姜黃素對胸部爆震致小鼠肺組織氧化應激損傷的影響

施 琳，叢培芳，佟昌慈，柳云恩

由于恐怖事件、瓦斯等爆炸事件的增多，爆震傷成為現代戰爭中及非戰爭人員中越來越常見的創傷[1]。肺通常是原發性爆震損傷的主要部位[2]，爆震產生的沖擊波會導致毛細血管-肺泡界面的破壞，導致肺泡壁破壞、實質出血等并導致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征[3]。因此，尋求可以減輕胸部爆震致肺損傷的方法，對救治傷員具有重要意義。

本課題組前期實驗發現，胸部爆震可導致肺組織發生炎性反應及氧化應激損傷，并且與PI3K信號通路的激活相關。姜黃素(curcumin，CUR)是傳統藥物姜黃的一種成分，在印度傳統醫學中，它被用于治療多種疾病。研究表明CUR具有包括免疫調節、抗氧化、抗炎和抗真菌活性在內的許多藥理作用[4]。此外，還有研究發現CUR可能與一些以異常炎性反應為特征的肺部疾病有關，例如，哮喘或慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫綜合征、肺纖維化和急性肺損傷[5, 6]。然而，CUR能否減輕小鼠胸部爆震引起的肺損傷則尚不清楚。本研究旨在探討CUR對胸部爆震致小鼠肺組織氧化應激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 30只健康雄性8周齡C57BL/6小鼠購自本溪長生生物科技有限公司，體重(21±2)g。CUR購自美國sigma公司。實驗所需兔單克隆抗體MDA5、IRE-a、SOD-1、p-PI3K、PI3K、Keap1、Nrf2和GAPDH，以及山羊抗兔二抗均直接購自英國Abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗分組及模型建立 30只雄性小鼠隨機分成對照組、模型組和模型+CUR組，每組10只。采用爆震傷裝置建立小鼠胸部爆震模型。方法如下：小鼠禁食水后12 h，以碘伏消毒小鼠腹部皮膚，0.4%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉后置于爆震傷裝置上，構建爆震模型。模型+CUR組于爆震前2 周開始干預。對照組和模型組小鼠腹腔注射10 mg/kg生理鹽水，1次/d，連續2周；模型+CUR組小鼠腹腔注射2.5 mg/kg CUR，1次/d，連續2周。爆震后48 h麻醉并脊髓脫臼處死所有小鼠，收集肺組織標本。左肺進行10%甲醛固定并石蠟包埋切片，右肺-80 ℃保存。

1.2.2 HE染色 將切片脫蠟至水后放入蘇木精(HE)中，浸泡5 min。自來水沖洗，放入1%鹽酸乙醇中分化數秒。自來水流水沖洗，0.5%氨水返藍數秒。自來水沖洗1 min，鏡下控制細胞核分化程度。1%伊紅水溶液染色1.5 min。切片適度自來水洗后依次浸入95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ中，每次停留1 min。浸入無水乙醇Ⅰ及無水乙醇Ⅱ中各浸泡1 min，浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min。依次取出切片，滴加適量中性樹膠，蓋上蓋玻片，室溫晾干。

1.2.3 ROS檢測 冷凍切片于PBS中浸泡5 min，二氫乙啶(Dihydroethidium，DHE)10 μM避光孵育20 min，PBS中浸泡 5 min后封片，熒光顯微鏡鏡下觀察照相。在紫外光激發下，組織內未氧化的DHE發出藍色熒光，而已氧化的DHE發出紅色熒光。

1.2.4 Western blot檢測 采用Western blot技術，檢測肺組織氧化應激蛋白MDA5、IRE-α 和SOD-1的表達，同時檢測p-PI3K、Nrf2和Keap1信號通路蛋白表達。

2 結 果

2.1 肺組織內炎性細胞浸潤 HE染色結果顯示，對照組小鼠肺泡排列較規則、間質未見炎性細胞浸潤；模型組小鼠肺泡破裂，融合成肺大泡，肺泡間隔增厚，間質內可見明顯的炎性細胞浸潤。CUR處理組小鼠肺泡間隔內炎性細胞浸潤明顯減少(圖1)。

圖1 小鼠肺組織病理改變(HE，×200)

2.2 肺組織氧化應激損傷 ROS結果顯示，爆震后，在紫外光激發下，小鼠肺組織紅色熒光明顯，表明氧化應激反應發生，而模型+CUR組的紅色熒光明顯減少，藍色熒光增多，說明CUR可以改善小鼠肺組織的氧化應激反應(圖2)。

圖2 小鼠肺組織的氧化應激反應(×200)

2.3 肺組織氧化應激蛋白的表達 模型組與對照組相比，小鼠氧化應激蛋白MDA5和IRE-α明顯升高，而SOD-1蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；模型+CUR組與模型組相比，小鼠MDA5和IRE-α蛋白表達降低，SOD-1蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖3，表1)。

圖3 小鼠肺組織氧化應激相關蛋白表達

表1 各組小鼠肺組織氧化應激蛋白的相對表達

2.4 CUR改善模型組小鼠肺組織PI3K/Nrf2/Keap1通路蛋白表達 模型組與對照組相比，小鼠p-PI3K和Keap1蛋白表達顯著增加，而Nrf2則明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)；模型+CUR組與模型組相比，小鼠p-PI3K和Keap1蛋白表達顯著減少，Nrf2蛋白表達增加，差異有統計學意義(P<0.05，圖4，表2)。

圖4 小鼠肺組織PI3K/Nrf2/Keap1通路蛋白表達

表2 各組小鼠肺組織氧化應激蛋白的相對表達

3 討 論

肺臟是爆震傷中最常累及的器官，也是導致傷員死亡最常見的致命傷之一。而ALI更是胸部爆震后的常見損傷，ALI通常伴隨炎性反應、活性氧釋放、谷氨酸毒性和線粒體功能障礙等多種發病機制的參與。本研究發現，CUR處理顯著降低胸部爆震引起的肺組織炎癥和氧化應激反應。據報道，胸部爆震早期，肺泡壁斷裂，毛細血管床減少；肺間質可見明顯水腫。而PO2、TCO2、HCO3-及肺干濕重比也在ALI后明顯下降，12 h達到最低。血清及肺組織促炎性因子TNF-α、IL-4和IL-6表達顯著升高，而抑炎因子IL-10表達顯著降低，其后，氧化應激及凋亡反應逐步發生[7]。

CUR是一種黃色色素，存在于香料姜黃中。其生物學效應的發揮是通過調節多個分子靶點，通過多種信號通路，調節多種轉錄因子、炎性細胞因子、酶、生長因子及受體的表達來介導的，具有抗炎、抗氧化和抗癌活性[8]。本研究發現胸部爆震后，小鼠肺泡間隔內的炎性反應細胞明顯減少，同時ROS生成明顯增多，氧化應激蛋白MDA5和IRE-a升高，抗氧化應激蛋白SOD-1降低。以上結果均說明肺組織氧化應激反應明顯。在本研究中，CUR干預后的小鼠與模型組相比，肺組織內炎性反應明顯降低，ROS生成減少，氧化應激蛋白MDA5、IRE-a及抗氧化應激蛋白SOD-1的變化也得到改善。

Nrf2是一種bZIP轉錄因子，通過調節一系列抗氧化和細胞應激基因對抗氧化應激發揮著重要作用。在正常條件下，Nrf2通過快速泛素化和蛋白酶體依賴性降解維持在較低水平。然而，在氧化應激期間其可在多個器官中被與其共定位的Keap1抑制[9]。許多研究也證實，調節PI3K/Nrf2通路可以減輕大鼠急性腎損傷和急性肺損傷，減輕胃上皮細胞氧化應激損傷，減輕腦缺血再灌注引起的神經炎性反應和氧化應激[10, 11]。本研究發現，CUR可以顯著降低氧化應激蛋白表達，提高抗氧化應激蛋白表達，同時影響PI3K/Nrf2/Keap1信號通路，結果提示CUR對小鼠胸部爆震致肺損傷有保護作用，其潛在機制可能與抑制PI3K的磷酸化及激活Nrf2/Keap1信號通路相關。類似的研究發現，丹皮酚與丹參素合用通過Nrf2/HO-1和PI3K/Akt途徑抑制氧化應激，減輕心肌梗死大鼠的細胞凋亡[12]。而CUR可以通過激活Nrf2來減少脂質過氧化，并維持各種抗氧化酶的活性狀態，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶[13]。本研究結果提示，CUR可以顯著降低胸部爆震引起的p-PI3K和Keap1的表達升高，增加爆震后降低的Nrf2的表達。

綜上，CUR處理對小鼠胸部爆震致肺損傷有保護作用，其潛在機制可能與其調節PI3K/Nrf2/Keap1信號通路相關。