編輯。這些系統的組合使AAV 介導的CRISPR-Cas9 基因組編輯能夠在空間和時間上得到調節。鄒定峰等[46］在體內睪丸組織中對特異性敲除的人源Wee1 基因進行編輯。

Hung 等[47］研究發現，AAV2 介導的SpCas9 與靶向YFP sgRNA 的體內遞送能顯著減少轉基因小鼠模型視網膜的黃色熒光YFP 細胞數量。與LacZsgRNA 處理的眼睛相比，感染YFP sgRNA 的視網膜細胞中YFP 陽性細胞減少了84.0%。與未經治療的對側眼睛相比，AAV2 介導CRISPR-Cas 遞送后，視網膜電圖譜分析未發現視網膜功能發生明顯改變。表明AAV 是進行CRISPR 基因編輯的良好載體。

AAV 載體的安全性隱患最近，研究人員對患有A 型血友病的9 只狗進行AAV 基因治療，并隨訪長達10年。結果顯示，表達犬凝血因子Ⅷ（canine factor Ⅷ，cFⅧ）的AAV8 或AAV9 載體AAV-cFⅧ能夠將缺乏的凝血因子Ⅷ校正至正常水平的1.9%～11.3%。其中，2 只狗中Ⅷ活性在治療后約4年開始逐漸增加，并沒有狗顯示出腫瘤或者肝功能改變的跡象。從6 只狗的肝臟樣品基因組DNA 中分析了1741 個獨特的AAV 整合事件，在5 只狗中發現了細胞克隆增生，其中44% 的基因整合涉及細胞生長。所有恢復的整合載體均被部分刪除和/或重新排列。這些數據表明，2 只狗中cFⅧ蛋白表達的增加可能是由于攜帶整合載體的細胞克隆擴增所致。早在2020年1月，一項針對狗的血友病研究表明，AAV 可以輕易將其攜帶的基因插入到宿主DNA 中，并且插入位置靠近調控細胞生長的基因，可能誘發癌癥[48］。

這些結果支持了在A 型血友病中針對肝臟的AAV 基因治療的臨床開發，同時強調了對接受AAV 載體治療中潛在遺傳毒性進行長期監測的重要性。

結語目前AAV 的研究包括蛋白替代療法、基因編輯、基因沉默等，需要根據不同的組織和器官設計出不同的AAV 以滿足不同的需求。 隨著AAV 相關研究的發展，AAV 逐漸克服了基因治療方面的挑戰，例如轉基因維持、安全性、宿主免疫應答和靶標疾病，越來越能夠滿足人們的期望[49］。AAV 載體系統具有很高的安全性，已成為越來越成多基因治療方法的首選載體[50］。 因此，需要解決AAV 載體設計、生產平臺、產品的定量和質量控制，以及AAV 可能存在的安全隱患問題，以推動AAV基因治療進一步發展。

作者貢獻聲明翟貫星 文獻收集，制圖，論文撰寫和修訂。傅衛輝 論文審閱和指導。徐建青 論文寫作指導。張曉燕 論文審核和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。