溫針灸對膝骨關節炎大鼠P53、Map2k3和PGE2的影響

王華敏,宓軼群,趙媛媛,張永亮

(1.上海交通大學附屬第六人民醫院,上海 200233;2.河北醫科大學第二醫院,石家莊 050000)

膝骨關節炎(Knee Osteoarthritis, KOA)是一種多發生于中老年人的慢性骨關節炎疾病,關節軟骨退變、滑膜增生與炎癥是該病的主要病理特征。該病具有高發病率、高增長率和高致殘率。有文獻研究表明前列腺素E2與KOA發病關系密切[1-2]。近年來相關研究表明KOA的發病與多條信號通路中的相關mRNA調控有關[3-4],本實驗通過檢測 KOA大鼠外周血清中前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)含量及滑膜組織中腫瘤抑制蛋白P53(Tumor proteinp53, P53)和促分裂原活化蛋白激酶 3 (Mitogen-activated proteinkinase kinase 3, Map2k3)mRNA的表達情況,探討溫針灸治療KOA的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

28只健康的清潔級雄性 3月齡 SD大鼠,體質量(270±30)g,購于上海西普爾-必凱實驗動物公司[生產許可證號為SCXK(滬)2013-0016]。飼養環境自然光每日光照12 h,溫度18℃～22℃,相對濕度50%～70%,每籠7只,自由飲水、攝食,常規飼養1周后按隨機數字表法分為正常組、模型組、藥物組和溫針灸組,每組7只。實驗過程嚴格遵守實驗動物管理條例。

1.2 主要試劑和儀器

小艾炷(上海泰成科技發展有限公司),針灸針(固始公元醫療器械有限公司),美洛昔康片(7.5 mg/片,國藥準字 H20020217,上海勃林格殷格翰藥業有限公司),papain(P-3250,Sigma公司),EDTA、NaOH、NaCl、Na2HPO4、HCl(上海化學試劑公司),離心機(Sigma公司),MK3型酶標儀(Thermo公司),PGE2ELISA檢測試劑盒(KGE004B,RD公司),RNA酶抑制劑(RG90925,Epicentre公司),SuperScriptTMⅢ逆轉錄酶、5×RT緩沖液(Invitrogen公司),Primer(英駿生物技術有限公司)。其他涉及的試劑設備和儀器均由上海交通大學附屬第六人民醫院實驗中心提供。

1.3 溶液配制

木瓜蛋白酶(papain)溶液的制備[5]方法為 32 mL雙蒸水中加入0.05 g NaH2PO4、0.72 g Na2HPO4、0.04 g NaOH和1.6 g NaCL,混合輕攪溶解后加入NaOH,pH濃度調至8.0,加0.64 g papain和15 mg EDTA-2Na,輕攪溶解后液體呈淡黃色,最后加入 HCL將 pH值調至6.5,雙蒸水定溶至40 mL后低溫保存。美洛昔康溶液的制備,選用臨床抗炎鎮痛療效顯著的美洛昔康片,將其碾磨粉碎后溶解于生理鹽水,反復搖勻后制成0.5 mg/mL溶液。

1.4 模型制備

除正常組外,其余3組采用關節腔注射papain結合被動運動的方法造模[6-7],準備好配制好的papain溶液、手套和75%醫用乙醇棉球等,將大鼠固定在解剖板,充分暴露并屈曲雙側后肢45°,常規消毒3遍關節腔周圍的皮膚,注射器快速破皮后斜刺入關節腔,當針下有落空感時外提回抽無血即可注射papain溶液。根據臨床過度運動易損傷關節造成炎癥反應的特點,無固定狀態下用自制滾筒每天強迫大鼠超負荷運動15 min;3組大鼠分別于第1天、第4天、第7天關節腔注射 papain,單膝單次注射 0.1 mL,2周后通過Lequesne MG膝關節級別評估,觀察局部反應、步態反應、關節活動和關節腫脹4個方面,與正常組相比,造模的 3組大鼠差異有統計學意義(Kruskal-Wallis分析局部反應,P=0.00039;步態,P=0.00037;關節活動,P=0.00025;關節腫脹,P=0.00048),提示動物模型制備成功。詳見表1。

表1 造模后各組大鼠膝關節評估 (例)

1.5 干預方法

正常組與模型組采用與溫針灸組相同的抓取和固定,余不做特殊處理。溫針灸組誘導大鼠進入固定器后仰臥固定于解剖板,將大鼠后肢雙側膝關節彎曲 45°便于關節腔的暴露和穴位的定位,揣摩并定位大鼠“膝前穴”(后肢膝蓋前方),穴位定位參考《實驗針灸學》及相關文獻[8-9],用 75%乙醇棉球消毒 3遍后持 0.25×25 mm針灸針迅速刺入,刺入深度為5～7 mm,隨后將長度為7 mm,直徑為5 mm,重量為0.5 g的小艾炷插入并固定于針柄處,點燃后其燃燒完成后換另外一炷,待其充分燃燒完成后即可拔掉針灸針(約為 10 min),每日1次,每次2壯,連續治療10 d。藥物組抓緊大鼠背部皮膚,垂直固定身體,充分后仰頭部便于打開嘴巴,將灌胃針沿咽后壁方向從嘴角慢慢插入,當進針深度約為4～5 mm時回抽觀察是否有氣泡,如若無氣泡則可慢慢推注,推完后迅速出針,藥物組大鼠灌胃后采用與溫針灸組相同的抓取和固定。根據人和大鼠體質量換算比例 SD大鼠服用美洛昔康溶液的劑量為3.75 mg/kg,每日1次,連續灌胃10 d。

1.6 觀察指標與檢測方法

治療結束后采用腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠,腹主動脈采血 5～10 mL,滴入離心管,隨后以3000 rpm/min,離心3 min,分離出血清,-80℃保存,留待ELISA檢測。摘取大鼠的雙側膝關節,切開皮膚逐層打開并充分暴露關節腔,手術刀沿髕骨下緣向上鈍性分離和剝取滑膜組織,將分離好的滑膜組織放入離心管中置于-80℃冰箱保存,留待HE染色和實時定量PCR檢測。

1.6.1 組織形態學觀察

采用HE染色觀察4組大鼠滑膜組織形態學改變。將滑膜組織浸泡于10%的福爾馬林溶液中,24 h后取出行脫水處理,脫水完成后浸泡于二甲苯中,待組織透明后進行石蠟包埋處理,切片處理后貼到載玻片上,放入45℃恒溫箱中烘干;染色之前需要將切片中的蠟塊祛除,具體步驟為將切片放置于二甲苯中 30 min,置于100%乙醇中10 min,置于80%乙醇中5 min,置于蒸餾水中5 min后即可染色。蘇木精染色、沖洗、脫水、伊紅染色、沖洗、封片,最后在電子顯微鏡下觀察各組切片染色結果。

1.6.2 血清PGE2蛋白含量檢測

依據ELISA試劑盒操作步驟檢測血清PGE2蛋白含量。取出血清和 ELISA試劑盒,室溫下平衡,設立 10個標準孔,2個非特異結合孔,其他為樣品孔,先后加入150 μL相應的試劑和樣品,50 μL一抗(除了非特異結合孔),封板,置于水平搖床(500±50)rpm孵育1 h;不洗板,每孔加入 50 μL PGE2結合液,封板,室溫搖床孵育2 h;置于自動洗板機上,Wash Buffer洗板4次。每孔加200 μL底物溶液,避光靜置孵育30 min。每孔加入100 μL終止液后,30 min內用酶標儀檢測光密度和濃度。

1.6.3 P53和Map2k3 mRNA表達檢測

采用實時定量 PCR法檢測,取滑膜組織樣品加入Trizol試劑混合勻漿,通過氯仿,異丙醇進行RNA的提取,紫外吸收法測定 RNA的濃度和純度;將提取好的RNA樣品進行cDNA的合成,完成后-20℃冰箱保存;將所有的cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應體系進行PCR反應,P53 mRNA、Map2k3 mRNA和管家mRNA GAPDH的濃度結果由機器生成,采用 GAPDH作為內參來校正差異,結果選用待測 mRNA相對含量(每個樣品的濃度除以其管家的濃度,即為此樣品mRNA校正后的相對含量)。實時定量PCR使用引物列表詳見表2。

表2 引物列表

1.7 統計學方法

采用SPSS21.0軟件統計分析各組實驗數據。符合正態分布的計量資料用均數±標準差表示,采用單因素方差分析;不符合正態分布的計量資料用中位數,(四分位數)表示,兩獨立樣本組間比較用非參數檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 滑膜組織形態學觀察

正常組可見大量的脂肪細胞和滑膜細胞,模型組可見明顯的炎性細胞浸潤,藥物組可見少量炎性細胞、部分脂肪細胞和增生的血管,溫針灸組可見少量炎性細胞散在分布。詳見圖1。

圖1 各組大鼠關節滑膜組織病理學比較(×200)

2.2 各組大鼠血清PGE2含量比較

與正常組比較,其他3組PGE2含量均明顯升高,差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較,溫針灸組、藥物組 PGE2含量均明顯降低,差異有統計學意義(P＜0.05);而溫針灸組與藥物組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血清PGE2蛋白含量比較 [M,(P25,P75)]

2.3 各組大鼠滑膜組織Map2k3 mRNA表達

Map2k3 mRNA表達數據資料不符合正態分布,4組組間比較差異無統計學意義(P＞0.05),各組大鼠滑膜組織Map2k3 mRNA表達無顯著差別。詳見表4。

表4 各組大鼠滑膜組織Map2k3 mRNA表達比較[M,(P25,P75)]

2.4 各組大鼠滑膜組織P53 mRNA表達

與正常組比較,模型組、溫針灸組和藥物組的大鼠滑膜組織中P53 mRNA均明顯升高,差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較,溫針灸組大鼠滑膜組織中P53 mRNA均明顯降低,差異有統計學意義(P＜0.05);而溫針灸組與藥物組,藥物組與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠滑膜組織P53 mRNA表達比較 (±s)

表5 各組大鼠滑膜組織P53 mRNA表達比較 (±s)

注:與正常組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n P53/GAPDH正常組 7 0.03±0.02模型組 7 0.11±0.041)藥物組 7 0.08±0.011)溫針灸組 7 0.07±0.021)2)

3 討論

KOA又稱為退行性關節炎,是一種多發于中老年人,常累及滑膜、關節軟骨和軟骨下骨,臨床以疼痛和功能活動障礙為主的慢性骨關節疾病。常見的臨床表現包括活動時關節的彈響和摩擦音,關節的疼痛腫脹和畸形,關節活動不利和功能障礙。據報道我國 KOA的整體患病率為 8.1%,最高為西南地區的 13.7%, 60歲以上達50%,75歲以上高達80%,患病率隨年齡的增長而升高[10-11],KOA的高發病率和高致殘率,不僅影響個人生活質量,也造成了一定的社會經濟負擔。

最近的研究表明 KOA和滑膜炎癥關系密切,滑膜對于維持正常的關節活動功能是必需的,它是一種關節內的間充質組織,可以發生于KOA的早、中和晚期各個階段,發病時的滑膜組織多見滑膜層的增厚,炎性細胞的浸潤,彌漫性纖維增生和血管增生等[12-13]。從本次實驗研究來看,正常的滑膜平滑光整、色澤淡紅,模型組滑膜水腫炎性滲出,色澤呈黃白色,可見明顯增生肥厚,鏡下可見大量炎性細胞浸潤。溫針組大鼠經過治療后滑膜水腫減輕,色澤較模型組有明顯改善,鏡下炎性細胞數量明顯減少,可見溫針灸可以減輕 KOA的滑膜炎癥。

多種細胞炎性因子參與骨關節炎的發病進程,包括白細胞介素-1、腫瘤壞死因子、一氧化氮、基質金屬蛋白酶及 PGE2等,其中 PGE2是花生四烯酸環氧合酶的代謝產物,在骨關節炎關節中通過 COX-2作用生成進而產生促炎致痛作用,參與諸多調節軟骨基質降解和關節軟骨破壞的過程[14-15]。溫針灸可以通過降低KOA大鼠關節液和血清中 PGE2含量[16],這與本研究實驗結果一致,模型組中大鼠血清PGE2含量明顯高于正常組,進一步證實了 PGE2升高與 KOA的發病有著密切關系。而與模型組比較溫針灸治療可以明顯降低大鼠血清PGE2含量,溫針灸組與藥物組比較無顯著差異,說明針灸可以通過降低PGE2表達水平進而起到抗炎的作用。

近年來的研究表明 P53是一種抑癌蛋白,同時也是一種轉錄因子,在細胞處于應激狀態時可被誘導表達,它能夠誘導細胞的凋亡,調控炎癥反應,同時還具有調控代謝的作用。Zhu X等[17]研究表明在KOA患者中P53蛋白的表達較常人有明顯的升高,P53的上調可能會促進KOA發病過程中軟骨細胞的凋亡。Bateman JF等[18]研究確認了在鼠類骨關節炎發病中起關鍵作用的基因包括 Ptgs2、Crlf1、Inhba、Phdla2、Il11、Col10a1、P53、Foxo4和Xbp1等。Narici M等[19]研究表明全膝關節置換術后患者出現的肌肉減少癥與P53蛋白的表達密切相關,該基因的有效性可以作為肌肉萎縮的生物標記物。P53 mRNA可能與KOA的發病存在某種聯系,其可能是通過調控某種炎癥介質作用于某條信號通路來起到抑炎止痛作用,因此本次實驗研究選取其作為研究指標,觀察溫針灸是否能對其表達起到調控作用,結果顯示P53 mRNA在模型組、藥物組和溫針灸組中高表達提示其可能是 KOA大鼠的其中一個致病基因,與模型組相比,溫針灸能夠明顯降低 KOA大鼠滑膜組織P53 mRNA的表達水平。Map2k3屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的特異性蛋白激酶,有研究表明Map2k3 mRNA可能通過作用于p38MAPK信號通路來起到調控骨關節炎的作用,本實驗研究結果顯示各組間比較 Map2k3差異無統計學意義,可能說明Map2k3 mRNA對骨關節炎調控作用微乎其微。

溫針灸治療大鼠 KOA療效明確,可以減輕滑膜炎性細胞浸潤,減輕滑膜增生水腫,降低 PGE2的含量,抑制P53 mRNA表達來抑制炎性反應,這可能是溫針灸防治骨關節炎的作用機制之一。