基于DIALC-MS的煙草根尖蛋白質樣品檢測分析

莫澤君 陳小翔 蒲媛媛 段麗麗 田宗林 滕建輝 羅雯 闕遠慧 劉仁祥

基于DIA LC-MS的煙草根尖蛋白質樣品

檢測分析

莫澤君1，2，陳小翔3，蒲媛媛1，2，段麗麗1，2，田宗林2，4，滕建輝2，4，

羅 雯2，4，闕遠慧2，4，劉仁祥2，4*

（1貴州大學農學院 貴陽 550025;2貴州省煙草品質研究重點實驗室，貴陽 550025;3浙江中煙工業有限責任公司，

杭州 310000;4貴州大學煙草學院，貴陽 550025）

摘要：【目的】分析數據非依賴性采集高分辨率色譜—質譜技術（DIA LC-MS）對根尖差異蛋白質樣品檢測的適用性，為深入研究煙草蛋白質組學提供技術支撐。【方法】以6個煙草品種（系）移栽后74 d的根尖組織為試驗材料，采用DIA LC-MS法對裂解的蛋白質肽段進行掃描，從而分析該方法對根樣組織的適用性。【結果】采用TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法提取根尖總蛋白質，能得到橫向條帶平行性好，電泳條帶清晰的蛋白質樣品，樣品等級評價均達到A級。構建的DDA數據庫包含28042條肽段，共鑒定出7084個蛋白質。DIA數據的色譜峰平均數據點為7，平均的峰容量達260，主要肽段的保留時間（iRT）均被檢測出，且整體較穩定，在Q值為0.01標準下的一致性評分（Cscore）為0.948，變異系數（CV）中值為11.5%（小于20.0%），相關系數大于0.9。DIA全息掃描模式下從6個煙草品種（系）的根尖組織中鑒定出的蛋白質數目為4149～5069個。【結論】DIA LC-MS分析鑒定的蛋白質范圍廣、數量大、可信度高，具有一定的可靠性和穩定性，各項質控指標均能達到試驗分析要求，說明DIA LC-MS適用于煙草根尖蛋白質組樣品的檢測分析。

關鍵詞： 煙草;DIA LC-MS;根尖;蛋白質;檢測;適應性

中圖分類號：S572.035.3? ? ? ? ? ?   ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-2962-07

Detection and analysis of protein samples of tobacco root tip tissue based on DIA LC-MS

MO Ze-jun1，2， CHEN Xiao-xiang3， PU Yuan-yuan1，2， DUAN Li-li1，2， TIAN Zong-lin2，4，TENG Jian-hui2，4， LUO Wen2，4， QUE Yuan-hui2，4， LIU Ren-xiang2，4*

（ 1College of Agricultural， Guizhou University， Guiyang? 550025， China; 2Key Laboratory of Tobacco Quality in Guizhou Province，Guiyang? 550025， China; 3Zhejiang Zhongyan Industry Co.，Ltd.， Hangzhou? 310000， China; 4College of Tobacco，Guizhou University， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】The applicability of data-independent acquisition high-resolution chromatography-mass spectrometry （DIA LC-MS） for the detection of differential protein samples in root tips was analyzed to provide technical support for in-depth study of tobacco proteomics. 【Method】The root tip tissue of 6 tobacco varieties （lines） was used as the test material at 74 d after transplantation， and the cleaved protein peptides were scanned by DIA LC-MS method to analyze the applicability of this method to root-like tissue. 【Result】The total protein of root apex was extracted by TCA/acetone precipitation + SDT lysis method， and protein samples with good parallelism of horizontal bands and clear electrophoresis bands were obtained， and the sample grade evaluation all reached grade A.The constructed DDA database contained 28042 peptides， and a total of 7084 proteins were identified. The average chromatogram peak of the data was 7， the average peak capacity was 260， the main retention time（iRT） was detected， and the retention time was generally stable， the consistency score（Cscore） was 0.948 under the Q value of 0.01 standard， the median coefficient of variation（CV） was 11.5% （less than 20.0%）， and the correlation coefficient was greater than 0.9. The total number of proteins identified from the root tip tissue of six tobacco varieties （lines） under DIA holographic scanning mode ranged from 4149 to 5069.【Conclusion】The proteins identified by DIA LC-MS analysis have a wide range， a large number， high relia-bility， and certain reliability and stability. All quality control indicators can meet the requirements of experimental analysis， indicating that DIA LC-MS is suitable for detection and analysis of proteomic samples from tobacco root tips.

Key words： tobacco; root tip tissue; protein; DIA LC-MS; detection; adaptability

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（32060510）; Science and Technology Department Project of Guizhou （〔2016〕5663）;Science and Technology Department Project of Guizhou （〔2019〕1405）

0 引言

【研究意義】煙草是廣泛栽培的特種經濟作物，也是遺傳背景較清晰的模式植物（劉強等，2020）。煙草根系作為煙株最重要的器官之一，對煙草的生長發育起著至關重要的作用（張玉濤等，2012;張琳等，2019）。隨著現代生物技術的不斷發展，從整體水平上研究生物體內的蛋白質組成及其生命活動規律，已成為了解基因功能的另一新途徑（韓平安，2016）。因此，探索煙草根尖蛋白質樣品的提取方法及質譜定性和定量檢測技術，對于從蛋白質水平尋找煙草根組織的生物標志物質，研究煙草生命活動規律具有重大意義。【前人研究進展】近年來，質譜儀器可按照數據非依賴性采集（DIA）的形式進行掃描，實現高通量檢測和質譜絕對定量（Tsou et al.，2015;牟永瑩等，2017;Demichev et al.，2020）。張譯元等（2021）基于DIA技術對轉IGF-I基因細毛羊皮膚組織進行蛋白組學分析，結果篩選出18個與羊毛性狀相關的差異蛋白及8條與羊毛生長發育相關的信號通路，為探明羊毛性狀的分子調控機理及分子標記育種提供參考依據。Guo等（2015）采用PCT-DIA技術將來自9個腎癌病人的18個組織切片分別轉化為DIA多肽離子碎片譜圖，并根據譜圖對2000個蛋白樣本進行定性和定量分析，結果發現腎組織切片的蛋白質組測序結果具有很好的重復性，而且能完全將腎癌病人和健康人，以及不同組織形態的腎癌亞型區分開來。Yu（2019）通過DIA技術和抗體微陣列技術，對銀屑病治療前、銀屑病中藥治療后、健康對照共50例血清樣本建立蛋白質表達譜，結果鑒定出106種參與血液凝固、炎癥、細胞凋亡和血管生成等銀屑病相關生物過程的差異蛋白，其中58種蛋白可區分健康組和銀屑病患者，12種蛋白可預測中藥治療效果，3個血清蛋白與銀屑病面積和嚴重程度指數評分呈正相關。可見，DIA技術的發展對生物標志物的篩選具有重大意義。但對于植物根系的蛋白質提取及分析多采用數據依賴性采集（DDA）的掃描方式（肖爽，2020），該方法存在掃描粗獷，覆蓋率低，樣品數據質量偏低等問題，難以滿足試驗需求（王震，2016）。【本研究的切入點】煙草作為生物技術研究的模式植物，但目前鮮見應用數據非依賴性采集高分辨率色譜—質譜技術（DIA LC-MS）方法分析根系蛋白質組表達情況的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以6個煙草品種（系）的根尖組織為試驗樣品，采用DIA技術對裂解的蛋白質肽段進行掃描分析，探討DIA LC-MS法對根樣組織的適用性，為深入研究煙草根系的蛋白質組學提供更高效分析方法。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

選用K326、青梗、Va116、Basma、K326×青梗和Va116×Basma為試驗材料，由中國農業科學院煙草研究所提供。主要試劑：BCA蛋白濃度測定試劑盒（5000201）購自Bio-Rad公司;胰蛋白酶（V5113）購自Promega公司;iRT試劑盒（Ki-3002-2）購自Biognosys公司。主要儀器設備：高效液相色譜（LC-10AT）購自Shimadzu公司;安捷倫多重親和力去除系統（1200）購自Agilent公司;EASY-nLCTM1200納米液相色譜系統（LC140）和Q-Exactive HF-X識別系統（EXR0726042）購自Thermo公司;EASY-SprayTM C18色譜柱（ES802A）購自Thermo Scientific公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 田間試驗 田間試驗于2019年在貴州大學煙草科研基地開展。當年2月25日播種，5月1日移栽至大田，采用隨機區組設計，設置3次重復，每小區3行，每行15株，共45株，行株距：110 cm×55 cm。大田管理措施與當地優質煙栽培措施一致。移栽后74 d進行取樣，取樣部位為煙草幼嫩根尖。每小區隨機取3株混合，為避免外源污染，用純凈水清洗干凈后，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗。根尖樣品等量均勻混合后，置于不同滅菌離心管中，先用液氮冷凍，并立即置于-80 ℃低溫冰箱保存。

1. 2. 2 蛋白質樣品制備 蛋白質樣品的制備采用TCA-丙酮沉淀法。具體操作參見Thierry（2002）、范龍泉等（2012）的方法進行。

1. 2. 3 蛋白質濃度測定 參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白質濃度測定。

1. 2. 4 蛋白質酶解及肽段濃度測定 參照李升升（2019）、徐昊（2019）的方法進行蛋白質酶解。采用紫外光吸收法（280 nm）測定肽段濃度。取100 μg高豐度分離后的低豐度肽段，采用HPRP方法進行分級，收集所有組分。每個組分肽段凍干后，用10 μL 0.1% FA復溶肽段，并測定肽段濃度。然后分別取出2 μg肽段，摻入適量保留時間（iRT）標準肽段進行DDA質譜檢測，每個組分質譜分析時長90 min。

1. 2. 5 質譜檢測方法 DDA分析采用納升流速HPLC系統Easy nLC-1200進行色譜分離。質譜檢測及DIA分析參照周淦（2016）、李琛（2017）的方法等進行。

1. 2. 6 LC-MS/MS及數據分析方法 DDA數據采用Maxquant（Maxquant_1.5.3.17）進行數據庫檢索，采用Tobacoo_uniprot下載數據庫，并將iRT肽段序列添加到數據庫中。參數設置參照邵若玄等（2018）、傅龍龍（2019）的方法進行。數據庫檢索鑒定到的蛋白必須通過設定的過濾參數，即錯誤發現率（FDR）<1%。將原始RAW文件和搜庫結果導入Spectronaut軟件構建質譜數據庫，并采用Spectronaut Pulsar X_12.0.20491.4進行DIA數據處理，數據庫與建庫所用數據庫相同。參數設置如下：retention time prediction type設為dynamic iRT;interference on MS2 level correction設為enabled;cross run normalization設為enabled，所有結果必須通過設定的過濾參數Q value cutoff為0.01（相當于FDR<1%）。

2 結果與分析

2. 1 樣品總蛋白提取質量檢測結果

提取高質量的植物樣品蛋白質是后續構建數據庫及準確鑒定蛋白質的先決條件，要求提取的蛋白質樣品損失小，降解率低，非蛋白雜質少，溶解度高，釋放盡可能多的肽段。本研究采用TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法提取根尖全蛋白，取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖1所示。樣品中含有分子量在25～66.2 kD之間的高豐度蛋白，橫向條帶平行性好，電泳條帶清晰，說明樣品間一致性較好，提取的蛋白質量滿足試驗要求。

2. 2 根尖蛋白濃度測定結果

蛋白質濃度的測定可為后期質譜檢測中樣品上樣量的確定提供依據。由根尖樣品總蛋白質提取結果（表1）可知，6個供試材料的蛋白質濃度為2.3983～2.8875 μg/μL，20 μg樣品的總體積在7.1874～8.8313 μL，差異較小，樣品等級均為A級，滿足上樣量需求。

2. 3 蛋白質圖譜數據庫構建結果

DIA采用全息掃描模式獲得的圖譜極其復雜，難以和當前數據庫進行直接比對，從而無法完成蛋白質的定性。因此，需對實際樣本進行深度DAA分析，以獲得實際樣本的質譜圖庫。本研究共檢測到28042條肽段，共鑒定得到7084個蛋白質，表明構建的DDA數據庫信息資源豐富，對提高后續蛋白質鑒定的準確性和定量數目具有重大意義。

2. 4 質譜數據的質量檢測分析結果

要評價某個方法對實驗樣本的適用性，首先需要對得到的原始數據進行質量控制分析。一般的評價指標有平均數據點、峰容量、肽段的iRT及FDR等。由質譜數據的質控分析可看出，DIA數據的色譜峰平均數據點為7（圖2），平均的峰容量達260（圖3），主要肽段的iRT均被檢測出，并且整體較穩定（圖4），在Q值為0.01標準下的一致性得分（Concensus Score，Cscore）為0.948（圖5），QC樣品（一般為所有樣本的混樣）變異系數（Coefficient of variation，CV）中值為11.5%（小于20.0%），相關系數大于0.9（圖6和圖7）。

2. 5 蛋白質的定性檢測結果

DIA分析結果（圖8）顯示，6個供試材料的蛋白質數量存在差異。Va116×Basma、Va116和Basma中鑒定到的蛋白質數量較多，達到5069和5064個;K326和青梗的蛋白質數量最少，分別為4638和4149個;2個雜交種材料的蛋白質數量居中，分別為4946和4721個。可見，DIA全息掃描模式下鑒定的蛋白質范圍廣、數量大、可信度高，供試材料的蛋白質較豐富。

3 討論

3. 1 根尖蛋白質樣品的提取方法

由于煙草根系組織中含有大量的色素、氧化酶、糖、酯類、多酚類及其他次生代謝物質，使得蛋白質的提取較為困難，因此，在進行蛋白質提取時要盡可能地去除樣品中的雜質成分（李浩，2007;王潤潤等，2019）。林世峰等（2012）以煙草K326的生長期根系為材料，通過比較4種蛋白質提取方法，結果表明酚提取法更適合于幼嫩根系的蛋白質提取，TCA/丙酮沉淀法易使樣品降解，且高分子量的蛋白易丟失。在黃瓜根系研究中TCA/丙酮沉淀法能獲得較好的凝膠圖譜（王珊珊等，2012），但在棉花根系相關研究中，此法并不是最佳方法（王曼等，2015）。可見，不同作物因其自身特性，所適用的蛋白質提取方法也不同。本研究使用TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法提取根尖全蛋白，得到分子量介于25～66.2 kD的高豐度蛋白，且樣品蛋白電泳條帶清晰。可見，核酸和脂蛋白的影響小，雜質少，表明TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法適用于煙草根尖組織的蛋白質提取。

3. 2 蛋白質的定性分析

對復雜混合物中的蛋白質進行定性是蛋白質組學研究的一個重要目標，蛋白質定性的準確性對后期生物標志物的篩選具有重要意義。采用傳統的DDA方法，唐秀英等（2019）通過比較常溫與低溫處理下水稻苗期根系蛋白質組，共獲得可信肽段數12673條，鑒定的蛋白數量為3346個;高文霞等（2021）對青枯菌接種3 h的D101煙苗根系進行蛋白組分析，共鑒定到6762個蛋白質。本研究應用DIA蛋白質組學方法，首先對所有樣本的混合進行樣品酶解和HPRP分級，經過DDA分析，使用MaxQuant進行數據庫檢索鑒定，利用Spectronaut pulsar X軟件構建圖譜庫，建立了DIA 數據庫，其中包含28042條肽段，鑒定出7084個蛋白質，在不同比較組中篩選到大量差異表達蛋白。可見，采用DIA LC-MS方法構建的質譜數據庫信息資源豐富，對提高后續蛋白質鑒定的準確性和定量數目具有重要意義，得到的差異表達蛋白可為生物性狀標記物的篩選提供相關參考依據。

4 結論

DIA LC-MS分析鑒定的蛋白質范圍廣、數量大、可信度高，具有一定的可靠性和穩定性，各項質控指標均能達到試驗分析要求，說明DIA LC-MS適用于煙草根尖蛋白質組樣品的檢測分析。

參考文獻：

范龍泉. 2012. 低氧脅迫下γ-氨基丁酸對甜瓜幼苗多胺代謝的影響及比較蛋白質組分析[D]. 保定：河北農業大學. [Fan L Q. 2012. Effect of aminobutyric acid on polyamine metabolism and comparatiove proteomics analysis of melon seedings under hypoxia stress[D]. Baoding：Hebei Agricultural University.]

傅龍龍. 2019. 人精子冷凍復蘇過程中能量代謝功能紊亂的相關機制研究[D]. 北京：北京協和醫學院. [Fu L L. 2019. Studies of related mechanism of energy metabolism disorder in the human sperm cryopreservation[D]. Beijing：Peking Union Medical College.]

高文霞，鐘東源，余文，葉炎芳，程崖芝，巫升鑫，陳順輝，吳為人. 2021. 煙草根系在青枯病菌侵染早期的蛋白組分析[J]. 分子植物育種，19（5）：1466-1472. [Gao W X，Zhong D Y，Yu W，Ye Y F，Cheng Y Z，Wu S X，Chen S H，Wu W R. 2021. Proteomic analysis of tobacco roots at the early stage of infection by Ralstonia solanacearum[J]. Molecular Plant Breeding，19（5）：1466-1472.] doi：10.13271/j.mpb.019.001466.

韓平安. 2016. 高丹草雜種優勢的比較蛋白質組學研究[D]. 呼和浩特：內蒙古農業大學. [Han P A. 2016. Comparative proteomics research of heterosis of sorghum-sudangress hybrids[D]. Huhhot：Inner Mongolia Agricultural Unive-rsity.]

李琛. 2017. 天津市氯化工行業環境PCDD/Fs人體暴露及相關標志物研究[D]. 天津：天津醫科大學. [Li C. 2017. Human exposure and related biomarkers of PCDD/Fs in Tianjin chlorine chemical industry[D]. Tianjin：Tianjin Me-dical University.]

李浩. 2007. 烤煙打頂前后根尖組織差異蛋白質組分析[D]. 保定：河北農業大學. [Li H. 2007. Differential proteomics analysis in roots of flue-cured tobacco before and after topping[D]. Baoding：Hebei Agricultural University.]

李升升. 2019. 基于蛋白質組學的牦牛平滑肌嫩度形成機制研究[D]. 蘭州：甘肅農業大學. [Li S S. 2019. Mechanism of tenderness in yak（Boys grunniens） rumen smooth muscle during refrigerated storage based on proteomics[D]. Lanzhou：Gansu Agricultural University.]

林世鋒，張拓，史躍偉，王東茂，王志紅，楊志曉，謝升東，魏開華，任學良. 2012. 煙草根系蛋白質雙向電泳樣品制備方法的比較[J]. 貴州農業科學，40（8）：71-74. doi：10.3969/j.issn.1001-3601. [Lin S F，Zhang T，Shi Y W，Wang D M，Wang Z H，Yang Z X，Xie S D，Wei K H，Ren X L. 2012. Comparison of protein extraction methods for two-dimensional electrophoresis in tobacco root[J]. Guizhou Agricultural Sciences，40（8）：71-74.]

劉強，柳正葳，劉召亮，喬清華，張玉. 2020. 一氧化氮對鋁脅迫下煙草根系營養元素吸收和呼吸電子傳遞及內源激素含量的影響[J]. 江蘇農業學報，36（2）：292-298. [Liu Q，Liu Z W，Liu Z L，Qiao Q H，Zhang Y. 2020. Effects of nitric oxide on nutrient uptake，respiratory electron transfer and endogenous phytohormone contents in roots of tobacco seedlings under aluminum stress[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，36（2）：292-298.] doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2020.02.006.

牟永瑩，顧培明，馬博，閆文秀，王道平，潘映紅. 2017. 基于質譜的定量蛋白質組學技術發展現狀[J]. 生物技術通報，33（9）：73-84. [Mou Y Y，Gu P M，Ma B，Yan W X，Wang D P，Pan Y H. 2017. Advancements in quantitative proteomics technologies based on mass spectrometry[J]. Biotechnology Bulletin，33（9）：73-84.] doi：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0343.

邵若玄，徐紅星，劉樹生，王曉偉. 2018. 應用鳥槍法LC-MS/MS鑒定煙粉虱唾液蛋白[J]. 環境昆蟲學報，40（2）：433-439. [Zhao R X，Xu H X，Liu S S，Wang X W. 2018. Identifying whitefly salivary proteins by using shotgun LC-MS/MS[J]. Journal of Environmental Entomology，40（2）：433-439.] doi：10.3969/j.issn.1674-0858.2018.02.24.

唐秀英，王會民，龍起樟，黃永蘭，蘆明，萬建林. 2019. 低溫脅迫對水稻苗期根系影響的蛋白質組學研究[J]. 華北農學報，34（6）：82-88. [Tang X Y，Wang H M，Long Q Z，Huang Y L，Lu M，Wan J L. 2019. Proteomics analysis of rice root under low temperature stress at seedling stage[J]. Acta Agriculturae，34（6）：82-88.] doi：10.7668/hbnxb.20190090.

王曼，劉連濤，孫紅春，張永江，宋世佳，陳靜，成國鵬，李存東. 2015. 棉花根系總蛋白質提取及雙向電泳方法的改良[J]. 華北農學報，30（6）：128-133. [Wang M，Liu L T，Sun H C，Zhang Y J，Song S J，Chen J，Cheng G P，Li C D. 2015. The modified method for cotton root total proteins extraction and two-dimensional electrophoreses[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，30（6）：128-133.] doi：10.7668 /hbnxb.2015.06.019.

王潤潤，王東霞，張小微，楊巧玲，崔丹丹，張俊蓮，程李香. 2019. 用于蛋白質組分析的兩種馬鈴薯塊莖蛋白質提取方法的比較[J]. 甘肅農業大學學報，54（1）：89-95. [Wang R R，Wang D X，Zhang X W，Yang Q L，Cui D D，Zhang J L，Cheng L X. 2019. Comparison of two extraction methods of potato tuber protein based on proteomic analysis[J]. Journal of Gansu Agricultural University，54（1）：89-95.]doi：10.13432/j.cnki.jgsau.2019.01.012.

王珊珊，郝宇涵，任婧祺，郭春深，朱延殊，范海延. 2012. 黃瓜根系蛋白質組分析的雙向電泳技術條件優化[J]. 沈陽農業大學學報，43（2）：233-236. [Wang S S，Hao Y H，Ren J Q，Guo C S，Zhu Y S，Fan H Y. 2012. Optimization of two-dimensional electrophoresis for proteome of cucumber root[J]. Journal of Shenyang Agricultural University，43（2）：233-236.] doi：10.3969/j.issn.1000-1700. 2012.02.021.

王震. 2016. 基于質譜DIA數據處理算法軟件評估與肽段定量信號提取算法研究[D]. 長沙：國防科學技術大學. [Wang Z. 2016. Algorithms evaluation of based on date-independence-acquisition data processing and research on quantitative signal extraction algorithm for peptide[D]. Changsha：National University of Defense Technology.]

肖爽. 2020. 干旱對棉花微根系與地上部形態生理的影響及細根差異蛋白質組學分析[D]. 保定：河北農業大學. [Xiao S. 2020. The effects of drought on morphology and physiology of cotton micro-roots and shoot and fine roots differential proteomics analysis[D]. Baoding：Hebei Agricultural University.]

熊靜平. 2017. 肝硬化并門靜脈血栓的臨床分析及血清蛋白組學研究[D]. 烏魯木齊：新疆醫科大學. [Xiong J P. 2017. The clinical analysis and serum proteomics research of portal vein thrombosis in liver cirrhosis[D]. Urumqi：Xinjiang Medical University.]

徐昊. 2019. 枸杞不同生長期壁多糖變化的相關蛋白作用機制研究[D]. 銀川：寧夏大學. [Xu H. 2019. Study on the mechanism of related protein action in changes of cell wall polysaccharides during Chinese wolfberry（Lycium barbarum） fruit development[D]. Yinchuan：Ningxia University.]

張琳，翟雪琴，張進，彭劍濤. 2019. 激素和損傷處理對煙草根系發生及抗氧化酶活性的影響[J]. 山地農業生物學報，38（2）：15-19. [Zhang L，Zhai X Q，Zhang J，Peng J T. 2019. Effects of exogenous hormones and damage treatment on root development and antioxidant enzyme activity in tobacco[J]. Journal of Mountain Agriculture and Bio-logy，38（2）：15-19.] doi：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019. 02.003.

張玉濤，楊興平，李琳，程勁松，敖國富. 2012. 重金屬Pb、Cr、Cd對煙草生長的影響及其分布規律[J]. 南方農業學報，43（11）：1697-1702. [Zhang Y T，Yang X P，Li L，Cheng J S，Ao G F. 2012. Physiological action，growth，and accumulation rules of Pb，Cr，and Cd in tobacco[J]. Journal of Southern Agriculture，43（11）：1697-1702.] doi：10. 3969/j：issn.2095-1191.2012.11.1697.

張譯元，郭延華，唐紅，高磊，王新華，周平，王立民. 2021. 基于DIA技術的轉IGF-I基因細毛羊皮膚組織蛋白組學分析[J]. 農業生物技術學報，29（5）：943-951. [Zhang Y Y，Guo Y H，Tang H，Gao L，Wang X H，Zhou P，Wang L M. 2021. Proteomic analysis of skin tissue in IGF-I transgenic fine wool sheep（Ovis aries） based on DIA technology[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，29（5）：943-951.] doi：10.3969/j.issn.1674-7968.2021.05.011.

周淦. 2016. 香蕉枯萎病菌分泌蛋白質的差異表達分析[D]. 廣州：華南農業大學. [Zhou G. 2016. Analysis of differen-tial expressed secreted protein in Fusarium oxysporum f.sp.cubense[D]. Guangzhou：South China Agricultural University.]

Demichev V，Messner C B，Vernardis S I，Lilley K S，Ralser M. 2020. DIA-NN：Neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput[J]. Nature Publishing Group US，17（1）：41-44. doi：10. 1038/s41592-019-0638-x.

Guo T N，Kouvonen P，Koh C，Gillet L C，Wolski W E，R?st H L，Rosenberger G，Collins B C，Blum L C，Gillessen S. 2015. Rapid mass spectrometric conversion of tissue biopsy samples into permanent quantitative digital proteome maps[J]. Nature Medicine，21（4）：407-413. doi：10.1038/nm.3807.

Thierry R. 2002. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics：Old，old fashioned，but it still climbs up the mountains[J]. Proteomics，2（1）：3-10. doi：10.1002/1615-9861（200201）2：1<3：：AID-PROT3>3.0.CO;2-R.

Tsou C C，Avtonomov D，Larsen B， Tucholska M，Hyungwon C，Anne-Claude G，Nesvizhskii A I. 2015. DIA-Umpire：Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics[J]. Nature methods，12（3）：258-264. doi：10.1038/nmeth.3255.

Yu X B. 2019. In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicine[J]. Theranostics，9（9）：2475-2488. doi：10.7150/ thno.31144.

收稿日期：2021-01-08

基金項目：國家自然科學基金項目（32060510）;貴州省科技廳項目（〔2016〕5663）;貴州省科技廳項目（〔2019〕1405）

通訊作者：劉仁祥（1971-），https：//orcid.org/0000-0003-4562-8507，教授，主要從事煙草遺傳育種研究工作，E-mail：rxliu@gzu.edu.cn

第一作者：莫澤君（1994-），https：//orcid.org/0000-0002-4251-9922，研究方向為作物遺傳育種，E-mail：mojun11@foxmail.com