溫度脅迫下卵形鯧鲹仔魚骨骼組織病理及分子表征

韓明洋 周勝杰 楊蕊 胡靜 馬振華

摘要：【目的】探究不同養殖水溫對卵形鯧鲹仔魚骨骼組織病理和分子表征的影響，為進一步闡明魚類骨骼發育的分子機理和骨骼畸形發生可能的機制提供參考依據。【方法】采用蘇木精—伊紅（HE）染色技術對分別在24、28和32 ℃水溫下養殖一周后的卵形鯧鲹仔魚頭部和脊柱的骨骼組織進行觀察，并利用原位雜交技術探究不同溫度處理下骨骼發育相關基因的表達規律。【結果】隨著水溫的升高，卵形鯧鲹仔魚頭部軟骨的細胞增大，軟骨基質增多;高溫下更多仔魚的脊索向脊柱轉變，軟骨組織增多增大。頭部骨骼中BMP2、BMP4、RUNX2、MMP9、MMP13和OCN的原位雜交信號均隨水溫的升高而有所增強;而在脊柱中，BMP2和BMP4的原位雜交信號隨水溫的升高而增強，RUNX2、MMP9和OCN在不同處理組之間的差異不明顯，MMP13的信號則先增強后減弱。【結論】水溫的升高會影響一系列骨骼發育相關基因的表達，進而促進卵形鯧鲹仔魚頭部骨骼的發育，在促進脊柱軟骨組織增殖肥大的同時抑制脊柱的礦化。

關鍵詞： 卵形鯧鲹;溫度脅迫;骨骼發育;HE染色;原位雜交

中圖分類號： S917.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-3147-10

Histopathology and molecular characterization of the skeletal tissues of golden pompano （Trachinotus ovatus） larvae

under temperature stress

HAN Ming-yang1，2，3，4， ZHOU Sheng-jie1，2，3， YANG Rui1，2，3， HU Jing1，2，3， MA Zhen-hua1，2，3*

（1South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences， Guangzhou? 510300， China; 2Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation and Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Guangzhou? 510300， China; 3Sanya Tropical Fisheries Research Institute， Sanya， Hainan? 572018， China; 4College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai? 201306，China）

Abstract：【Objective】 This study was conducted to investigate the histopathological effects and molecular regulatory characterization of bone development of golden pompano （Trachinotus ovatus） larvae under different breeding temperatures， and to provide support for further elucidations of the internal molecular mechanisms of bone development and malformation in fish. 【Method】 Skeletal tissues of the head and spine of the larvae were observed using hematoxylin-eosin （HE） staining after a week of farming at 24 ℃， 28 ℃， and 32 ℃. In situ hybridization was used to observe the expression of bone development-related genes. 【Result】 With an increase in temperature， enlarged chondrocytes and increased cartilage matrix were observed in the head. At the highest temperature， 32 ℃， more larval notochords transformed into spine and more spinal cartilaginous tissues were formed. The in situ hybridization signals of BMP2，BMP4，RUNX2，MMP9，MMP13 and OCN in the head were enhanced with an increase in water temperature. In the spine，the in situ hybri-dization signals of BMP2 and BMP4 were enhanced with an increase in water temperature，while the differences of RUNX2，MMP9 and OCN were not obvious between the different treatment groups. The signal of MMP13 was the strongest in the middle temperature group. 【Conclusion】 The increase in water temperature may promote the development of bone in the head of the larvae by changing the expression of bone-related genes，and inhibit the mineralization of the spine while promoting the development of the spinal cartilaginous tissues.

Key words： Trachinotus ovatus; temperature stress; skeletal development; hematoxylin-eosin staining; in situ hybridization

Foundation item：Hainan Natural Science Foundation（2019CXTD418，319QN339，319MS102）; Fundamental Research Funds of Chinese Academy of Fishery Sciences（2020TD55）

0 引言

【研究意義】卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）又稱金鯧，隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes）鱸形目（Perciformes）鲹科（Carangidae）鯧鲹屬（Trachinotus），是一種廣鹽暖水性中上層魚類（許曉娟等，2009）。由于肉嫩味美，營養價值較高，且養殖周期短，可全程使用配合飼料，卵形鯧鲹已成為我國華南沿海重要的海水養殖魚類之一，生產規模不斷加大且暢銷海內外（劉錫強等，2014;黃倩倩等，2019;孫莘溢等，2019）。但在人工育苗過程中的畸形率較高，甚至達到33%，是制約卵形鯧鲹苗種培育和養殖規模進一步擴大的主要因素（鄭攀龍，2015）。仔、稚魚骨骼畸形是魚類苗種繁育過程中的常見問題之一。相對成魚而言，仔、稚魚的發育對外界因素更加敏感，環境和營養等因素均可能導致高畸形率的發生，在人工養殖條件下魚苗骨骼畸形發生更為常見（劉康等，2011;鄭珂等，2016）。骨骼發育異常會降低仔魚的運動和進食能力并提高其應激敏感性，從而導致魚苗質量下降，死亡率上升（Cahu et al.，2003;張書劍，2008）。溫度能影響魚類等變溫動物的存活、生長、攝食和繁殖，在魚體的新陳代謝等所有生理生化過程中起著重要的控制作用（李文龍等，2017;Sun et al.，2019;Zhou et al.，2019），是影響魚類苗種培育重要的環境因素之一。相關研究認為，水溫會影響魚的骨骼發育，過高或過低的水溫均會增加骨骼畸形率和死亡率（Ludwig and Lochmann，2009;Yang et al.，2016）。加強對卵形鯧鲹骨骼發育的研究，探討養殖水溫等環境因素對骨骼發育的影響，可豐富脊椎動物骨骼發育生物學的基礎理論，對優化養殖方案以減少骨骼畸形帶來的經濟損失具有重要意義。【前人研究進展】目前，國內外學者已對大黃魚（La-rimichthys crocea）（王秋榮等，2010）、塞內加爾鰨（Solea senegalensis）（Boglino et al.，2012）、刀鱭（Coilia nasus）（張宗鋒等，2015）、美洲鰣（Alosa sapidissima）（鄧平平等，2017）、鞍帶石斑魚（Epinephelus lanceolatus）（呂雪嬌等，2018）、尖吻鱸（Lates calcarifer）（周勝杰等，2018）和銀鱈魚（Anoplopoma fimbria）（Deary et al.，2019）等不同魚類的骨骼形態和發育進行了研究，并揭示了影響骨骼發育的因素，主要包括遺傳、營養和環境因素等（Cobcroft et al.，2004;黃超等，2013;鄭珂等，2016）。溫度作為水產養殖的重要環境因素之一，不適宜的溫度可能導致魚體生理機能的紊亂，造成生長異常及疾病發生，因此溫度與魚類骨骼發育的關系受到重視（Chen et al.，2002）。大西洋鮭魚（Salmo salar）在高溫下飼養脊椎畸形率超過28%（Ytteborg et al.，2010a）;不同的溫度變化會造成金頭鯛（Sparus aurata）的鰓蓋、脊柱、尾鰭和背鰭的畸形（Georgakopoulou et al.，2010）;溫度高于18 ℃會導致塞內加爾鰨的脊柱畸形率升高（Dionisio et al.，2012）。【本研究切入點】骨骼形成是一個通過涉及細胞外基質成分、信號分子和轉錄因子高度調節的分子途徑的復雜過程（Karsenty，2000）。目前，關于卵形鯧鲹的骨骼發育和畸形已有一些研究，如鄭攀龍等（2014）、鄭攀龍（2015）對卵形鯧鲹的骨骼發育時序以及溫度和營養對卵形鯧鲹骨骼畸形的影響進行了研究;Ma等（2016，2017b）對不同水溫或營養條件下卵形鯧鲹的頜骨畸形發生以及骨形態發生蛋白基因進行了研究，Sox家族等骨骼發育相關的基因也被初步了解（Ma et al.，2017a）;Sun等（2020）評估了在集約化養殖系統中，卵形鯧鲹早期發育階段骨骼畸形的類型和頻率。然而，未見卵形鯧鲹在溫度脅迫下骨骼組織病理學的相關報道，溫度調控卵形鯧鲹骨骼發育的分子機制尚不明確。【擬解決的關鍵問題】采用蘇木精—伊紅（HE）染色探討溫度對卵形鯧鲹仔魚骨骼組織的影響，采用原位雜交技術觀察不同溫度處理下骨骼發育調控基因的表達，旨在揭示卵形鯧鲹仔魚骨骼發育的分子機理及溫度對仔魚骨骼發育的內在調控機制，進一步豐富脊椎動物骨骼發育生物學理論。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

同批卵形鯧鲹的受精卵從海南省陵水縣某養殖場取得，運至中國水產科學研究院南海水產研究所熱帶水產研究開發中心孵化。孵化后第2 d將仔魚轉至9個500 L循環海水玻璃纖維缸中，密度為60尾/L，鹽度保持在（32±1）‰，溶解氧保持在6.7±0.2 mg/L，pH 7.7～8.1，每天投喂2次，及時吸污清底以保持水體清潔。

主要試劑包括無水乙醇、二甲苯、蘇木素—伊紅染液、鹽酸、氨水、中性樹膠、4%多聚甲醛（DEPC水）、石蠟、甲醇、雙氧水、PBS緩沖液（由DEPC水配制）、20×SSC洗脫液、BSA、10×蛋白酶K儲存液、雜交緩沖液、鼠抗地高辛標記過氧化物酶（anti-DIG-HRP）和DAB顯色劑。

主要儀器設備：脫水機（JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司）、包埋機（JB-P5，武漢俊杰電子有限公司）、病理切片機（RM2016，上海徠卡儀器有限公司）、凍臺（JB-L5，武漢俊杰電子有限公司）、組織攤片機（KD-P，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）、烤箱（DHG-9140A，上海慧泰儀器制造有限公司）、正置光學顯微鏡（NIKON ECLIPSE CI，日本尼康）、成像系統（NIKON DS-U3，日本尼康）、搖床（鐘擺式，TSY-B，Servicebio）、渦旋混勻器（MX-F，Servicebio）、Gene tech pen（GT1001，Gene tech）、恒溫箱（LGF-070A，武漢奧普森試驗設備有限公司）和高壓滅菌鍋（SYQ-DSX-280B，上海申安醫療器械廠）。

1. 2 試驗設計

分為3個試驗組，分別為低溫組（LT，24 ℃）、中溫組（MT，28 ℃）和高溫組（HT，32 ℃），每個試驗組設3個平行。養殖一周后對3組分別取樣，每缸各取10尾仔魚分別置于4%多聚甲醛中用于組織病理切片，另各取10尾通過液氮速凍后置于超低溫冰箱 -80 ℃保存用于原位雜交。

1. 3 組織切片制備及觀察

用4%多聚甲醛將仔魚固定24 h以上，經脫水和常規石蠟包埋后進行切片，片厚4 μm。脫蠟后采用蘇木精—伊紅進行染色，即切片入Harris蘇木素染色3～8 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗，入伊紅染液中染色1～3 min，脫水封片后進行顯微鏡鏡檢和圖像采集分析。染色結果中細胞核藍色，細胞質紅色。

1. 4 顯色原位雜交檢測

將樣品取出洗凈后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定12 h，完成后經梯度酒精脫水，進行浸蠟包埋和切片;依次將切片放入二甲苯Ⅰ 15 min、二甲苯Ⅱ 15 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、85%酒精5 min、75%酒精5 min、DEPC水洗，滴加蛋白酶K（20 μg/mL）37 ℃消化30 min，純水沖洗后PBS洗3次，每次5 min;滴加3%甲醇-H2O2，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS中，在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min;滴加預雜交液，37 ℃孵育1 h后傾去預雜交液，滴加含探針雜交液，恒溫箱37 ℃雜交過夜;用SSC洗去雜交液，滴加BSA，室溫30 min后傾去，滴加鼠抗地高辛標記過氧化物酶，37 ℃孵育40 min后，PBS洗4次，每次5 min;切片稍甩干后，在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。加Harris蘇木素復染3 min左右，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。最后脫水封片，進行顯微鏡檢和圖像采集分析。根據前期轉錄組測序數據所得卵形鯧鲹的骨形態發生蛋白（BMP2和BMP4）、鈣骨素（OCN）、侏儒相關轉錄因子2（RUNX2）和基質金屬蛋白（MMP9和MMP13）基因序列設計雜交所用探針（表1）。

2 結果與分析

2. 1 組織病理學觀察結果

由圖1可知，低溫組中，部分卵形鯧鲹仔魚頭部的軟骨基質染色較淺（圖1-A），脊索處未出現明顯軟骨組織分化（圖1-B）;中溫組中，頭部的軟骨基質增多，染色較深（圖1-C），而錐體后部存在少量脈棘軟骨組織，軟骨細胞較小，軟骨基質較少（圖1-D）;高溫組中，頭部的軟骨基質染色最深，軟骨骨膜增厚（圖1-E），錐體存在較多軟骨組織，細胞增大增多，軟骨基質明顯增多且顏色較深（圖1-F）。

2. 2 骨骼發育相關基因在仔魚骨系組織中的表達

原位雜交結果顯示，BMP2在卵形鯧鲹仔魚頭部軟骨的軟骨膜和軟骨基質中觀察到陽性雜交信號，當溫度從24 ℃升至32 ℃時，棕黃色陽性信號加強（圖2-A～圖2-C）;在脊椎中的陽性信號同樣隨著溫度的升高而增強（圖3-A～圖3-C）。頭部軟骨中BMP4的雜交信號在低溫組和中溫組中較弱且差異不明顯，在高溫組中雜交信號有所增強（圖2-D～圖2-F）;在脊柱中BMP4的雜交信號隨著溫度的升高而增強（圖3-D～圖3-F）。RUNX2在頭部軟骨的軟骨膜中存在陽性信號，中溫組和高溫組的陽性信號較低溫組稍強（圖2-G～圖2-I）;脊柱中RUNX2的雜交信號較弱，且在不同溫度處理組之間差異不明顯（圖3-G～圖3-I）。MMP9在頭部軟骨中陽性信號明顯，在高溫組中的信號稍強于低溫組和中溫組（圖4-A～圖4-C）;其在脊柱中的信號在不同溫度組之間差異并不明顯，且在高溫組中稍弱（圖5-A～圖5-C）。對于MMP13而言，頭部軟骨中高溫組的陽性信號稍強于低溫組和中溫組（圖4-D～圖4-F），而在脊柱中中溫組的陽性信號最強，在低溫組和高溫組中信號則較弱（圖5-D～圖5-F）。OCN在頭部軟骨中陽性信號隨著溫度的升高而增強（圖4-G～圖4-I），而在脊柱中陽性信號在不同處理組之間無明顯區別（圖5-G～圖5-I）。

3 討論

3. 1 不同溫度處理對卵形鯧鲹仔魚骨骼組織病理變化的影響

魚類骨骼發育主要涉及軟骨細胞、成骨細胞和破骨細胞的綜合作用。骨形成包括膜內成骨和軟骨內成骨2種方式，胚胎時期大多數骨以軟骨內成骨方式發生，軟骨組織逐漸被骨組織替代，涉及軟骨的生長與退化以及成骨和破骨的平衡過程等（孫冬梅，2009）。由于軟骨細胞和成骨細胞在軟骨形成過程中具有交互作用，使得骨和軟骨發育中遺傳相互作用的研究復雜化。通常人們通過直接觀察法、micro CT、X光透視和茜素紅—阿利新藍雙染色等方法對魚類骨骼進行觀察研究（張寧等，2012;萬世明等，2014;鄭攀龍等，2014;周勝杰等，2018），尤其是茜素紅—阿利新藍雙染色法的出現和不斷完善，對魚類早期軟、硬骨發育研究起到了極大的促進作用（陳淵戈等，2011）。現代細胞和分子生物學、組織學和組織化學等學科及技術不斷發展，為深入研究仔魚骨骼發育和探索各種因素對骨骼發育的調控機制等提供了新思路和條件。

針對哺乳動物的研究已表明，脊柱畸形發生過程中伴隨骨形態和骨細胞密度改變、成骨細胞變薄及細胞增殖和細胞死亡等形態學變化（Urban and Roberts，2003）。觀察仔魚骨骼組織形態的變化，是研究骨骼生長和骨骼畸形發生的重要方法。鄭攀龍（2015）對卵形鯧鲹仔魚骨骼發育的研究表明，其頜骨在孵化后第3 d已開始分化，在孵化后11 d頜骨基本完成礦化;而脊柱在孵化后7～9 d開始發育，出現髓棘和脈棘等并逐漸礦化，脊柱畸形的發生率也開始增多。本研究中，卵形鯧鲹仔魚孵化后8 d，在中溫組和高溫組中仔魚椎體血液區出現脈棘軟骨組織，在32 ℃條件下，部分仔魚軟骨細胞肥大且排列無序，軟骨基質鈣化更明顯;頭部的軟骨鈣化也隨溫度升高而加強。Ytteborg等（2010b）發現高溫導致大西洋鮭魚椎體融合畸形的增加，脊柱觀察結果表明其軟骨細胞呈現增殖旺盛且排列無序等特點，成骨細胞生長區與軟骨細胞區之間的邊界不明顯，椎間隙出現礦化。本研究結果與其存在相似，表明溫度的升高可能對卵形鯧鲹頭部骨骼的發育起到促進作用，在促進椎體軟骨發育的同時抑制其骨化進程，改變原有的骨骼發育順序進程。這可能是異常溫度誘導仔、稚魚骨骼畸形發生的原因之一。

3. 2 不同溫度處理對卵形鯧鲹仔魚骨骼發育相關基因的影響

3. 2. 1 信號分子和轉錄因子 骨形態發生蛋白（BMPs）是一類屬于TGF-β超家族的多功能生長因子，參與細胞增殖、存活、分化和凋亡的調控（Xiao et al.，2007），是骨骼發育的重要調控因子。BMP2通過誘導RUNX2等轉錄因子在未分化間質細胞中的表達，促進軟骨和成骨細胞的分化，促使非骨系細胞逆分化為骨系細胞（郁衛東和秦書儉，2000;Carreira et al.，2014），促進基質鈣化。BMP2對于軟骨內骨形成是不可或缺的，被認為是軟骨內骨發育過程中軟骨細胞增殖和成熟的主要因素（Shu et al.，2011）。軟骨細胞特異性敲除BMP2會導致嚴重的軟骨發育不良表型，如通過對斑馬魚（Danio rerio）BMP2基因進行敲降后發現，RUNX2等成骨相關基因的表達降低，斑馬魚的骨發育受到抑制（姜宇等，2019）。BMP4可誘導未分化間質干細胞向軟骨細胞的分化成熟，促使軟骨基質的增多（Nishimura et al.，2012;葉娜等，2017），影響骨骼的發育和重塑。在羅非魚（Oreochromis mossambicus）和鯉魚（Cyprinus carpio）肌肉中，BMP4的表達會影響肌間骨的分布（Su and Dong，2018）。Ytteborg等（2010a）探究了大西洋鮭魚脊柱中骨骼發育相關基因在不同飼養溫度下的表達差異，結果表明高飼養水溫下BMP2和BMP4的表達增強。Ma等（2016）的研究結果表明，BMP2和BMP4在卵形鯧鲹仔魚的轉錄水平同樣會隨著溫度的升高而增強，仔魚的頜骨畸形發生率也隨之增加。本研究結果表明，溫度的升高會導致卵形鯧鲹仔魚頭部和脊柱軟骨組織中BMP2和BMP4的表達增強。該結果進一步驗證了Ma等（2016）的推測，溫度可能通過上調BMP2和BMP4的表達而影響仔魚的頭部和脊柱骨骼發育。RUNX2的表達可影響軟骨細胞的增殖和成熟以及成骨細胞的分化（徐婧等，2016）。在本研究中，RUNX2在卵形鯧鲹仔魚頭部骨骼中的表達同樣隨著溫度的升高而增強，與BMPs的表達相一致。

3. 2. 2 細胞外基質成分 細胞外基質（ECM）主要由膠原、蛋白多糖、糖蛋白、糖胺多糖和彈力纖維等五大類物質組成，其動態變化與魚類發育、組織修復等生理過程密切相關（袁發煥，2000;Pedersen et al.，2015）。基質金屬蛋白酶（MMPs）是一類生物發育所必需的因子，也是參與ECM降解的重要蛋白酶，可幫助細胞遷移、增殖和細胞間的交流（Rajaram et al.，2016）。MMP9和MMP13是MMPs家族中的2個重要成員。MMP9是肥大軟骨細胞生長板血管生成和細胞凋亡的關鍵調節因子，MMP13則能調節肥大軟骨基質重塑，缺失會導致軟骨內骨化延遲（Vu et al.，1998;Stickens et al.，2004）。本研究中，MMP9和MMP13在高溫組卵形鯧鲹仔魚頭部軟骨中的表達信號較強，說明溫度可能會增強卵形鯧鲹仔魚頭部骨骼的重塑過程。對哺乳動物研究發現，MMP13與骨性關節炎等疾病有關，該基因在患關節炎的動物中表達上調，進而增加骨重塑和細胞外基質降解（Takaishi et al.，2008）。Wargelius等（2010）研究認為，MMP13的表達可能是養殖大西洋鮭魚ECM重塑增加和脊椎壓縮的早期跡象，其表達的增加會導致錐體結構和礦物質含量的改變，導致壓縮脊椎的發生。Ytteborg等（2010a）研究則表明，高的養殖水溫會導致大西洋鮭魚脊柱中MMP9和MMP13表達的下調。本研究中，卵形鯧鲹仔魚脊柱中MMP13在高溫組中的信號弱于中溫組，表明高溫可能抑制了脊柱的軟骨內骨化進程。脊柱中MMP13在高溫下的低表達還可能與BMP4的負向調節有關（Otto et al.，2007）。OCN是骨代謝的標志物之一，與骨基質的礦化有關（Al Rifai et al.，2017;蘇曉慧和李維辛，2020）。本研究中，卵形鯧鲹仔魚頭部骨骼中OCN的信號隨著溫度的升高而增強，脊柱中OCN的信號在不同處理組間差異不明顯。同樣表明溫度可能促進頭部骨骼的礦化，同時抑制脊柱的軟骨內骨化進程。頭部骨骼與脊柱中骨骼發育相關基因呈現不同的表達規律，可能與骨骼發育時序有關，而溫度的改變會導致仔魚骨骼發育時序發生變化（鄭珂等，2016）。

4 結論

水溫升高可能通過改變一系列骨骼發育相關基因的表達，進而促進卵形鯧鲹仔魚頭部骨骼的發育，在促進脊柱軟骨組織發育的同時抑制脊柱的礦化。

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收稿日期：2020-12-14

基金項目：海南省自然科學基金項目（2019CXTD418，319QN339，319MS102）;中國水產科學研究院基本科研業務費專項（2020TD55）

通訊作者：馬振華（1981-），https：//orcid.org/0000-0003-3112-3153，博士，副研究員，主要從事海水魚類繁育與發育研究工作，E-mail： zhenhua.ma@hotmail.com

第一作者：韓明洋（1995-），https：//orcid.org/0000-0002-0587-4124，主要從事海水魚類繁育與發育研究工作，E-mail：myhan2019@163.com

2111501186301