二代測序技術在東南亞缺失型α珠蛋白生成障礙性貧血夫婦胚胎植入前遺傳學檢測中的應用

何天文，周偉寧，盧 建，李靜姝，陳創奇，董云巧，杜 麗，尹愛華△

廣東省婦幼保健院：1.醫學遺傳中心；2.廣東省婦幼代謝與遺傳病重點實驗室；3.生殖中心，廣東廣州 511443

珠蛋白生成障礙性貧血(以下簡稱“地貧”)主要分為α地貧和β地貧兩種類型[1]。α地貧發病機制主要是α珠蛋白基因的缺失，在我國主要分布于廣東、廣西和海南等南方地區，以東南亞缺失型α地貧(――SEA/αα)最為常見[2-4]。如果夫妻雙方為東南亞缺失型α地貧，每次妊娠胎兒均有25%的可能性為重型α地貧，又稱巴氏水腫胎。巴氏水腫胎無法存活，還嚴重危害母體健康，同時給家庭與社會帶來沉重負擔[5]。產前診斷和胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)是預防重度地貧患兒出生的重要措施。近年來隨著二代測序(NGS)技術的飛速發展,基因測序成本不斷降低，臨床應用領域不斷擴大。目前NGS已經成為PGT的主要檢測手段之一[6-7]。本研究采用NGS技術對胚胎――SEA區域直接測序和構建胚胎單核苷酸多態性(SNP)單體型連鎖分析對東南亞缺失型α地貧夫婦進行PGT，以避免重型α地貧胎兒的形成。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取1對2017年12月于廣東省婦幼保健院就診的東南亞缺失型α地貧不孕不育夫婦。為了尋求輔助生殖和避免重型α地貧胎兒的形成，這對夫婦要求行第三代試管嬰兒治療。這對夫婦中，男方34歲，為東南亞缺失型α地貧，基因型為――SEA/αα；女方26歲，為東南亞缺失型α地貧，基因型為――SEA/αα，2013年結婚至今未孕，超聲提示左側卵巢有個大小為78 mm×55 mm的囊腫，囊腫破壞毗鄰的卵巢組織的卵泡結構導致卵巢儲備功能下降。向該夫婦充分介紹第三代試管嬰兒治療過程及相關風險后，該夫婦簽署知情同意書并接受PGT。本研究經廣東省婦幼保健院生殖醫學倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 廣州米基科技發展有限公司的磁珠法血液基因組提取試劑盒、胚胎植入前單基因病檢測建庫試劑盒、胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒(北京中儀康衛醫療器械有限公司)，PCR-流式熒光雜交法地貧基因檢測試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司)，Verity梯度PCR儀、ABI3730測序儀(美國ABI公司)、MiSeq高通量測序儀(美國Illumina公司)、MAGPIX液相芯片分析儀(德國Luminex公司)、全基因組擴增試劑盒(德國Qiagen公司)。

1.3方法

1.3.1夫婦及雙方父母地貧基因檢測 抽取夫婦及雙方父母外周血各2 mL(EDTA抗凝)，使用血液基因組提取試劑盒進行外周血基因組DNA的提取，嚴格按照試劑盒說明書進行基因組DNA提取操作。使用PCR-流式熒光雜交法地貧檢測試劑盒檢測夫婦及雙方父母的地貧基因，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2家系成員SNP單體型的構建 以――SEA區域[HBA2基因(NM_000517.4)、HBA1基因(NM_000558.4) chr16:215400-234700正向轉錄]為目標區域，在――SEA區域的上游234 kb區域內選擇143個高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳標記，下游2 Mb區域選擇100個作為遺傳標記。利用Ion AmpliSeq Designer網站設計引物，對――SEA區域和高密度緊密連鎖的SNP進行多重PCR擴增，多重PCR產物經純化和建庫進行NGS，選擇有效SNP位點對構建家系成員的單體型進行連鎖分析，確定夫婦是否攜帶有致病風險的染色體。

1.3.3植入前遺傳學診斷 采用卵細胞質內單精子注射(ICSI)方式進行授精。胚胎發育第3天時用激光脈沖在透明帶上切割一裂口，將胚胎轉移至囊胚培養液中繼續培養。胚胎發育第5、6天時觀察到囊胚形成且脫出裂口滋養層細胞數在5～10個時進行活檢。對活檢獲得的囊胚滋養層細胞采用全基因組擴增試劑盒進行胚胎細胞全基因組擴增(WGA)。全基因組擴增成功的產物通過多重PCR擴增――SEA區域[HBA2基因(NM_000517.4)、HBA1基因(NM_000558.4) chr16:215400-234700正向轉錄]和高密度緊密連鎖的SNP，多重PCR產物經純化和建庫后進行NGS。通過Sanger測序驗證――SEA區域NGS結果。對正常和東南亞缺失型α地貧的胚胎進行了低深度的染色體非整倍性篩查，以排除有攜帶染色體拷貝數異常的胚胎。

1.3.4產前診斷 選擇正常且發育良好的整倍體胚胎于凍融胚胎周期進行移植。于胚胎移植后14 d檢測血人絨毛膜促性腺激素(HCG)以確定是否妊娠，于胚胎移植后4周行經陰道B超確定是否臨床妊娠，于孕18～24周時行羊膜腔穿刺進行染色體核型分型和α地貧基因產前檢測來驗證PGT結果。

2 結 果

2.1夫婦及雙方父母地貧基因檢測結果 提取外周血基因組DNA后，采用PCR-流式熒光雜交法對夫婦及雙方父母的地貧基因進行檢測，男方的――SEA來源于父親，女方的――SEA來源于母親，見表1。

表1 夫婦及雙方父母地貧基因檢測結果

2.2家系成員SNP單體型的構建 多重PCR擴增――SEA區域和高密度緊密連鎖的SNP后，經過NGS后，選擇了106個有效SNP位點成功構建了家系成員SNP單倍型，連鎖分析后確定夫婦致病的風險染色體，見表2。

表2 夫婦α珠蛋白基因有效SNP位點數和分布(n)

2.3植入前遺傳學診斷 獲卵28個，其中成熟卵子23個，予以ICSI后得到正常受精卵20個。所有正常受精卵均發生卵裂，第5天觀察有7枚囊胚符合活檢標準，活檢后進行胚胎玻璃化冷凍保存，活檢產物標記為D501、D502、D503、D504、D505、D506和D507；第6天觀察有6枚囊胚符合活檢標準，活檢產物標記為D601、D602、D603、D604、D605和D606，每個樣本活檢細胞數為5～10個。對活檢獲得的囊胚滋養層細胞進行全基因組擴增，13個囊胚中12個全基因組擴增成功，其中D504標本全基因組擴增失敗。對全基因組擴增成功的標本進行多重PCR擴增――SEA區域和高密度緊密連鎖的SNP，產物純化、建庫后行NGS。對胚胎――SEA區域直接測序和構建胚胎SNP單體型連鎖分析，結果顯示12個囊胚中4個為正常(αα/αα)，7個為東南亞缺失型α地貧(――SEA/αα)，1個為重型α地貧(――SEA/――SEA)。利用Sanger測序進行進一步驗證，結果與NGS結果一致，見表3。11個正常和東南亞缺失型α地貧囊胚中有8個為整倍體，3個為非整倍體，見表4。

2.4產前診斷 選擇正常和發育良好的整倍體胚胎(D506)于女方的第3個月經周期進行囊胚解凍移植。移植后14 d檢測外周血HCG為594.4 mIU/mL；移植后40 d經陰道超聲見單個孕囊，孕囊大小18～11 mm，胚芽長約3 mm，可見心管搏動。孕19周經羊膜腔穿刺進行產前診斷的結果顯示胎兒地貧基因型為αα/αα，胎兒染色體G顯帶核型沒有發現異常，與PGT結果一致。足月順產分娩一男嬰，健康狀況良好。

3 討 論

地貧是全球分布最廣、累積人群最多的一種單基因病，主要分布于熱帶和亞熱帶地區，其中α地貧主要分布于東南亞、中國南方和少數非洲地區[8]。我國廣西與廣東兩地做過大樣本、轄區全覆蓋的地貧分子流行病學調查，其中廣西壯族自治區流調數據顯示廣西α地貧基因攜帶率為17.55 %，東南亞缺失型α地貧攜帶率為7.85%[9]，而廣東省的流調數據顯示廣東省α地貧基因攜帶率為13.31 %，其中東南亞缺失型α地貧攜帶率為6.85%，夫妻為同型地貧的攜帶率為1.87%[10]。如果夫妻雙方為東南亞缺失型α地貧，每次妊娠均有25%的可能性為重型α地貧，又稱巴氏水腫胎。巴氏水腫胎可導致孕婦各種并發癥的發生，如妊娠高血壓和產后大出血等，危及孕婦的生命。重型地貧具有致死致殘性，且治療費用高昂，通過產前診斷和胚胎植入前遺傳學診斷可以預防重度地貧患兒的出生[11-13]。絨毛穿刺術、羊膜腔穿刺術和臍帶穿刺術等傳統產前診斷技術不但具有有創性，而且具有一定的導致孕婦流產的風險。東南亞缺失型α地貧夫婦經產前診斷確診胎兒為重型地貧后，需要選擇終止妊娠，對孕婦本人及其家庭也造成了一定的生理和心理負擔。PGT是在胚胎植入前對胚胎染色體及遺傳致病基因進行檢測，選擇正常的胚胎植入到宮腔內，最終實現減少出生缺陷發生的目的[14-15]。對東南亞缺失型α地貧夫婦進行PGT，在胚胎植入前進行遺傳學分析后選擇正常胚胎進行移植，可以避免異常胚胎妊娠的發生，可以阻斷東南亞缺失型α地貧在家系中的再發風險。PGT把遺傳病檢測提前到孕前，將遺傳病的預防提前到胚胎階段，與傳統的產前診斷相比具有明顯的優勢，可以避免治療性引產給母體帶來身體和心理的創傷。本研究采用NGS對胚胎――SEA區域直接測序和構建胚胎SNP單體型連鎖分析進行PGT，Sanger測序驗證――SEA區域NGS結果，對正常和東南亞缺失型α地貧的胚胎進行了低深度的染色體非整倍性篩查。本研究為該東南亞缺失型α地貧夫婦選擇正常和發育良好的整倍體胚胎，移植后女方成功妊娠，足月順產分娩一正常嬰兒。

全基因組擴增技術的發明克服了單細胞水平基因檢測DNA模板量過少的問題，極大地提高了檢測結果的準確性以及單細胞水平基因檢測的可靠度，但是WGA會增加擴增不均勻或等位基因脫扣的風險[16]。NGS技術的發明，實現了一次性對上百萬條DNA進行測序，不僅縮短了檢測時間，也將單堿基測序成本降至最低，使遺傳性疾病的診斷率和分辨率邁入新的高度，給PGT技術帶來了革命性的改變。NGS技術具有高通量、高并行性和高分辨率等特性，NGS技術可以提供高深度的多位點多基因分析，結合致病基因連鎖SNP，可以避免由等位基因漏碼(ADO)帶來的檢測錯誤[17]。NGS已經成為PGT的主要的檢測手段,不但能檢測染色體非整倍性、染色體結構異常和單基因遺傳病,而且準確性好和精度高[18-19]，與如熒光原位雜交和比較基因組雜交等傳統的PGT技術相比具有明顯的優勢。選擇――SEA區域為目標區域，在其上下游2 Mb區域內選擇高密度緊密連鎖的SNP位點作為遺傳連鎖標記，多重PCR和NGS后選擇106個有效SNP位點構建家系成員SNP單體型，可很大程度上減少因重組或擴增脫扣導致的檢測不完全。

本研究采用NGS技術對胚胎――SEA缺失區域直接測序和構建胚胎SNP單體型連鎖分析對東南亞缺失型α地貧夫婦進行PGT，避免了重型α地貧胎兒的形成和選擇非整倍體胚胎而導致的流產問題，是重型α地貧的有效預防手段。