GelMA 水凝膠在骨組織工程中的研究進展

張孝利（綜述） 余優(yōu)成（審校） 吳興文 孫 健

（復旦大學附屬中山醫(yī)院口腔科 上海 200032）

自19 世紀60年代起，瑞典的Branemark 在實驗中偶然發(fā)現純鈦可以和骨組織發(fā)生緊密結合，之后他提出“骨結合”理論，為當代口腔種植學的發(fā)展奠定基礎[1］。種植修復目前是牙列缺損、牙列缺失首選的修復方法。患者因牙周炎、長期牙缺失、全身疾病、外傷及腫瘤術后的牙槽骨缺損是種植修復的一項難題。充足的骨量是種植體完成骨結合并維持其長期穩(wěn)定的必要條件，種植位點骨量嚴重不足須進行骨增量手術[2］，因此在臨床上需要有效填補骨缺損的材料。目前骨移植方法有：自體骨移植、同種異體骨異種骨和人工骨移植。盡管自體骨移植是目前骨移植材料的“金標準”[3］，但它可能導致的并發(fā)癥（如供區(qū)發(fā)病和移植失敗等）是對大多數醫(yī)師的挑戰(zhàn)。同種異體骨移植經過輻照或冷凍干燥處理而失活，降低了骨誘導性，最終可能導致移植失敗[3］。同時，同種異體骨的取材問題也無法滿足臨床需求。

在臨床迫切需求的驅動下，骨組織工程應運而生。 最近的研究表明，明膠甲基丙烯酰基（gelatin methylacryloyl，GelMA）水凝膠因其獨特的光交聯特性，可以加工成不同形貌的水凝膠支架材料。同時，因其降解性能可控，力學性能可控，生物相容性好，在骨缺損修復材料領域具有廣闊應用前景，所以基于GelMA 的水凝膠在骨組織工程的應用引起了廣泛研究。

GelMA 特點GelMA 是一種明膠衍生物，由Van Den Bulcke 等[4］于2000年首次合成。明膠是膠原蛋白的水解產物，具有溶解性好、抗原性低等優(yōu)點[5］。 另外明膠保持了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）氨基酸序列，這有利于細胞黏附、增殖和分化[4］。 明 膠 含 有 基 質 金 屬 蛋 白 酶（matrix metalloproteinase，MMP），有利于細胞重塑和進一步提高明膠理化性質[6］。GelMA 水凝膠通常是由甲基丙烯酸酐與明膠反應得到，并且在光引發(fā)劑下進行光交聯產生的。光交聯可在溫和的條件（室溫、中性pH 值等）進行。GelMA 水凝膠因含有少于5% 的甲基丙烯酸酐，使明膠的大多數功能性氨基酸基序，包括RGD 和MMP 不受顯著影響，從而保留明膠的大部分性能[7］。

與其他現有的水凝膠形成生物材料相比，GelMA 水凝膠可通過添加各種生物材料或者不同的合成工藝來滿足骨組織工程應用材料的要求。

GelMA 與成骨生成相關研究

工藝因素對骨再生性能及機械力學性能的影響 不同研究發(fā)現通過改變聚合物濃度、甲基化程度和紫外光強度等，可對骨再生性能或力學性能產生影響。Celikkin 等[8］通過研究凝膠濃度對水凝膠支架骨再生性能的影響，發(fā)現5%（w/v）GelMA 水凝膠和10%（w/v）GelMA 水凝膠在骨髓間充質干細胞成骨分化培養(yǎng)基中，均表現出良好的成骨分化。研究發(fā)現GelMA 水凝膠的孔徑與合成過程中使用的GelMA 濃度成反比。5%（w/v%）GelMA 水凝膠具有明顯較大的孔徑，使同源鈣離子通過率和擴散率增加。結果表明，5%GelMA 濃度的水凝膠體外骨再生性能優(yōu)于10%GelMA 濃度的水凝膠。

盡管GelMA 水凝膠具有細胞黏附、增殖、分化等利于成骨的性質，但力學性能不足限制了其作為承載材料的應用。Wang 等[9］采用光交聯聚合的方法，利用GelMA 和葡聚糖甲基丙烯酸縮水甘油酯（dextran glycidyl methacrylate，DexMA）制備了新型雙組分聚合物水凝膠GelMA-DexMA。 通過控制甲基丙烯酸縮水甘油酯在DexMA 中的取代度（degree of substitution，DS），可以獲得較好的機械性能。結果表明，GelMA-DexMA 呈蜂窩狀結構，孔徑隨DS 增加而減小，表現出較低的溶脹比和較高的壓縮模量。

聚合過程中的紫外線UV 劑量也在GelMA 的機械性能中起關鍵作用。例如，增加紫外線劑量會降低細胞的整體存活率，而優(yōu)化紫外線照射時間可以在保持細胞存活率和促進細胞分化水平的同時改善機械特性[10］。Wang 等[11］采用紫外光交聯法合成了GelMA/聚乙二醇二丙烯酸酯（poly ethylene glycol diacrylate，PEGDA）水凝膠，通過改變光引發(fā)劑I2959 和PEGDA 的用量，可以很容易地控制膠凝時間。另外研究發(fā)現此型凝膠的機械強度、擴散速率和溶脹速率均有所提高，力學性能遠遠超過GelMA。

加入不同材料對骨再生性能及機械力學性能的影響 骨移植材料都應至少具備以下一種生物特性：（1）骨傳導性，提供支架幫助組織長入和新骨沉積；（2）骨誘導性，分泌因子誘導骨前體細胞分化成骨；（3）成骨作用，提供具有成骨潛能的骨祖細胞。

骨缺損修復材料還需要有較好的結構穩(wěn)定性。由于GelMA 的柔韌性不理想，成膜結構脆弱以及操作困難等，所以不利于作為人工骨材料應用。 因此，Wang 等在GelMA/PEGDA 的基礎上加入納米羥 基磷灰 石（nano-hydroxyapatite，nHA），制備了GelMA-PEGDA-nHA 復合水凝膠涂料。與GelMAPEGDA 水凝膠相比，nHA 的加入可以控制復合水凝膠的力學性能并降低降解速率。

各種磷酸鈣已被用作骨替代材料，而不是自體移植物。其中，羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）和可生物降解的磷酸鈣在臨床上應用最為廣泛。磷酸八鈣（octacalcium phosphate，OCP）是一種可生物降解的材料，有人認為OCP 是骨骼和牙齒磷灰石晶體的前身[12］。Anada 等[13］采用兩步數字光處理技術，用含有OCP 的GelMA 環(huán)來模擬骨皮質，進一步證明在凝膠中均勻嵌入的OCP 能促進間充質干細胞向成骨細胞分化。Qiao 等[14］合成了一種光交聯的成骨增強肽（osteogenic growth peptide，OGP），然后通過GelMA 共交聯OGP 生成了GelMA-c-OGP。GelMA-c-OGP 的機械壓縮性能達到90 kPa，優(yōu)于GelMA。而且Gelma-c-OGP 具有降解作用，有利于OGP 的釋放。此外，GelMA-c-OGP 水凝膠支架在體外可促進成骨細胞的分化，增加新骨的形成。

脫鈣骨基質（demineralized bone matrix，DBM）已經成為骨再生領域研究最多的材料之一，并被定位為有吸引力的替代物。因此Ramis 等[15］研究采用C2C12 細胞和臍帶間充質干細胞體外誘導成骨，體內異位成骨模型通過配制甘油（Gly）、透明質酸（HA）和GelMA 分別作為DBM 載體，比較其物理化學性能，如微觀結構、抗壓強度和血清黏附性以及細胞毒性試驗和堿性磷酸酶的活性，以此評估DBM 在體外誘導分化為成骨細胞的效果。研究結果表明，在物理化學性能測定方面，GelMA 制劑作為載體優(yōu)于其他制劑。另外，GelMA 具有更加致密的結構、低細胞毒性和高堿性磷酸酶活性，相比而言具有最大的骨誘導潛力，而且新骨和骨髓形成的比例更高。

Zheng 等[16］制備一種由有機-無機復合生物誘導的水凝膠，其通過連續(xù)的物理和化學交聯方法，運用生物活性玻璃（bioactive glass，BG）和GelMA制備復合材料水凝膠，同樣使其壓縮模量顯著提高。除此之外，在凝膠中加入BG 還可以顯著提高該復合水凝膠的穩(wěn)定性和生物活性，從而促進細胞附著、增殖和成骨分化。除了可加入BG 以外，Xin等[17］將 生 物 活 性 玻 璃 納 米 粒 子（mesoporous bioactive glass nanoparticles，MBGNS）作為無機組分制備了一種新型增強型GelMA 復合交聯材料，即具有雙網絡結構的GelMA-G-MBGNS 水凝膠。相比較BG/GelMA 復合水凝膠，GelMA-G-MBGNS水凝膠具有結構穩(wěn)定性更好，力學性能優(yōu)，降解速率可控，周圍微環(huán)境穩(wěn)定的優(yōu)點。內環(huán)境穩(wěn)定對細胞增殖和分化具有重要意義，因此，這種水凝膠膜的應用可能為骨組織工程中治療骨缺損和其他類型的損傷提供一個好的材料。

機械性能也是設計成功的骨缺損修復材料所必需的。添加剛性材料是改善凝膠機械強度的一種方法。由GelMA 和納米金剛石（nanodiamonds，Nds）組成的新型納米復合水凝膠，既控制間充質干細胞（HASCS）的成骨作用，也增強了GelMA 水凝膠 的力學性能[18］。同樣 道理，將GelMA 與HAP 混合，成功地制備了GelMA-HAP 復合化水凝膠，其力學強度高于純GelMA 水凝膠。Levett 等[19］也通過在GelMA 凝膠中加入糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）改善凝膠的力學性能。

不僅如此，相關研究發(fā)現水凝膠和支架之間的共價鍵結合也可以提高機械強度。

GelMA 與血管生成相關研究骨是一種高度血管化的組織，具有獨特而復雜的結構。骨替代材料被植入大型骨缺損時，血管化不足常常導致骨再生不良。在大塊骨移植中實現早期血管形成以提供營養(yǎng)和氧氣仍然是一個挑戰(zhàn)。

血管能夠為細胞提供營養(yǎng)和氧氣[20］，避免了相關組織壞死，所以血管對于治療骨缺損尤為重要。骨由包含血管滲透網的外周皮質和高度血管化的內部骨髓間隙組成。Anada 等[13］采用兩步數字光處理技術，用含有OCP 的GelMA 環(huán)來模擬骨皮質，用含有人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的中心GelMA 環(huán)來模擬骨髓腔，以制備骨仿生的3D 水凝膠材料。這種具有仿生雙環(huán)結構的細胞負載型水凝膠骨構建物有望應用于骨組織缺損的修復中。

血管內皮生長因子被認為能促進血管生成。運用含有不同濃度血管內皮生長因子的GelMA 水凝膠可以促進微血管形成[21］，并通過3D 打印方法確定結構。Lai 等[22］制備了載有血管內皮生長因子的GelMA/carboxybetaine methacrylate（CBMA）水凝膠，可以在體內控制血管內皮生長因子釋放，從而誘導更大程度的血管生成。

Byambaa 等[21］提出了這種基于擠壓的直接生物打印方法，可用于制造具有血管功能的類骨組織結構。 其中含有人骨髓間充質干細胞（human mesenchymal stem cell，HMSC）和血管內皮生長因子的GelMA 水凝膠通過3D 打印使可灌注血管的形成成為可能。 另外他們設計用硅酸鹽納米片的GelMA-HMSC 水凝膠作為外層誘導成骨，促使微血管形成。然而，這種方法只能確保通道附近的細胞存活。使3D 打印的支架向成熟組織轉變，將血管生成方面相容性高的細胞與良好的3D 打印特性結合起來仍然是需要解決的重要問題。Stratesteffen[23］將膠原蛋白加入水凝膠中形成水凝膠混合物（GelMA-collagen blends）增加了細胞間的聚集能力。

細胞微環(huán)境在改善組織的細胞反應和功能方面起著至關重要的作用。 模擬天然細胞外基質（extracellular matrix，ECM）并能夠釋放生長因子的支架是組織工程應用研究的重要內容。Modaresifar等[24］通過光聚合制備水凝膠，開發(fā)了GelMA/殼聚糖納米顆粒復合水凝膠以遞送血管生成生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）。由于其生物相容性結構和提供bFGF 持續(xù)釋放的情況，GelMA/殼聚糖納米顆粒可以顯著促進細胞增殖。這種水凝膠支架可用于在各種應用中有效遞送bFGF，特別是用于血管生成。

除了解內源性血管因子的血管化作用，還要了解外源性血管內皮生長因子血管化作用。研究表明，無血管內皮生長因子的Integrin a2b1 整合素特異性的多肽GFOGER 型水凝膠體內血管化水平高于無血管內皮生長因子的Integrin avb3 整合素靶向多肽GRGDPC 型水凝膠，并與含有血管內皮生長因子grgdpc（RGD）水凝膠體內血管化水平相似，證實了整合素單獨指導和引導血管生成水平和調節(jié)血管生成蛋白的生物學活性的能力，所以在再生醫(yī)學應用中開發(fā)整合素特異性十分重要。生長因子蛋白質價格的昂貴和重要的監(jiān)管問題，通過簡單的功能化技術來設計支架以減少或完全消除對生長因子的需求，可以大大提高未來再生醫(yī)學構建的臨床療效[25］。

在促進血管生成的因素中，某些離子最近被認為是一種有效的元素。Dashnyam 等[26］設計了一種支架，將藻酸鈉水凝膠注入纖維支架中。他們采用表面硅酸鹽涂層技術，使負載的硅酸鹽離子持續(xù)釋放在一周以上，誘導血管生成和促進表面成骨活性。研究證實通過硅酸鹽離子促進血管生成，血管加速生成刺激骨骼修復過程。此種復合型水凝膠具有可加工性、形狀可塑性等優(yōu)點。

Vishnu 等[27］以甲殼素和聚丁二酸丁二醇酯（polybutylene succinate，PBSu）為原料，分別以（250±20）nm 纖維蛋白納米粒（fibrin nanoparticles，FNPs）和摻鎂生物玻璃（magnesium-doped bioglass，MBG）為載體，制備了可注射的水凝膠體。研究證明含有2%MBG 和2%FNPs 的水凝膠體系既能促進血管化，也能促進成骨，而且這種凝膠有可能用于不規(guī)則骨缺損的有效再生。

結語GelMA 水凝膠因其獨特的特質，所以在骨缺損修復材料領域具有廣闊應用前景。隨著生物醫(yī)學和材料科學知識及技術的不斷發(fā)展，基于天然水凝膠的生物材料在骨組織工程的應用研究取得了諸多進展，并且已經開始進行臨床轉化。然而需要研究具有良好的成骨性能、機械性能、血管功能化凝膠支架以及精確成形支架是目前骨組織工程應用研究的內容以及挑戰(zhàn)。隨著組織工程學的發(fā)展以及研究的深入，有望構建出高度仿生的骨缺損修復材料，以便更好地用于臨床。

作者貢獻聲明張孝利，孫健 研究構思，文獻整理及論文修訂。余優(yōu)成，吳興文 文獻收集，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。