福建省政和縣煙草細菌性葉斑病的癥狀及病原菌鑒定

林可竟 周挺 詹夢琳 徐進 鄭鈺婷 林勇 林偉 顧鋼 蔡學清

摘要：【目的】明確福建省政和縣云煙87上新發生的一種細菌性病害的病原菌，為進一步探討其發病規律并制定有效的防控措施提供理論依據。【方法】采用平板劃線分離法對采自福建省政和縣的罹病云煙87煙葉進行病原菌分離純化，對分離獲得的細菌菌株通過柯赫氏法則驗證其致病性，并采用生物學特征、生理生化反應及特異性引物檢測、16S rDNA序列分析等明確其分類地位。【結果】從病葉上分離純化獲得15株細菌，經柯赫氏法則證明15株細菌菌株均為該病害的致病菌，且致病力無明顯差異。分離菌株在NA培養基上培養1～2 d后，菌落為白色隆起，邊緣不規則且黏稠，菌體短桿狀，極生4根鞭毛，革蘭氏染色反應陰性;經8項關鍵性生理生化特性測定、Biolog 94種表型測試、煙草野火病菌特異性引物檢測及16S rDNA基因序列分析，將15株細菌菌株鑒定為扁桃假單胞菌煙草致病變種（Pseudomonas amygdali pv. tabaci）。【結論】引發福建省政和縣烤煙葉部細菌性病害的致病菌為扁桃假單胞菌煙草致病變種。

關鍵詞：煙草;細菌性葉斑病;病原菌鑒定;扁桃假單胞菌煙草致病變種

中圖分類號：S432.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-3034-07

Symptoms and pathogen identification of tobacco bacterial

leaf spot disease in Zhenghe， Fujian

LIN Ke-jing1， ZHOU Ting2， ZHAN Meng-lin1， XU Jin3， ZHENG Yu-ting1，

LIN Yong4， LIN Wei5， GU Gang2*， CAI Xue-qing1*

（1College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou? 350002， China; 2Institute of Tobacco Science， Fujian Provincial Tobacco Company， Fuzhou? 350003， China; 3Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing? 100193， China; 4Zhenghe Branch of Nanping Tobacco Corporation， Fujian Provincial Tobacco Corporation， Nanping， Fujian? 353600， China; 5Nanping Branch of Fujian Provincial Tobacco Corporation， Nanping， Fujian? 353000， China）

Abstract：【Objective】To identify the pathogenic agent of tobacco（Yunyan 87） bacterial leaf spot disease newly found in Zhenghe County of Fujian in 2020， so as to provide a theoretical basis for further exploring the disease regularity and the precise control measures. 【Method】 The bacterial strains were isolated and purified from disease leaves of tobacco Yunyan 87 in Zhenghe County of Fujianby the plate-marking method， the pathogenicity of the isolated strains were tested by Koch’s Postulation， and its taxonomic status were confirmed by bacteria biological characteristics，physiological and biochemical characteristics， and specific primer detection and 16S rDNA gene sequence analysis. 【Result】The results showed that fifteen strains were isolated from diseased leaves of tobacco. According to Koch’s Postulation， all the fifteen strains were the pathogens of tobacco bacterial leaf spot disease and their pathogenicity was no obvious difference. The colonies of the pathogen were bulge and white on NA plate in 1-2 d cultivation， the edges were irregular and thick.The bacterial cellswere rod-shaped and had 4 flagella on polar. Gram stain was negative. Based on 8 key physiological and biochemical characteristics， 94 phenotypes in Biolog instrument， specific primer detection and 16S rDNA sequence analysis of the pathogens， all 15 tested isolates were identified as Pseudomonas amygdali pv. tabaci. 【Conclusion】The tobacco bacterial leaf diseases in Zhenghe County of Fujian is caused by P. amygdali pv. tabaci.

Key words： tobacco; bacterial leaf spot disease; pathogen identification; Pseudomonas amygdali pv. tabaci

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2017YFD0201106-02）; Science and Technology Project of Fujian Provincial Company of China Tobacco （KH1702210）

0 引言

【研究意義】由扁桃假單胞菌煙草致病變種（Pseudomonas amygdali pv. tabaci）（Gardan et al.， 1999）[同物異名：丁香假單胞菌煙草致病變種P. syringae pv. tabaci （Wolf et Foster） Young & Dye Wikie]引起的煙草野火病和丁香假單胞菌角斑致病變種[P. syringae pv. angulata（Frome et al.） Holland]引起的煙草細菌性角斑病是世界煙草生產上普遍發生且危害嚴重的2種細菌病害，給煙草種植造成了嚴重損失（張廣民等，2002）。2020年，福建省政和縣種植的云煙87發生疑似煙草野火病，罹病煙株葉片出現單一或連片分布的圓形或不規則形褐色病斑，病斑周圍有黃色暈圈。該病發生面積約20 ha，其中5.7 ha重度發生，發病率62%～87%，給當地煙農造成嚴重的經濟損失。因此，明確其病因，可為該病害的精準防控提供理論依據。【前人研究進展】煙草野火病和角斑病主要分布于亞洲、非洲、歐洲及南美洲的煙葉主產區。據報道，這2種煙草細菌性病害在我國山東、遼寧、河南、安徽、四川、貴州、湖南、云南和黑龍江等省均有發生為害（王振國，2012;臺蓮梅等，2014;張萌，2016;陳燾等，2018），而這2種病害在田間常混合發生，癥狀易混淆。據報道，煙草野火病菌能產生特殊的氨基酸（野火毒素），病斑周圍產生典型的黃色暈圈，而角斑病菌不能產生野火毒素，病斑不產生黃色暈圈（張萌，2016）;另據報道，煙草野火病菌與煙草角斑病菌對煙草品種、煙苗齡期及葉位的敏感不同，如野火病菌易侵染煙苗前期（42 d）的下部葉片，而角斑病菌易侵染煙苗中后期（84 d）的上部葉片。此外，野火病菌侵染對氣候因素如溫度、氣壓、紫外線等比角斑病菌敏感，因此認為這2種病害的病原菌屬于不同的致病變型（Deall and Cole，1986）;但隋原（2011）研究發現，61株來自吉林和黑龍江省主要產煙區的野火病菌菌株在侵染不同品種煙草時的潛育期、病斑大小、單株病斑數和病情指數存在一定差異，對這些菌株的DNA聚類分析顯示，親緣關系的遠近與致病性間無明顯相關性。程璐（2018）采用傳統的生物學特征結合分子生物學方法將遼寧阜新地區煙草角斑病的病原菌鑒定為P. syringae pv. tabaci FX分離株，對分離株的全基因組進行測序，并將其序列與Wang等（2015）在NCBI上登錄的分離自四川越西縣的煙草野火病菌菌株yuexi-1的全基因組序列進行分析比對，結果顯示，這2株菌株有423個不同的毒力基因，推斷毒力因子的區別可能是導致二者在煙草上致病所表現的癥狀不同的原因。而陳瑞朋（2018）利用全基因組比對的手段分別獲得煙草野火病菌和角斑病菌的LAMP特異性檢測引物，建立了煙草野火病和角斑病病原的LAMP快速檢測方法，可對這2種病害進行田間快速診斷。但也有研究發現，煙草野火病菌經連續培養后會變異成產毒較弱或不產毒素的菌株，接種后病斑周圍黃色暈圈較弱或不產生黃色暈圈，因此認為野火病菌是角斑病菌一個產生暈圈的菌系，即兩者是屬于同一種病菌不同的菌系（張廣民等，2002;姜新等，2007）。【本研究切入點】2020年，福建省政和縣種植的云煙87發生疑似煙草野火病，但至今未見該病害在福建省煙區為害狀的詳細描述及其病原物系統鑒定的研究報道。【擬解決的關鍵問題】對罹病煙葉采用常規方法進行病原菌分離純化，對分離獲得的細菌菌株通過柯赫氏法則驗證其致病性，并采用生物學特征、生理生化反應及特異性引物檢測、16S rDNA序列分析等明確其分類地位，為明確福建省政和縣煙草細菌性葉斑病的發病規律并制定有效的防控措施提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試樣品 采自福建省政和縣楊源鄉種植的帶有不規則褐色病斑的云煙87病葉，用于病原菌分離。

1. 1. 2 供試培養基 營養瓊脂培養基（NA）、營養肉湯培養基（NB）（不加瓊脂的NA培養基）、金氏B培養基（KB）、明膠水解培養基、蔗糖還原培養基、葡萄糖培養基和碳素化合物基本培養基，以上培養基配方均參照方中達（1998）的方法，121 ℃滅菌20 min，備用。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 細菌分離與純化 采用平板劃線分離法，參照方中達（1998）的方法。

1. 2. 2 細菌培養 將1.2.1純化的細菌菌株接種到NA培養基上培養24～48 h，挑取單菌落接種至NB培養基中，28 ℃下180 r/min振蕩培養24 h后備用。

1. 2. 3 煙苗培育 將云煙87種子點播至育苗盤內，長至3片真葉時移栽至AB150型花盆內，長至5片真葉時備用。

1. 2. 4 菌落形態觀察 將分離獲得的細菌菌株接種到NA培養基上，28 ℃恒溫培養箱中培養1～5 d，觀察并記錄菌落的顏色和形態特征。

1. 2. 5 致病性測定 采用注射接種法和噴霧接種法。注射接種法：將分離菌株的懸浮液（濃度約為1.0×108 CFU/mL）注射接種至云煙87葉片的細胞間，以細胞間充滿細菌懸浮液為準，每株菌株接種3片煙草葉片，3次重復，接種后24 h開始觀察，記錄發病情況;噴霧接種法：將分離菌株的懸浮液（濃度約為1.0×108 CFU/mL）噴霧接種至云煙87，每株菌株接種6株煙苗，3次重復，以葉片正、反面噴濕為準，接種后保濕24 h，第2 d開始觀察，記錄發病情況。上述接種均以無菌水接種作對照，接種發病后再分離病原菌。

1. 2. 6 革蘭氏染色 采用結晶紫草酸銨染色法，參照方中達（1998）的方法進行。

1. 2. 7 電鏡觀察 采用磷鎢酸負染法，于透射電子顯微鏡（Hitachi HC-1）下觀察。

1. 2. 8 生理生化測定 分離菌株在KB培養基上是否有綠色熒光、對碳素化合物（甘露醇、海藻糖、阿拉伯糖和山梨醇）的利用、明膠水解、果聚糖的產生、在38 ℃下的生長情況等的測定和觀察，參照方中達（1998）的方法。

1. 2. 9 Biolog測定 采用Gen III Microstation biolog自動微生物鑒定系統進行鑒定。

1. 2. 10 分子生物學鑒定 采用菌落PCR法。分別挑取分離菌株的單菌落，放入裝有20 μL ddH2O的離心管中，于沸水中水浴10 min，制備DNA模板，供后續PCR擴增。煙草野火病菌特異性引物40429F/40429R（5'-CGTGCGGGGCTTTTTGTTGTC-3'/5'-T TAGCGGGTTTTGGTTTGCG-3'）檢測，參照陳瑞朋等（2018）的方法;煙草野火病菌和煙草角斑病菌多重PCR引物TabB1F/TabB1R（5'-ATTGAAGAAGCG TTCGAGCG-3'/5'-GTTTCGGGTCGGCACGATTG-3'）檢測及煙草角斑病菌特異性引物2F2/2R2（5'-CA AACCAGCTGAAAACAAAC-3'/5'-ATGGGGGTGA TTCTCAATCG-3'）檢測，參照張萌（2016）的方法;細菌16S rDNA基因擴增通用引物27F/1492R（5'-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3'/5'-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3'）檢測，參照Lane（1991）的方法;對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶正確的送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行核苷酸序列測定，測序結果在NCBI上在線比對，并運用MEGA 7.0的鄰接法基于16S rDNA構建分離菌株的系統發育進化樹。

2 結果與分析

2. 1 病害癥狀

調查結果（圖1）顯示，煙草細菌性葉斑病在田間蔓延速度快，主要為害葉片，初期受害部位為水漬狀圓形或不規則小斑點，后斑點逐漸擴大，中心變成褐色，周圍有明顯的黃色暈環，病斑直徑1～3 mm，隨后病斑逐漸擴展，合并成不規則形的黃褐色斑，病情嚴重的葉片不規則形病斑連成一片，葉片枯死。切取病健交界處在光學顯微鏡下觀察，可見溢菌現象。

2. 2 病原菌的分離與純化

采用常規分離法從病葉上分離純化獲得15株細菌菌株，編號為Yan1～Yan15。15株菌株在NA培養基上的菌落形態特征相似，培養1～2 d的菌落為白色隆起，邊緣不規則且菌落黏稠（圖2-A），培養3～4 d后，菌落分泌黏性物質增加，逐漸圓潤，菌落邊緣呈透明狀，中間呈淡黃色（圖2-B）。

2. 3 致病性測定結果

將2.2分離純化的15株細菌菌株（Yan1～Yan15）進行煙草致病性測定，結果顯示，注射接種煙草細胞后24 h未出現枯斑反應，接種點周圍出現明顯的褪綠暈圈，接種2～3 d后，接種點周圍出現壞死枯斑;噴霧接種3 d后，葉片出現水漬狀斑點，隨后病斑逐漸擴大，褐變，邊緣出現褪綠暈圈，與田間癥狀高度相似。分離接種發病的病斑，獲得的菌株菌落形態特征與接種的菌株相同，經柯赫氏法則驗證，15株分離菌株均為煙草細菌性葉斑病的病原菌。將15株菌株分別轉接至NB液體培養基中培養24 h后，懸浮于終濃度為40%甘油溶液中，-80 ℃冰箱保存備用。

2. 4 細菌鑒定結果

2. 4. 1 細菌形態特征 菌株Yan1～Yan15的菌體呈短桿狀，細胞大小約1.50 mm′0.75 mm，極生4根鞭毛，鞭毛長約4～5 mm（圖3），革蘭氏染色陰性。

2. 4. 2 生理生化測定結果 菌株Yan1～Yan15均可利用甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖，不能利用海藻糖;果聚糖產生和明膠液化測定結果為陽性;KB培養基上生長的菌落在紫外線下發出綠色熒光，38 ℃下不能生長。

2. 4. 3 Biolog測定結果 從2.4.2的測定結果可知，菌株Yan1～Yan15的生理生化指標均表現一致，隨機挑選菌株Yan3、Yan5、Yan9和Yan15進行71種碳源的利用性及23種化學敏感性測試，培育48 h后經Microlog軟件讀數，結果（表1）顯示4株菌株與數據庫中P. syringae pv. tabaci（同物異名：P. amygdali pv. tabaci）的相似度最高。

2. 4. 4 細菌菌株的特異性引物檢測 對菌株Yan1～Yan15進行煙草野火病菌和煙草角斑病菌PCR特異性引物擴增，結果顯示，用煙草野火病菌特異性引物40429F/40429R進行PCR擴增，15株細菌菌株均能擴增獲得大小約203 bp單一的特異性條帶（圖4-A）;用煙草野火病菌和煙草角斑病菌多重PCR引物TabB1F/TabB1R進行擴增，15株細菌菌株均能擴增獲得大小分別為708和389 bp的2條特異性條帶（圖4-B），而使用煙草角斑病菌的特異性引物2F2/2R2進行PCR擴增，供試15株細菌菌株均未擴增到目的條帶，說明分離獲得的菌株為煙草野火病菌。

2. 4. 5 細菌菌株16S rDNA基因鑒定結果 從2.4.4的測定結果可知，菌株Yan1～Yan15的特異性引物檢測結果均表現一致，隨機挑選4株菌株（Yan3、Yan5、Yan9和Yan15）進行16S rDNA基因鑒定。用細菌16S rDNA通用引物27F/1492R對4株菌株進行PCR擴增后測序，測序結果在NCBI上在線比對，結果表明，4株菌株與扁桃假單胞菌煙草致病變種（P. amygdali pv. tabaci）、扁桃假單胞菌流淚致病變種（P. amygdali pv. lachrymans）、丁香假單胞菌丁香致病變種（P. syringae pv. syringae）、薩氏假單胞菌（P. savastanoi）和凍結假單胞菌（P. congelans）相應序列的同源性最高，達99.0%以上。利用MEGA 7.0，以短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）為外群，采用鄰接法構建系統發育進化樹，結果（圖5）顯示，4株菌株均與扁桃假單胞菌煙草致病變種聚為一支。

3 討論

煙草野火病在烤煙上普遍發生，給煙草種植業造成嚴重的經濟損失。本研究從福建省政和縣罹病的煙葉中分離到15株細菌菌株，根據柯赫氏法則證明15株細菌菌株均為煙草細菌性葉斑病病原菌，結合形態學、生理生化等傳統的生物學特征以及特異性引物40429F/40429R和16S rDNA基因序列等分子生物學分析比對，將15株細菌菌株鑒定為扁桃假單胞菌煙草致病變種，與在我國云南和湖南等地報道的煙草野火病病原菌相同（劉雅婷等，2002;陳燾，2017）。已有研究表明，野火病菌在不同的烤煙品種上致病力存在差異，可劃分為不同的生理小種（黃杏娥等，2007;孫劍萍等，2011;唐明等，2016;林凡力，2019）。本研究分離的15株野火病菌菌株對云煙87的致病力無明顯差異，但對福建省其他烤煙品種的致病力是否存在差異，即福建煙區煙草野火病菌是否存在生理小種分化現象，有待進一步探究。

通常認為煙草野火病的初侵染源主要是田間越冬的病殘體或帶菌種子。林滋鑾等（1995）對福建省煙草侵染性病害的調查發現，煙草野火病在福建省武平、上杭、云霄、連城、清流和寧化等地有零星分布，但尚未見該病在政和縣發生為害的報道，也未見對福建省煙草野火病的病原物進行系統鑒定的研究報道。2020年政和縣煙草野火病發生突然，病源從何而來有待研究和分析。該病菌寄主范圍廣（Knoche et al.，1994;Kang et al.，2015），其在田間的發生和蔓延與煙草的生育期等有關（Deall et al.，1986），烤煙生長季節，病菌是否無癥狀寄生于某種作物或雜草亟待摸清。Joung等（2017）報道土壤中的細菌可在雨后形成氣溶膠，隨風遠距離傳播;而Ali等（2020）報道黃瓜細菌性角斑病菌（P. amygdali pv. lachrymans）在設施環境中可隨氣溶膠快速傳播;另外，國內煙草品種對煙草野火病菌大都表現不抗病或抗性較低（朱賢朝等，2002），其中，云煙87對煙草野火病菌敏感（黃杏娥等，2007），這可能是2020年政和縣云煙87煙草野火病發病重、傳播速度快、危害面廣的重要原因。

4 結論

本研究首次鑒定并報道了福建省政和縣煙草野火病的致病菌為扁桃假單胞菌煙草致病變種，為該病害的防控提供依據。由于云煙87抗性弱，病菌致病力強，煙草野火病蔓延速度快，造成的損失大，因此，應加強病害監測，做好綜合防治。

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收稿日期：2021-06-28

基金項目：國家重點研發計劃項目（2017YFD0201106-02）;中國煙草總公司福建省公司科技計劃項目（KH1702210）

通訊作者：顧鋼（1965-），https：//orcid.org/0000-0003-2347-7912，高級農藝師，主要從事烤煙病蟲害綜合防治研究工作，E-mail： gugang318@163.com;蔡學清（1971-），https：//orcid.org/0000-0002-1900-0540，博士，教授，主要從事植物病原細菌研究工作，E-mail： caixq90@163.com

第一作者： 林可竟（1999-），https：//orcid.org/0000-0002-9269-8930，研究方向為植物病理學，E-mail： lkj6166@126.com