核酸固相分離方法及其在病原PCR診斷中的應用綜述

李蒙航，趙振軍，李佩佩*

(1.遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧 大連 116023； 2.大連理工大學，遼寧 大連 116024)

基因是遺傳的主要功能單位，它們所包含的核酸堿基的特定序列能夠編碼生物體功能所需的大部分蛋白質。作為基因的載體，2種類型的核酸：核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)或脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)受到廣泛關注，尤其是基于核酸的體外分子檢測技術，成為強大的生物學研究工具[1-2]?；诤怂岬腜CR(Polymerase Chain Reaction)診斷比傳統方法(基于酶或者抗體的分析)具有更多的優勢：更高的修改靈活性、更高的檢測靈敏度以及更快、更早的獲得檢測結果[3]，在人類疾病控制(如艾滋病[4]、瘧疾[5]和丙型肝炎[6]等)、農作物病害控制[7]、畜牧業疫病防控[8]和食品安全領域[9]均發揮著極其重要的作用。PCR診斷包括多個關鍵環節：核酸的提取，聚合酶鏈反應(PCR)及結果讀出[10]。從生物體中提取核酸，需要將核酸從含有蛋白質、多糖和脂肪等多種生物大分子的復雜體系中進行分離、純化，是PCR、測序等生物學分析的先決條件[11]。核酸提取的質量，會顯著影響后續分析的準確性和靈敏度。生物樣本中殘留的抑制性成分(血紅素、球蛋白等成分)及分離、純化過程中殘留的有機物和鹽分，是影響PCR靈敏性和分析穩定性的重要因素[12-14]。

傳統的核酸的分離方法是基于有機溶劑萃取的液相分離，如Chomczynski’s法[15]、酚氯抽提方法[16-17]、溴化乙錠-氯化鈣梯度離心法等[18]。液相分離方法雖然有效，但存在著很大的局限性：所需樣品量大、分離時間長、易受污染、降解率高[19]。另外，液相分離方法中有機溶劑的殘留顯著增加了PCR抑制劑的殘留風險。為了提高提取核酸樣品的純度與濃度，核酸的提取方法也在不斷更新，目前固相萃取核酸的方法受到更多學者的青睞。固相萃取核酸的方法主要是采用一些對核酸有結合作用的固相材料，在一定條件下結合核酸然后又在適當條件下脫附，實現核酸的分離。與液相萃取方法相比，固相萃取方法減少了有機溶劑的使用，操作相對簡便，分離時間短，樣品在實驗過程中不易污染與降解，提取的核酸無論是濃度還是純度都相對較高[20-23]。本論文通過綜述具有核酸結合能力的固相材料及其在核酸固相分離過程中的研究進展，探討核酸固相分離在病原PCR診斷應用中的優勢和局限，預測其發展趨勢。

1 具有核酸結合能力的固相材料及其作用機制

固相核酸分離主要是通過對核酸有吸附作用的固體顆粒在一定條件下結合核酸而實現的分離。目前，報道的具有核酸結合功能的固相材料主要包括：二氧化硅及其衍生物[24-30]、金屬及其衍生物[31-35]、云母[36]、合成樹脂[37-38]、纖維素[39]和氧化石墨烯[40-41]等，通過靜電作用、共價鍵結合等機制結合、分離核酸。

1.1 二氧化硅及其衍生物

二氧化硅納米顆粒作為無機納米粒子，具有化學性質穩定、價格低廉和比表面積大的特點，其可以均勻地分散在裂解液體系中，能夠更有效地結合核酸，因此二氧化硅及其衍生物被廣泛用于核酸固相分離[28, 42-43]。二氧化硅吸附核酸的方法主要分為：鹽橋法、直接靜電法和配位法[44]。鹽橋法中二氧化硅顆粒吸附核酸的驅動力包括靜電屏蔽作用、脫水作用以及分子間氫鍵作用。在高濃度鹽中顆粒與核酸之間的靜電斥力會被屏蔽；當鹽濃度達到1個臨界值時，顆粒與核酸足夠近的情況下可以通過分子間氫鍵的作用使得核酸吸附在二氧化硅顆粒表面；在胍鹽存在的情況下，顆粒和核酸還可以通過脫水作用結合在一起[44]。另外，二氧化硅納米顆粒表面也可以包覆聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)[45]、殼聚糖[46]等聚陽離子電解質，使顆粒在特定的裂解條件下呈正電荷，通過直接靜電作用與帶負電荷的核酸相結合。Jiang等[47]采用雙羧基偶聯劑與二氧化硅納米顆粒偶連，使得其表面有雙羧基能夠鰲合Fe3+，進而通過Fe3+與磷酸根的配位作用來結合核酸。

1.2 金屬及其衍生物

金納米粒子(Au-Nanoparticles，Au-NPS)作為金屬材料，具備與四種脫氧核苷結合的良好的親和力，被廣泛用來結合核酸分子[31, 48-49]。由于雙鏈DNA(Double Stranded DNA，ds-DNA)的結構復雜[50]，且具有比單鏈DNA(Single Strand DNA，ss-DNA)更高的電荷密度，不利于與表面帶負電荷的Au-NPS結合，因此Au-NPS主要用來結合ss-DNA，且該結合僅在高溫下完成。另外有研究發現Au-NPS與ss-DNA的結合隨著DNA鏈的長度增加而減弱，且粒子的粒徑大小在二者的結合力強度方面起著非常關鍵的作用[51]。

另外，學者們對銀納米粒子(Ag-Nanoparticles，Ag-NPS)結合特定的DNA序列的檢測技術也進行了廣泛研究[52-54]。Basu等[53]發現銀納米粒子(Ag-NPS)與DNA中的核酸堿基之間存在非常緊密的親和力，根據Gu等[55]的報道這是因為Ag-NPS可以與DNA分子的堿基鳥嘌呤(G)和腺嘌呤(A)的N7原子以及堿基胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的N3原子結合。Yang等[54]采用原子力顯微鏡觀察發現Ag-NPS與ss-DNA可以實現有效的結合，而與ds-DNA之間卻是彼此獨立的隨機排列。

除金、銀納米顆粒外，四氧化三鐵納米顆粒，作為一種磁性納米顆粒，可以通過共價鍵結合核酸[24]，只是鮮少用四氧化三鐵納米顆粒直接進行核酸分離，因為四氧化三鐵納米顆粒在結合核酸后的超順磁性減弱或者消失[56-57]，則不能發揮磁力分離的高通量和自動化優勢。因此，多是在其表面負載二氧化硅及其衍生物、進行功能基團修飾[58-59]，通過靜電作用等結合核酸，用于快速分離。

1.3 其他固相材料

云母[36]作為一種鋁硅酸鹽，可以通過共價鍵來結合核酸，或者對其進行化學修飾使其帶正電荷，通過靜電作用結合帶負電的DNA分子。同樣，合成樹脂，如DEAE-Sephaeose[60]往往也是帶正電荷的，可以通過靜電作用與核酸結合。另外，DNA與單壁碳納米管[61]、氧化石墨烯[41]可以通過π堆積作用結合。Zhao等[62]通過模擬研究得到的結果顯示C60可以在水溶液中與核苷酸緊密結合，驗證了核酸與碳材料物質間的結合。當然還有一些其他的材料可以用于核酸分離，如纖維素[39]可以與核酸共價連接。

2 核酸固相分離及其在病原PCR診斷中的應用

固相核酸分離方法主要是基于一些對核酸有吸附作用的聚合物材料，出于提高吸附量的目的，具有高比表面積和多孔結構的納米顆粒材料備受青睞。隨著磁性材料的發展，1997年，Hawkins等[63]提出了核酸磁力分離——基于磁性材料快速分離核酸，并迅速發展，成為如今主要的核酸固相分離手段。下面，我們將從核酸磁力分離和非磁力分離綜述近年來核酸固相分離的進展及其在分子檢測中的應用。

2.1 磁力分離的原理

磁力分離是基于磁性納米顆粒的一種固相分離手段，其中磁性納米顆粒是指納米級的粒子，一般為核殼型結構，由Fe、Co、Ni及其氧化物等組成內核，核外層則由高分子聚合物組成殼層，具有超順磁性、比表面積大、無毒和粒徑可控等優點[64-69]。這種基于磁性顆粒的核酸磁力分離，通過在一定溶液條件下，對核酸進行選擇性吸附，吸附核酸的磁性納米顆粒在外加磁場(如磁鐵)時可控移動，從而從含有蛋白質、多糖等雜質的體系中分離出來，再通過洗滌、脫附，實現核酸的提取，全過程通?？稍?0 min內完成[70-71]。分離過程示意圖如圖1所示。磁力分離過程因為避免了離心、過濾等繁瑣操作，有效提高了分離速度，可以實現自動化操作，現已有基于磁力分離原理的核酸自動提取儀實現了商業化，通過自動化操作不僅極大限度地節約了人力資源，同時也避免了諸多手動操作中的誤差[70]。

圖1 磁力分離過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of magnetic separation

2.2 磁性納米顆粒的制備與開發

由于二氧化硅具備良好的結合核酸的能力，二氧化硅包覆磁流體形成的Fe3O4@SiO2微球顆粒是最常用的核酸磁力分離納米材料。將二氧化硅涂覆到Fe3O4表面，主要方法有微乳液法[72]和St?ber法(原硅酸四乙酯的堿水解法)[73-76]。St?ber法因為不存在表面活性劑，合成后的顆粒保留了快速的磁響應能力，同時表面二氧化硅層可以防止顆粒之間的聚集，分散性好，更適合生物應用[77-78]。然而St?ber法中的多步修飾程序使制備過程既耗時又費力，Ma等[79]因此開發了一種溶劑熱法，可以更簡單、低成本地制備形狀均一、單分散性的Fe3O4@SiO2納米顆粒，將其用于大腸桿菌的核酸分離，可以獲得高品質無蛋白質污染的核酸用于PCR擴增。Fan等[80]則將溶劑熱法改進，首先使用四氯化硅作為交聯劑修飾Fe3O4顆粒表面,繼而實現顆粒表面硅層的快速可控生長，所得納米顆粒具有優異的耐酸性和穩定、致密的硅涂層，用于質粒DNA分離具有比商業化磁珠更高的產率。

隨著二氧化硅負載技術的不斷發展，越來越多的磁性納米粒子被開發出來，得到了普遍優于市售磁性納米顆粒的應用效果。Dao等[81]制備了二氧化硅包覆的磁性納米顆粒，用于提取乙型肝炎病毒(Hepatitis virus type B，HBV)和巴爾病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)的基因組DNA，結果顯示，該磁性顆粒提取的DNA在PCR擴增中產物條帶在紫外光下清晰、明亮，具有比市售磁性顆粒更好的DNA純化效率。Xu等[82]制備的二氧化硅包覆的具有理想磁化強度的磁性復合微球可作為有效的質粒DNA富集載體，相較于市售SM1-015B微球有很大優勢,能夠得到更大的提取效率與更優的質量。Deng 等[83]制備了以Fe3O4@SiO2為核、垂直排列的介孔二氧化硅微球，具有均勻的孔徑(2.3 nm)，借助其較大的孔徑和優異的磁性，能夠實現微囊藻毒素的快速高效(分離效率>95%)分離。Liu等[84]合成了Fe3O4@SiO2納米顆粒用于DNA定量分析，發現與市售微型Dynabeads(R)相比，該納米顆粒具有更好的靈敏度來定量DNA，檢測限能夠達到4 000堿基對(人類DNA片段)。

二氧化硅廣泛應用于包覆Fe3O4制備磁性納米顆粒，不僅可以有效防止磁性納米顆粒聚集，同時也方便引入其他活性基團[78]。He等[85]采用氨基修飾的二氧化硅包覆的磁性顆粒分離質粒DNA，發現從1 mL制備的細菌裂解液中可分離到約55 μg的pEGFP-N3質粒DNA，與傳統的酚氯抽提方法(同樣條件分離到約55 μg的pEGFP-N3質粒DNA)相比有很大的優勢，且A260/A280的比值可以達到1.9，說明提取的DNA純度很高，可以忽略蛋白質的污染。Wu等[59]采用羧基修飾的二氧化硅包覆的磁性納米顆粒分離大腸桿菌樣品中的DNA，發現提取的DNA平均濃度為16 mg/L，其A260/A280的比值為1.75(提取質量較好)，且電泳結果顯示大腸桿菌分子量按照預期分布，每個波段的亮度均勻，說明羧基修飾的磁性納米粒子用于核酸提取的有效性。Pham等[86]采用二氧化硅包覆的磁性顆粒與氧化石墨烯組成的新型磁性材料，用于RNA的提取，發現得到RNA的數量是傳統的酚氯抽提方法的1.7倍。Chen等[67]以戊二醛為交聯劑，通過共價鍵將血紅蛋白固定在氨基功能化的Fe3O4@SiO2磁性納米粒子表面，得到了血紅蛋白修飾的新型磁性納米復合材料，將其應用于大腸桿菌中質粒DNA的提取，發現對質粒DNA的吸附效率可以達到93%。另外，Per?in等[87]制備了新型材料——聚甲基丙烯酸羥乙酯磁性納米粒子，發現其對質粒DNA的總回收效率可以達到92%，且該磁性顆粒在不明顯降低質粒DNA的吸附量前可被循環使用6次。

2.3 磁力分離在病原PCR診斷中的應用

磁力分離作為一種高效、節省成本的分離方法，具備與核酸結合后能夠在外加磁場快速移動的特點[84]，可以避免傳統核酸分離過程中繁瑣的離心操作和諸多手動操作誤差，具有下游高通量和自動化應用的前景[71]。

Zainabadi等[88]建立了基于二氧化硅磁性粒子高通量分離干血斑核酸(如圖2所示)的方法，全過程使用排槍在96孔板上操作，通量高，只是整體時效性尚未有顯著改善(提取時間約80～120 min)。因為從復雜的生物體中提取PCR診斷所需的核酸，往往包含多個步驟：樣本的裂解、核酸的分離、純化與洗脫。樣本裂解作為分離前的必需步驟，目前普遍需要耗時的溫浴過程，且對動植物組織樣本，低溫研磨等預處理又難以避免[89]，不僅不能完全發揮磁力分離的高通量優勢，同時制約核酸提取的整體時效性。Li等[90]則通過優化裂解過程，排除組織樣本繁瑣預處理同時將裂解時間縮短至最短15 min，再結合高通量磁力分離，報道了一種在96孔板上操作的全過程高通量的核酸提取方法，繼而結合可視化熒光定量PCR，建立了一種靈敏、準確的柞蠶微孢子蟲快速篩查技術，為更高效、更準確的柞蠶微粒子病防疫提供了新思路(如圖3所示)。

圖2 高通量核酸提取方法原理示意圖[88]Fig.2 Schematic diagram of the high throughput nucleic acid extraction method[88]

圖3 a)高通量ALMS-qPCR用于柞蠶微粒子病防疫b)微粒子病防疫策略c)高通量磁力分離核酸靈敏、可視化qPCR檢測[90]Fig.3 a)High throughput ALMS-qPCR for Pébrine control b) Pébrine control strategy c) high throughput magnetic separation of nucleic acids sensitive and visualized qPCR detection[90]

2.4 非磁力固相分離

現行非磁力固相分離多需要通過過濾、離心、

移液等繁瑣操作才能將結合有核酸的固相材料從裂解液中分離出來，相比于借助外加磁場即能快速移動、分離的磁性顆粒而言，往往需要更多、更密集的人力操作，效率和通量局限大。Zou等[39]利用纖維素可以結合核酸的特性，選擇具有一定剛性的纖維素紙條作為核酸固相分離載體，通過在裂解液和清洗液之間轉移，快速從裂解液中分離出可供PCR檢測的模板，時間不超過30 s。但遺憾的是，樣本傳統裂解過程的耗時性與繁瑣性未能得到有效解決，依舊制約著核酸提取的效率，且纖維素紙條1次只能提取1個樣本，分離通量低。另外，纖維素洗脫DNA困難，需要將結合有DNA的纖維素紙條作為PCR擴增的模板，對下游PCR的選擇具有局限性。

圖4 纖維素紙條提取核酸示意圖[39]Fig.4 Schematic diagram of nucleic acid extraction using cellulose-based paper[39]

3 核酸固相分離的局限及發展前景

固相核酸分離，尤其是磁力分離，相比液相分離具有下游高通量和自動化應用的優勢，本論文通過綜述核酸結合材料的開發、結合機制、核酸固相分離以及固相分離在病原PCR診斷應用方面的進展，借以論述核酸固相分離現有的應用局限性和發展前景。

由上所述，我們不難看出，磁力分離作為高通量核酸提取極具優勢，但仍普遍受限于耗時的樣本裂解過程，尤其是動植物組織樣本難以避免的研磨等繁瑣預處理，限制了整體核酸提取過程的全過程通量及提取時效性。同時，報道指出：磁力分離中納米顆粒解吸核酸困難、DNA提取效率普遍偏低，通過將磁性納米粒子與DNA的復合物直接作為PCR模板可以避免這個問題[91]。但磁性顆粒對PCR擴增過程具有強抑制作用，洗脫過程不可避免[92]。此外，磁性納米顆粒固有的團聚[57]、沉降[93]等現象，在平行處理批量樣本時，很大程度上會影響分離過程的穩定性。磁力分離中，因為納米顆粒沉降現象，核酸與磁性納米顆粒不能充分結合而影響提取產率；納米顆粒團聚則可能會引起清洗不完全與雜質包裹等問題，影響磁力分離的提取質量，而這些過程與磁性納米顆粒的尺寸、磁化強度及與核酸分子間的作用力強弱等動力學因素息息相關。因此，磁力分離可能的幾個發展方向是：1)開展高效生物樣本裂解過程研究，系統揭示裂解動力學過程，建立高效、快速、常溫裂解過程，提高核酸釋放量并降低多樣本平行處理時的氣溶膠污染風險，為后續高效、高質量磁力分離過程提供保障；2)研發新型、高效的磁性顆粒材料，并揭示核酸“吸附-脫附”動力學過程，不斷優化磁力分離過程，提高分離效率和質量，是下游病原PCR診斷靈敏度與準確性的重要保障。

非磁力核酸固相分離，除了同樣需要解決樣本裂解步驟的局限性，同時還需要攻克核酸分離、純化過程中對離心、過濾和移液等的依賴。纖維素紙條30 s快速分離核酸的報道[39]，讓我們看到了非磁力固相分離巨大的發展前景：通過手動或自動化設備，利用機械力將核酸固相結合材料快速、直接地從復雜裂解液體系中轉移出來，能獲得比磁力分離更快、更穩定的分離過程，也避免了顆粒狀的磁性納米顆粒聚集、沉降帶來的高通量分離過程不穩定的局限。