固定化好氧脫氮菌及其在低CN鴨場廢水處理中的應用

李宇馨， 陳鵬程， 廖勁松， 戴睿智， 潘圳鐘， 楊 德， 許燕濱*

1.廣東工業大學環境科學與工程學院, 廣東 廣州 510006 2.廣東益康生環保科技有限公司, 廣東 云浮 527300

隨著經濟的發展和人們生活水平的提高，畜禽產品需求量不斷增加，生產規模不斷擴大，我國畜禽養殖模式已從散戶養殖向集約化養殖轉變，而隨之而來的養殖廢水污染問題也日益嚴峻[1]. 目前國內外針對養殖廢水多采用還田和工業化處理兩大方法，而對我國南方等耕地和林地少的地區則多采用生物處理技術，其中，厭氧-缺氧好氧-缺氧好氧(厭氧-兩級AO)工藝是比較常見的畜禽養殖廢水處理工藝[2]. 畜禽廢水經過長時間厭氧發酵和一級AO處理后，開始出現低CN的難生物降解特性，進而導致后續異養反硝化菌脫氮效率低，出水NO3--N大量積累等問題，最終影響出水達標[3].

為解決NO3--N濃度超標的問題，國內外學者研制了多種脫氮新工藝，如厭氧氨氧化、短程硝化反硝化、好氧反硝化等[4]. 其中，好氧反硝化菌可以同時利用O2和ONO3-作為最終電子受體，將硝酸鹽逐步還原為氣態氮化物，而成為當今的研究熱點[5]. 相比于生長緩慢的自養反硝化菌，好氧反硝化菌具有生長迅速，適應范圍廣，對氧的耐受性強等優點，且容易保存和應用[6]. 因此，通過在一級好氧池中富集好氧反硝化菌，可實現總氮和CODCr的同步去除，從而克服傳統工藝的不足，減少后續的建設和運行成本[7].

為實現在反應器中快速富集某特定功能微生物，向系統中投加菌劑是常見的方法，但傳統菌劑存在接種菌量少、易流失、難定植等問題. 20世紀70年代，研究人員提出固定化技術，即通過物理或化學的方法將大量游離的細菌固定在載體上，是一種既能保持細菌生長代謝活性，又能反復利用的方法[8]. 研究[9-10]表明，固定化脫氮菌菌劑已在多種含氮廢水處理中取得顯著效果，該技術應用潛力巨大. 目前，適用于高氨氮廢水和低溫條件的脫氮菌劑研究報道較多[11-12]，而適用于低CN的硝酸鹽累積型廢水的菌劑卻鮮見報道. 因此，篩選和制備適用于低CN廢水的高效脫除NO3--N的菌劑，對于解決此類工程實際問題十分重要.

該研究利用前期分離得到的一株高效好氧脫氮菌PseudomonasmendocinaLYX，摸索得到菌株的最佳脫氮(NO3--N)條件后，將其固定化制備成菌劑，并投放于反應器中，考察其在低CN的實際鴨場廢水深度處理中的貢獻，為解決NO3--N累積的低CN廢水處理難等問題提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

養鴨廢水及接種污泥來源：試驗用實際養鴨廢水和接種活性污泥均來自廣東省某集約化鴨場污水處理系統，該場養殖2×104只羽蛋鴨和種鴨，每天產生100～200 m3廢水，廢水經兩級AO處理后排放. 該研究用水取自一級好氧池，廢水中ρ(CODCr)、ρ(BOD5)、ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)分別為290～310、105～130、15～20、1～3、140～150、150～180 mgL，CN為2.2左右，ρ(BOD5)ρ(CODCr)為0.4左右，pH為6.8～7.3.

1.2 試驗方法

1.2.1P.mendocinaLYX脫氮特性的研究

在單因素pH條件試驗中，將培養至對數期的菌液按2%的接種量分別接種至100 mL pH為6、7、8、9的脫氮特性試驗培養基中，并在35 ℃、150 rmin下培養16 h，每間隔2 h取樣檢測ρ(NO3--N)，考察P.mendocinaLYX在不同pH下的脫氮性能.

在單因素溫度條件試驗中，將培養至對數期的菌液按2%的接種量接種至100 mL脫氮特性試驗培養基中，并分別在25、30、35和40 ℃下振蕩(150 rmin)培養16 h，每間隔2 h取樣檢測ρ(NO3--N)，考察P.mendocinaLYX在不同溫度下的脫氮性能.

在單因素ρ(DO)條件試驗中，將培養至對數期的菌液按2%的接種量接種至100 mL脫氮特性試驗培養基中，并分別在50、100、150和200 rmin〔其中初始ρ(DO)分別為2.12、3.45、4.67和6.72 mgL〕下35 ℃培養16 h，每間隔2 h取樣檢測ρ(NO3--N),考察P.mendocinaLYX在不同ρ(DO)下的脫氮性能.

1.2.2固定化菌劑的制備與掃描電鏡觀察

將絲瓜絡制成長寬高分別為2 cm×1 cm×1 cm的立方體，放置于濃度為5%的氫氧化鈉溶液中煮沸0.5 h，待其冷卻至室溫后，使用去離子水沖洗載體表面殘留的NaOH，隨后于50 ℃下烘干至恒質量. 將烘干的絲瓜絡放置于1 L經過滅菌的脫氮特性培養基中，并接種1%培養至對數期的菌液，每24 h以新鮮脫氮特性培養基置換80%的培養液，掛膜培養14 d，載體取出后放置室溫自然風干至恒質量. 分別取掛膜前與掛膜培養14 d后的絲瓜絡進行戊二醛固定以及冷凍干燥等預處理[13]，將經過預處理的絲瓜絡噴金后，通過場發射掃描電鏡(Hitach SU8220, 日本)對比掛膜前后絲瓜絡表面變化.

1.2.3菌劑在實際鴨場廢水處理中的短期應用

該試驗共分5組：A組(250 mL廢水)、B組(250 mL廢水+20 g菌劑)、C組(250 mL廢水+20 g污泥)、D組(250 mL廢水+20 g絲瓜絡)、E組(250 mL廢水+14 g污泥+6 g菌劑)，每組設置3個平行組，且各組試驗均于500 mL錐形瓶中進行. 所有錐形瓶置于搖床中35 ℃，100 rmin下培養24 h，并分別在0、3、6、9、12、24 h取水樣檢測ρ(CODCr)和ρ(NO3--N)，分析菌劑在養鴨廢水處理中的效果.

1.2.4生物反應器的啟動與菌劑的投加

該試驗模擬鴨場廢水處理現場工藝建立實驗室系統，研究菌劑在一級好氧池中的強化脫氮效果. 一級好氧池裝置如圖1所示，實際容積為5 L. 接種污泥和試驗廢水取自鴨場污水處理系統中一級好氧池，污泥接種量為0.8 L，鴨場廢水量為2.2 L，污泥與廢水混合后懸浮固體濃度(MLSS)和污泥體積指數(SVI)分別為 4 300 mgL和78 mLg. 反應器溫度控制在35 ℃、ρ(DO)控制在(3.45±0.6) mgL、初始CN 為2.2左右，初始pH為8、反應器內HRT(水力停留時間)約為23 h、排水比為70%；系統運行過程中進水15 min，曝氣反應23 h，沉淀30 min，出水15 min，每24 h取樣檢測進水與出水水質. 反應器運行第1階段為未加菌劑階段，待反應器出水水質連續穩定超過3 d(即第6天)，開始投加菌劑進入第2階段.

圖1 模擬好氧池裝置Fig.1 Simulated device of aerobic tank

1.2.5反應器中菌群結構和多樣性分析

根據水質檢測結果分別收集反應器運行至第2、7、17、28天的菌劑和污泥，使用土壤DNA提取試劑盒(OMEGA Soil DNA Kit D5625-02)提取樣品中微生物總DNA，用微量核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop OneOneC, Quawell, USA)檢測DNA樣品的濃度和純度. 將檢測合格的樣品DNA用細菌特異性引物進行PCR擴增，使用Illumina MiSeq平臺(北京諾禾致源科技股份有限公司)雙端測序分析PCR擴增產物，將每個樣品中的所有序列劃分到不同的物種分類等級(門、綱、目、科、屬、種)，統計每個樣品的群落結構組成和相對豐度,并用Chao1指數、Simpson指數和Shannon-Wiener指數等對樣品的多樣性進行分析[14].

1.2.6水質分析方法

2 結果與討論

2.1 P. mendocina LYX的最佳脫氮條件研究

2.1.1不同ρ(DO)對菌株脫氮效果的影響

圖2 ρ(DO)對NO3--N去除率的影響Fig.2 Effect of dissolved oxygen on nitrate removal efficiency

2.1.2不同溫度對菌株脫氮效果的影響

如圖3所示，不同溫度對NO3--N去除率的影響較為明顯. 當溫度在35 ℃時，NO3--N的去除率達到最高值(83%)，溫度高于或低于35 ℃時，NO3--N的去除率均有不同程度的下降，這可能是因為反硝化酶偏離最適溫度，酶活性受到抑制導致的[22]. 此外，JI等[23]試驗發現低溫培養環境下，假單胞菌(Pseudomonasmandelii)對亞硝酸鹽還原酶基因(nirS)和一氧化二氮還原酶基因(nosZ)的表達均表現出更長的滯后性. 該試驗結果表明，溫度對P.mendocinaLYX的脫氮速率有較大影響，35 ℃是P.mendocinaLYX的最適脫氮溫度.

圖3 溫度對NO3--N去除率的影響Fig.3 Effect of temperature on nitrate removal efficiency

圖4 pH對NO3--N去除率的影響Fig.4 Effect of pH on nitrate removal efficiency

2.1.3不同pH對菌株脫氮效果的影響

如圖4所示，NO3--N的去除率隨著初始pH的升高而增加，當pH升至8時，NO3--N的去除率達到最大值(80%)，隨著pH進一步升高，NO3--N的去除率迅速下降. 可見，P.mendocinaLYX在pH為7～8的弱堿性環境中能夠更高效地脫氮，這與Joo等[24-25]的結果一致. SU等[26]認為pH是影響反硝化的酶活性的重要因素之一，偏離最適pH不僅會抑制反硝化酶活性，還可能改變細胞膜通透性和膜結構的穩定性，間接影響菌株的脫氮效率. 該試驗結果表明，P.mendocinaLYX的最適pH為8.

2.1.4不同CN對菌株脫氮效果的影響

圖5 CN對NO3--N去除率的影響Fig.5 Effect of CN ratio on nitrate removal efficiency

2.2 菌劑掛膜效果觀察

該試驗通過將絲瓜絡投入到菌液中進行掛膜培養，完成P.mendocinaLYX在載體上的富集與固定. 圖6(a)(b)分別為掛膜前的絲瓜絡和菌劑絲瓜絡及其掃描電鏡圖，可見經過預處理的絲瓜絡具有表面光滑、空隙清晰、比表面積大等特點，這有利于氧氣和營養物質的傳輸. 經過14 d的掛膜培養，絲瓜絡表面及斷面因優勢菌負載而變得溝壑交錯，表面積進一步增大，微生物固定于絲瓜絡表面及內部并形成一層致密的生物膜. 有研究表明，絲瓜絡有著復雜的網狀結構和良好的親水性，有利于捕捉和聚集微生物，大量的微生物附著于絲瓜絡的表面逐漸形成生物膜[28]，而載體外層微生物細胞在自身增殖的同時，還會分泌的胞外聚合物(EPS)等物質，進一步增強水中細菌在載體表面的附著能力[29]，此外，EPS還能幫助AOB細菌更穩定地催化亞硝化反應，加速水質的凈化[23].

2.3 菌劑處理實際廢水效果

圖6 絲瓜絡掛膜前后的SEM對比Fig.6 SEM images comparison of loofah before and after biofilm forming

2.3.1菌劑強化的短期效果

為了探究菌劑的短期處理效果，并排除包括絲瓜絡在內的外界因子對試驗的干擾，試驗按影響因素分組，重點觀察了24 h內鴨場廢水在A(250 mL廢水)、B(250 mL廢水+20 g菌劑)、C(250 mL廢水+20 g 污泥)、D(250 mL廢水+20 g絲瓜絡)和E(250 mL廢水+14 g污泥+6 g菌劑)這5組的處理效果(見圖7). 比較A、D兩組結果發現，單獨投加未負載優勢菌的絲瓜絡并不能降低鴨場廢水中ρ(NO3--N)和ρ(CODCr)，即絲瓜絡作為生物載體對水質無影響，這為后續準確評估優勢菌的脫氮貢獻奠定了基礎. 通過B、C和E這3組試驗結果對比發現，E組在運行6 h 后ρ(NO2--N)率先出現峰值，說明菌劑的投加促進了NO3--N還原，導致NO2--N累積. 大多數好氧反硝化菌均含有周質硝酸鹽還原酶，其活性對氧分子抑制不敏感[30]，在好氧條件下優先表達，能將NO3--N迅速還原成NO2--N，從而加速整個反硝化進程. 系統運行9 h后，E組的NO3--N和CODCr去除率分別為90%和51%，其中NO3--N去除率分別較B組和C組高20%和55%，CODCr去除率較B組和C組分別高15%和35%. 因此，將固定化P.mendocinaLYX菌劑添加到鴨場廢水處理系統的好氧池，可有效地提高系統的NO3--N和CODCr去除率.

圖7 菌劑強化對鴨場廢水處理效果的影響Fig.7 Influence of the microbial agent on the treatment of wastewater from the duck farm

注： 階段1、階段2分別為菌劑投加前后的系統運行階段.圖8 菌劑強化污泥系統的連續運行效果Fig.8 The efficiency of the continuous running sludge system inoculated by strain agent

2.3.2菌劑在反應器中的長期強化效果

為探究固定化菌劑強化系統的長期效果，該試驗通過觀察反應器30 d的運行情況，對比了投加菌劑前后系統的處理效果. 試驗結果如圖8所示，反應器經調試穩定運行后(即階段1)ρ(NO3--N)從150 mgL降至80 mgL，NO3--N去除率穩定在46%左右，同時，ρ(CODCr)也僅從初始的310 mgL降至125 mgL，去除速率緩慢. 當菌劑投加到反應器后(階段2前期)，ρ(NO3--N)和ρ(CODCr)迅速下降，ρ(NO3--N)從進水的150 mgL降至20 mgL左右，NO3--N去除率從46%升至86%，增加了40%. 同時ρ(CODCr)從310 mgL降至65 mgL左右，CODCr去除率從59%升至79%，增加了20%. 顯然，模擬條件激活了污泥中的菌劑，提高了反應器的處理效率. 與P.mendocinaLYX純培養得到的最佳CN為5的結果不同，實際養鴨廢水CN只有2.2，是典型的低CN廢水，但菌劑強化后，對系統NO3--N和CODCr的去除率促進作用仍十分顯著，這可能與原生系統中脫氮微生物的協同作用相關. 陳川[31]也發現反應器中自養微生物和異養微生物間存在著某種協同作用，使得工藝的反硝化率接近99%. 但隨著反應器的持續運行，反應器的處理效率從某個時間段開始減弱，反應器運行至第28天時，NO3--N的去除率從86%降至66%；同時，CODCr的去除率也從79%降至67%，菌劑強化效果最弱. 下降原因可能是反應器長期在上述條件下運行，造成了菌群結構變化或菌劑的流失，導致廢水的處理速率下降，可見菌劑強化措施具有周期性，且周期不宜超過22 d.

2.3.3功能微生物種群結構及多樣性指數分析

為更深一步探究菌劑強化脫氮效果的機理，試驗從微生物多樣性和微生物種群結構方面來評價菌劑對系統的強化效果，根據水質變化情況選取了4個代表階段性變化的時間點(即第2、7、17、28天)，并對這些點的污泥樣品(N)及菌劑樣品(J)進行DNA提取和高通量測序分析.

各階段樣品經過高通量測序后，對原始測序數據進行生物多樣性指數分析，具體統計結果如表1所示，微生物度量指數(如Shannon-Wiener指數、Chao1指數、Simpson指數、ACE指數)用來衡量樣品中微生物群落的多樣性. 其中，Shannon-Wiener指數和Simpson指數表征樣品中微生物多樣性，二者數值越大代表群落多樣性越高，Chao1指數和ACE指數側重體現群落的豐富度，Chao1指數或ACE指數越大，表明樣品中物種總數越多[32]. 分析各階段樣品的測序數據后發現，系統運行至第7天時，污泥中各指數明顯高于第2天，表明外源菌劑的投加豐富了系統的微生物群落，微生物多樣性增加. 隨著菌劑的活化與穩定，反應器運行至第17天時，污泥和菌劑的各指數顯著增加，這可能因為菌劑載體絲瓜絡具有多孔特性，利于污泥微生物的生長附著，而菌劑表面的微生物膜含有大量具有良好生物絮凝作用的胞外聚合物等[33]，促進了系統中懸浮微生物在菌劑上的附著生長，從而進一步增加了菌劑上微生物的多樣性. 當系統運行至第28天時，各指數均略有下降，微生物多樣性相對減少，這可能是水質和控制條件對微生物的長期選擇結果. 因此，菌劑強化后污泥和載體上的微生物多樣性經過了先增后減的變化過程，為保證系統的運行效果，以22 d為周期接種菌劑進行強化是十分必要的.

注： 圖中(N)(J)分別表示污泥和菌劑樣品. 圖9 反應器運行過程中污泥和絲瓜絡的微生物群落結構變化Fig.9 Variation of microbial community in the activated sludge and biofilm on loofah with the reactor running

表1 各階段污泥和菌劑樣品的微生物多樣性指數分析結果

為了進一步探究菌劑的定值情況，試驗對各階段樣品微生物相對豐度進行了分析，試驗結果如圖9所示. 在未加菌劑的穩定初期(階段1)，擬桿菌(Bacteroidetes)和副球菌(Paracoccus)是污泥中主要的優勢菌群，其中擬桿菌(Bacteroidetes)是化能異養菌，具有降解蛋白質、碳水化合物等許多復雜的有機大分子化合物的能力，廣泛分布于活性污泥處理裝置中[34-35]，副球菌(Paracoccus)是兼性厭氧自養菌，在好氧條件下，利用O2或NO3-能作為電子受體，將NO3-還原成N2O和N2[36-37]，是污泥中重要的反硝化菌. 當向反應器中投加菌劑后，主要功能菌由第1階段的擬桿菌(Bacteroidetes)和副球菌(Paracoccus)逐步演替為不動桿菌(Acinetobacter)、假單胞菌(Pseudomonas)和副球菌(Paracoccus). 其中，不動桿菌(Acinetobacter)為專性好氧菌，代謝形式為化能異養[38]，與假單胞菌共同承擔去除有機物，降低CODCr的作用;同時，具有反硝化功能的假單胞菌和副球菌成為了反應器中主要的脫氮菌.

系統繼續運行至第17天時，污泥和菌劑中的假單胞菌(Pseudomonas)和副球菌(Paracoccus)的相對豐度相對于第7天顯著增加，Shannon-Wiener指數和Simpson指數也明顯提高. 顯然，菌劑投加后，載體上P.mendocinaLYX菌自身生長繁殖或者激活污泥中假單胞菌(Pseudomonas)，增加了系統中好氧反硝化菌Pseudomonassp. 的相對豐度，提高了系統的處理效率. 此外，菌落結構中具有反硝化功能的假單胞菌(Pseudomonas)和副球菌(Paracoccus)的相對豐度分別為8.5%和4.0%，這標志著此時系統具有良好的生物脫氮性能. 有研究表明，同一反應體系中不同微生物之間可以借助菌株間的協同作用提高脫氮效率[39]，這可能是在加入菌劑后，反應器內NO3--N的去除速率明顯增加的原因. 然而，當反應器運行至第28天時，假單胞菌的相對豐度從第17天的8.5%減至0.59%，同時，副球菌也從4%降至1.0%. 結果表明菌劑雖能在短時間內通過提高假單胞菌(Pseudomonas)含量并協同反應器中其他脫氮菌來提升反應器的脫氮速率，但鴨場廢水水質或某些廢水成分降解產物對菌劑存在某種不利影響，長期運行下，菌劑功能下降或流失，從而導致NO3--N和CODCr去除率下降. 此外，由圖9也可以發現，蛭弧菌(Bdellovibrio)的相對豐度與假單胞菌量的變化有著一定的正相關性. 蛭弧菌作為一種化能異養好氧菌，多為寄生菌株，且寄主廣泛，對大多數革蘭氏陰性菌，如志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、弧菌屬和假單胞菌屬等微生物均有較強的裂解活性[40]. 因此，不排除蛭弧菌以假單胞菌為寄主，并導致假單胞菌裂解，相對豐度下降，最終菌劑強化作用減弱. 綜上，污泥和載體上優勢菌的演替過程從生物學角度解釋了系統投加菌劑后NO3--N和CODCr去除能力先增后降的變化情況. 因此，為實現系統連續高效的深度脫氮處理，除了制定定期菌劑強化方案以外，如何減少或者如何抑制蛭弧菌，也是未來研究的重要課題.

3 結論

a) 絲瓜絡是良好的菌劑載體，經過14 d的純培養掛膜，絲瓜絡表面可形成一層均勻的生物膜，菌株P.mendocinaLYX附著于絲瓜絡表面及內部，為固定化載體在廢水中的應用提供了條件.

b) 投加菌劑能加速系統中ρ(NO2--N)峰值的出現，進而推進體系的脫氮進程，其中生物載體絲瓜絡本身對廢水中NO3--N沒有物理吸附作用.

d) 固定化菌劑在投入反應器后假單胞菌(Pseudomonas)含量顯著增加并成為優勢菌種，反應器運行至第17天時，其相對豐度從0.03%升至8.5%，系統內微生物多樣性增加，微生物結構得以改善.